Name: genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish
Uploaded: 2020-01-28T12:00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il personale dei servizi biomedici di Oxford e Birmingham per l'eccellente allevamento di pesci zebra. T.D. è stato finanziato da una borsa di studio Wellcome Cromosoma e Biologia dello Sviluppo (#WT102345 / 13 / s). R.M. e M.K. sono stati finanziati dalla British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) e sono grati per il loro generoso sostegno. R.M. riconosce il sostegno del BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono regolate dalla legge sugli animali (procedure scientifiche) del 1986 e sono state approvate dal Comitato interno e dall'ente locale per il benessere degli animali e l'etiche di revisione.
1. Immagine embrioni macchiati ISH
<ol><li>Preparare una soluzione glicerolo (50%-80% nel buffer 1x PBS) e mescolare per omogeneizzare la soluzione (ad esempio, lasciare in un rullo per almeno 5 min). Questa soluzione può essere conservata per mesi a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo l'ibridazione in situ14,15,16,17, trasferire gli embrioni alla soluzione glicerolo con una pipetta Pasteur da 3 mL e lasciare riposare per almeno 5 min. Se si immaginano embrioni di età superiore ai 24 cv (ore dopo la fecondazione), essi possono essere sbiancati come descritto18.<ol>
<li>Preparare ed etichettare abbastanza tubi PCR per trasferire embrioni macchiati di ISH dopo l'imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere il glicerolo al 100% sul fondo del pozzo in uno scivolo di depressione di vetro con una pipetta Pasteur da 3 mL.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur da 3 mL, trasferire un singolo embrione macchiato DI ISH allo scivolo di vetro e orientarsi come richiesto sotto uno stereomicroscopio dotato di una fotocamera digitale e illuminazione inferiore e superiore. NOTA: Utilizzare punte pipette di carico gel per posizionare gli embrioni per l'imaging, ma altri strumenti (ad esempio, pinze, assi dissecinti) saranno ugualmente adeguati.</li>
	<li>Utilizzando il primo embrione, regolare l'illuminazione e il tempo di esposizione al ingrandimento desiderato. Utilizzare queste condizioni per TUTTI gli embrioni nello stesso esperimento (ad esempio, se l'imaging di 40 embrioni da un'incross mutante eterozigoma, assicurarsi che l'illuminazione, il tempo di esposizione e l'ingrandimento siano gli stessi per tutti).</li>
	<li>Immagine di tutti gli embrioni necessari. Etichetta ogni immagine con un numero univoco. Dopo l'imaging, trasferire l'embrione su un tubo/piastra PCR etichettato con lo stesso numero. NOTA: le immagini devono essere salvate come file TIF, ma anche altri formati sono adeguati.<ol>
<li>Se necessario, rimuovere il glicerolo in eccesso nei tubi/piastre PCR. NOTA: A questo punto, gli embrioni possono essere conservati nei tubi PCR per diverse settimane a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Estrarre il DNA e genotipo gli embrioni macchiati di ISH
NOTA: Qui, utilizzare un metodo affidabile ed economico per isolare il DNA genomico basato sul metodo HoTSHOT19 con un'efficienza di estrazione del DNA del 95%-100%3.
<ol><li>Una volta completata l'imaging, aggiungere 40-75 l di tampone di lisi alcalinea (ad esempio, HoTSHOT) ad ogni tubo.</li>
	<li>Incubare a 95 gradi centigradi per circa 30 min e raffreddare i tubi a 4 gradi centigradi prima di aggiungere un volume uguale di buffer di neutralizzazione. Un'incubazione notturna a 4 gradi centigradi può migliorare l'efficienza della PCR. NOTA: A questo punto, il DNA genomico può essere utilizzato per la genotipizzazione o conservato a -20 gradi centigradi fino a quando non è necessario.</li>
	<li>Campioni genotipi con un metodo appropriato (ad esempio, HRMA, RFLP)3,20,21 come richiesto per la mutazione degli interessi.</li>
	<li>Si noti il genotipo corrispondente a ogni campione (ad esempio, utilizzando un foglio di calcolo software).</li>
</ol>3. Quantificare l'intensità dei pixel degli embrioni macchiati di ESTIS (analisi delle immagini mediante il software Fiji)
<ol><li>Per quantificare l'intensità del segnale di colorazione dell'ibridazione in situ (ISH), convertire tutte le immagini in scala di grigi a 8 bit come descritto3. Se le immagini sono state salvate come . TIF, utilizzare una macro Fiji per la conversione batch3. In alternativa, convertire le immagini in altri formati (ad esempio, . JPG) a . TIF utilizzando il software appropriato e quindi convertire in scala di grigi a 8 bit utilizzando Fiji. Per comodità, ecco la procedura passo-passo che è stata pubblicata in precedenza3, con alcune modifiche.</li>
	<li>Aprite le immagini in Figi e invertete l'immagine con Modifica > Inverti. Quindi modificare il tipo di immagine a 8 bit (Immagine > Tipo > 8 bit).</li>
	<li>Utilizzando lo strumento di selezione poligono, disegnare manualmente l'area di interesse (ROI) sull'immagine intorno alla regione contenente il segnale.</li>
	<li>Premere t per aprire Gestione ROI. Utilizzare il comando Misura di Gestione ROI per misurare l'intensità del ROI. Copiare il valore medio dalla finestra Risultati in un software per fogli di calcolo.</li>
	<li>Spostare lo stesso ROI, garantendo le stesse dimensioni e la stessa forma della regione originale, in una regione del pesce zebra che non contiene alcuna colorazione. Ripetere il passaggio 3.4 per misurare lo sfondo.</li>
	<li>Per ottenere l'intensità media dei pixel del segnale ISH, sottrarre il valore medio di intensità della regione di fondo da quello della regione macchiata per ogni embrione.</li>
	<li>Assegnare ogni valore di intensità a un genotipo (dal punto 2.3).</li>
</ol>4. Analizzare i risultati con test statistici appropriati
<ol><li>Tracciare tutti i valori in un grafico Q-Q per identificare eventuali deviazioni dalla distribuzione normale. NOTA: La distribuzione normale può essere verificata anche con il test Kolmogorov-Smirnov o il test Shapiro-Wilk. Tuttavia, per i campioni di grandi dimensioni c'è un alto rischio di falsi positivi in questi test.</li>
	<li>Se ci sono forti deviazioni dalla distribuzione normale, trasformare tutti i valori (utilizzando le funzioni ln o sqrt) per assicurarsi che siano normalmente distribuiti prima di procedere.</li>
	<li>Analizzare le differenze tra i valori (trasformati se necessario) assegnati a ciascun genotipo (wt vs. heterozygote vs. mutante) con ANOVA a due code con livelli di confidenza del 95%, tenendo conto dell'uguaglianza delle varianze con un test di Levene e una correzione di Welch. Per i confronti a coppie tra ogni coppia di genotipi, utilizzare il test post-hoc di Tukey (variazioni uguali) o Games-Howell (variazioni diverse).<ol>
<li>Se i valori non sono normalmente distribuiti nonostante la trasformazione, utilizzare un test non parametrico (Kruskall-Wallis) per analizzare le differenze tra i valori classificati e un test di confronto multiplo post-hoc Dunn con correzione Bonferroni per pairwise Confronti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tracciare i valori non trasformati (dal punto 3.6) come grafici a punti per la migliore rappresentazione dei risultati.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Varshney, G. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+hematopoiesis+by+DNA+methylation.">Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation.</a> Elife. 5, e11813 (2016).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Gain+of+RTK+Signalling+Uncovers+Selective+Cell+Vulnerability+during+Embryogenesis.">Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).</li><li>Wen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA5+SUMOylation+is+indispensable+for+zebrafish+cardiac+development.">GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).</li><li>Espin-Palazon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence.">Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence.</a> Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).</li><li>Genthe, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+is+required+for+zebrafish+blood+and+vessel+development+and+expression+of+a+human+RUNX1-CBF2T1+transgene+advances+a+model+for+studies+of+leukemogenesis.">Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis.</a> Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).</li><li>Butko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata2b+is+a+restricted+early+regulator+of+hemogenic+endothelium+in+the+zebrafish+embryo.">Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo.</a> Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lleras Forero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+of+the+zebrafish+axial+skeleton+relies+on+notochord+sheath+cells+and+not+on+the+segmentation+clock.">Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Jowett, T., Yan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+in+situ+hybridization+to+zebrafish+embryos.">Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos.</a> Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Narayanan, R., Oates, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).</li><li>Meier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+partners+of+Ldb1+are+required+for+haematopoietic+development.">Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development.</a> Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Leung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+VEGFA+functions+in+arteriogenesis+and+hematopoietic+stem+cell+specification.">Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification.</a> Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Quando si utilizza questo metodo per quantificare l'espressione genica, è necessario considerare alcuni fattori. Le condizioni di imaging devono essere mantenute per tutta la durata dell'esperimento (ad esempio illuminazione, tempi di esposizione e posizionamento degli embrioni) per ridurre la variabilità tra le misurazioni. Un punto critico è quello di evitare di sovrastarsi ai campioni, poiché le differenze di colorazione tra i campioni possono essere mascherate. Ad esempio, la diminuzione dell'espressione VegfA in assenza di Eto2 negli embrioni di Xenopus laevis 30 potrebbe essere rilevata solo monitorando attentamente la colorazione in un periodo di 24 ore. Pertanto, è buona norma determinare empiricamente adeguati livelli di colorazione per ogni gene che meglio rappresentano la sua espressione, senza raggiungere la saturazione. L'overstatura aumenterà anche artificialmente l'intensità dei pixel di sfondo nelle immagini in scala di grigi a 8 bit convertite e distorcerà i risultati della quantificazione. In casi estremi, il livello di fondo nei tessuti embrionali potrebbe essere superiore al segnale ISH nel ROI selezionato e questi campioni dovrebbero essere esclusi dall'analisi. Un fenomeno simile è stato osservato quando abbiamo testato l'idoneità del tuorlo incontaminato per la correzione dello sfondo (Figura 4). Dopo l'inversione e la conversione a 8 bit, i pixel più scuri nella regione del tuorlo diventano più luminosi del segnale ISH nell'embrione e rendono negativi i valori corretti dello sfondo. Pertanto, evitare l'uso del tuorlo per la correzione dello sfondo. La misurazione del segnale di fondo nelle aree pigmentate dell'embrione (ad esempio, gli occhi o la parte dorsale del tronco da 26/28 hpf in poi) distorcerà ugualmente i risultati della quantificazione e dovrebbe anche essere evitata. Sono disponibili protocolli per sbiancare gli embrioni di pesce zebra, prima o dopo l'ISH18 e per sbiancare gli embrioni di età superiore ai 24 cv prima dell'imaging.
Poiché questo metodo si basa sulla misurazione dell'intensità dei pixel in un'area definita rispetto a un'intensità di pixel di sfondo in un'area equivalente non colorata, non è appropriato per la quantificazione di geni onnipresenti o quasi espressi tra loro. Invece, è adatto per misurare l'espressione di geni con una distribuzione spazialmente limitata in cui un'area per misurare l'intensità dei pixel di sfondo può essere facilmente identificata. La nostra ulteriore analisi suggerisce ora che l'utilizzo di un'area più piccola (3-4 volte più piccola) per la correzione dei background produce risultati simili all'utilizzo di un'area equivalente a quella del ROI. Ciò estende l'applicabilità del metodo ai geni espressi in domini spaziali più ampi (e quindi che richiedono ROI più grandi per le misurazioni di intensità), purché si possano utilizzare aree chiaramente non colorate dell'embrione per la correzione dello sfondo.
Infine, suggeriamo che la genotipizzazione venga eseguita in parallelo o dopo la quantificazione dell'immagine per ridurre al minimo la distorsione dello sperimentatore. Chiedere a un secondo sperimentatore di ripetere la quantificazione su campioni anonimizzati e confrontare con la prima serie di misurazioni aiuterà anche a ridurre la distorsione dello sperimentatore. Se le immagini da quantificare provengono da un confronto tra trattamenti che non richiedono la genotipizzazione (ad esempio, tipo selvaggio vs inibitore chimico o tipo selvaggio contro KNOCKdown MO), lo sperimentatore che esegue le misurazioni deve essere accecato all'identità del Esempio.

L'introduzione di tecnologie di editing del genoma (FN, TALENs e, più recentemente, CRISPR/Cas9) ha portato ad un massiccio aumento del numero di laboratori in tutto il mondo che si utilizzano di questi sistemi per studiare la funzione di specifici geni in vivo. Il pesce zebra, in particolare, è suscettibile di manipolazione genetica e molti mutanti sono stati generati negli ultimi1,2. Per i biologi dello sviluppo, uno dei metodi più comuni per valutare le conseguenze fenotipiche delle mutazioni genetiche nello sviluppo embrionale è l'ibridazione in situ (ISH). In assenza di evidenti difetti morfologici che separano i mutanti omozici dal loro tipo selvaggio o dai loro fratelli eterozici, è essenziale essere in grado di identificare correttamente i diversi genotipi con precisione.
L'ISH classico si basa su analisi qualitative delle intensità del segnale per trarre conclusioni sulle interazioni regolatorie tra il gene di interesse e i geni marcatori selezionati. Anche se utili, queste analisi soffrono di variazioni tecniche e possono essere di parte dalle aspettative dei ricercatori. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per quantificare l'espressione genica dopo l'imaging di embrioni macchiati di ESC, senza una conoscenza preliminare del genotipo corrispondente. Questo è stato seguito da un'efficace estrazione e genotipizzazione del DNA che ci ha permesso di correlare quantitativamente il genotipo con l'espressione genica3. Mentre la genotipizzazione degli embrioni dopo l'ISH è stata utilizzata primadel 4,5, la quantificazione basata sull'immagine dei modelli ISH non è stata ampiamente utilizzata a parte un paio di studi6,7. Le alternative più popolari si basano sul punteggio visivo o sul conteggio delle celle macchiate di ISH8,9,10, entrambi inclini a scarsa riproducibilità e pregiudizio del ricercatore. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i cambiamenti nei geni con modelli di espressione che sono limitati spazialmente, come runx1 o gata2b, entrambi espressi in un sottoinsieme limitato di cellule del pavimento aortico chiamato endotelio emogenico11,12.
Qui, ci proponiamo di fornire una guida pratica per l'implementazione della quantificazione mediante l'analisi delle immagini utilizzando Fiji13, così come il protocollo di estrazione e genotipizzazione del DNA. Questo ha lo scopo di illustrare visivamente il nostro metodo pubblicato in precedenza3. Il nostro metodo consente una rappresentazione accurata della variazione nell'espressione genica rilevata da ISH e un'assegnazione imparziale dei livelli di espressione genica a genotipi specifici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids)</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>A1402-3700</td>
			<td>96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavity slides</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR475535-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0)</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10289651</td>
			<td>the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3000 Fiber Optic Cold Light Source</td>
			<td>Photonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.01</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT alkaline lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT neutralization buffer</td>
			<td></td>
			<td>Tris HCl 40 mM, pH 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish

L'ibridazione in situ (ISH) è una tecnica importante che consente ai ricercatori di studiare la distribuzione dell'mRNA in situ ed è stata una tecnica critica nella biologia dello sviluppo per decenni. Tradizionalmente, la maggior parte degli studi sull'espressione genica si basava sulla valutazione visiva del segnale ISH, un metodo soggetto a pregiudizi, in particolare nei casi in cui le identità campione sono note a priori. In precedenza abbiamo riferito su un metodo per aggirare questa distorsione e fornire una quantificazione più accurata dei segnali ISH. Qui, presentiamo una semplice guida per applicare questo metodo per quantificare i livelli di espressione dei geni di interesse per gli embrioni macchiati di ESC e correlarli con i loro genotipi corrispondenti. Il metodo è particolarmente utile per quantificare i segnali di espressione genica con restrizioni spaziali in campioni di genotipi misti e fornisce un'alternativa imparziale e accurata ai metodi di punteggio visivo tradizionali.

In questo caso, descriviamo l'applicazione pratica della pipeline per la quantificazione dell'immagine e la genotipizzazione degli embrioni pubblicata altrove3. Il flusso di lavoro per il metodo è illustrato nella Figura 1. Per illustrare come utilizzare questo metodo, ISH è stato eseguito per dnmt3bb.1 in embrioni da 33 hpf da un incrociodi w84X/22 bit (Figura 2). 130 embrioni sono stati immagini utilizzando le stesse condizioni di illuminazione descritte nel protocollo ed etichettandoli con un numero univoco. Dopo l'imaging, ogni embrione è stato trasferito in un tubo PCR per la genotipizzazione. A questo punto, l'analisi dell'immagine è stata eseguita per attribuire un valore di intensità pixel a ogni immagine. Il genotipo è stato quindi assegnato all'immagine corrispondente e i valori di intensità dei pixel raggruppati in base al genotipo per l'analisi statistica. È stata rilevata una diminuzione dell'espressione dnmt3bb.1 nei mutanti runx1W84X/W84X (Figura 2A,B)3, in accordo con le osservazioni precedenti5. È interessante notare che gli embrioni eterozigosi runx1W84X/z non hanno mostrato differenze significative nell'espressione di dnmt3bb.1 (Figura 2A,B) rispetto ai suoi fratelli di tipo selvaggio, suggerendo che una copia di Runx1 è sufficiente a mantenere l'espressione dnmt3bb.1 a livelli appropriati.
Molti mutanti di pesce zebra non riescono a mostrare un fenotipo embrionale che altrimenti può essere rilevato utilizzando altre tecnologie di perdita di funzione come gli oligonucleotidi morfono (MOs). Questa discrepanza può essere attribuita a una serie di cause tra cui effetti off-target, compensazione delle proteine materne, un allele ipomorfico23 o il fenomeno recentemente scoperto di compensazione genetica24,25,26,27. In questo esempio, ci è stato chiesto se l'espressione runx1 è stata ridotta o persa nei mutanti lmo4auob100 poiché i dati pubblicati in precedenza utilizzando un MO lmo4a hanno suggerito che runx1 è diminuito in morfianti lmo4a 28. In questo caso, l'analisi non ha rivelato differenze significative nell'espressione runx1 tra il tipo selvaggio e lmo4auob100 omozygous mutanti3 (Figura 3A,B). Ulteriori analisi per singolo embrione qPCR hanno mostrato che c'era una piccola ma significativa diminuzione dell'espressione runx1 nei mutanti lmo4auob100 (Figura 3C). Pertanto, è possibile che la quantificazione delle immagini non sia in grado di rilevare piccole differenze nei livelli di espressione. In alternativa, la mancanza di differenza tra i genotipi rilevati è reale e gli esperimenti qPCR stanno rilevando cambiamenti nell'espressione runx1 in altri tessuti come il telenchephalon dove sono espressi sia lmo4a che runx1. I ricercatori dovrebbero sempre verificare i loro risultati con un metodo indipendente come qPCR, ma idealmente arricchendo per il tessuto di interesse dalla citometria di flusso, per esempio.
In rari casi in cui l'ISH ha un elevato background (Figura 3D), il valore di intensità dei pixel di quest'area è così alto che la sottrazione dal valore del segnale produce un numero negativo e in tali casi tali embrioni verrebbero esclusi dall'analisi. Nella nostra esperienza, questo si è verificato in circa lo 0,4% degli embrioni sondati runx13 ma può variare tra esperimenti, sonde o lotti di reagenti. Anche se questo potrebbe essere una limitazione del metodo, la bassa frequenza di sfondo elevato è molto improbabile che influenza i risultati complessivi.
Per testare l'effetto della selezione di diverse aree per le correzioni di fondo, abbiamo prima misurato l'intensità dei pixel del segnale ISH runx1 in embrioni da 28 cvf, utilizzando diverse regioni per le correzioni dello sfondo (Figura 4). Sono state selezionate quattro diverse regioni: due nella regione trunk (R1 e R2), una nella regione del tuorlo (non macchiata, ma probabilmente accumulerà una colorazione di fondo) e un'area più piccola anteriore al ROI (R4, Figura 4B). La misurazione dell'intensità dei pixel in queste regioni ha mostrato una differenza di intensità relativamente stabile tra il ROI e entrambe le aree di sfondo (Figura 4C). Tuttavia, R3 ha sempre mostrato valori molto elevati (al di sopra di quelli del ROI). Dopo l'inversione e la conversione a 8 bit, la regione del tuorlo appare molto luminosa e quindi non è adatta per l'uso come correzione dello sfondo. R2 era più vicino al ROI, ma conteneva un segnale ISH, e usarlo per la correzione diminuiva l'intensità media dei pixel rispetto a R1 (situata più dorsalmente, lontano dal segnale ISH) o R4. Pertanto, R1 o R4 sono aree appropriate che possono essere utilizzate per la correzione dello sfondo (nonostante l'area di R4 sia inferiore a quella di R1). Successivamente, abbiamo voluto confrontare come l'utilizzo di R1 o R4 ha influenzato i risultati quando si confronta l'espressione runx1. Per questo, abbiamo incrociato dll4- eterozygotes29 e analizzato l'espressione runx1 nel tipo selvatico selezionato casualmente e dll4-/-embrioni (Figura 4E). Sebbene l'utilizzo di R1 o R4 per la correzione in background influisca sui singoli valori, l'intensità media dei pixel all'interno dello stesso genotipo non era significativamente diversa (Figura 4E). Inoltre, il confronto dell'espressione runx1 produce ancora valori di intensità medi simili tra genotipi utilizzando aree R1 o R4 come correzione dello sfondo (rispettivamenteR1eR418,2). Nel loro insieme, abbiamo concluso che, sebbene la scelta dell'area di base sia importante, i criteri principali sono che non includono le regioni del tuorlo (soggette all'accumulo di macchie di fondo) e che non dovrebbero contenere macchie (specifiche) che potrebbero alterare i valori di intensità dei pixel dello sfondo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig1a.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro della quantificazione parallela dell'immagine e del protocollo di genotipizzazione. Gli embrioni raccolti da un incrocio di pesci eterozici per un allele mutante vengono sondati per il gene misurato con un protocollo ISH standard. Dopo l'imaging, il DNA genomico viene estratto utilizzando il protocollo HotSHOT aggiungendo il buffer di lisi direttamente all'embrione in un tubo PCR da 0,2 mL, seguito da un'incubazione di 30 min a 95 gradi centigradi. Questo DNA viene utilizzato per la genotipizzazione degli embrioni da PCR, PCR e polimorfismo a lunghezza del frammento di restrizione (RFLP), saggi KASP o qualsiasi altro metodo appropriato. Parallelamente, le immagini per ogni embrione vengono invertite e convertite in scala di grigi a 8 bit. I ROI di forma e dimensione identiche contenenti il segnale ISH (giallo) e lo sfondo (blu) vengono selezionati e misurati manualmente. Le misurazioni, assegnate ai genotipi corrispondenti, vengono analizzate statisticamente. Figura adattata da Dobrzycki et al.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig02.jpg"> Figura 2: La quantificazione delle immagini nei mutanti runx1 rivela livelli ridotti di espressione di dnmt3bb.1 da parte di ISH. (A) Esempi di immagini di ISH in 33 hpf wild type (blu), runx1/W84X (verde) e embrioniw84X/W84X (arancione), che mostrano l'espressione dnmt3bb.1 nell'aorta dorsale. (B) I valori di intensità dei pixel di dnmt3bb.1 mRNA negli embrioni runx1W84X/W84X(n. 36) sono significativamente diminuiti rispetto ai tipi selvatici (n.32) e agli eterozigoti (n.62) (ANOVA, p < 0,001). I coefficienti di variazione sono rispettivamente 24%, 22% e 21% per gruppi selvatici, eterozigote e mutanti. Il punto dati blu, verde e arancione corrisponde alle immagini di esempio del pannello A. Le barre rappresentano la media , s.d. ,p<0.001 (Games-Howell post-hoc test). Figura adattata da Dobrzycki et al.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig03.jpg"> Figura 3: Misurazione dei livelli di espressione runx1 da ISH nei mutanti lmo4auob100. (A) Immagini rappresentative di ISH per runx1 in 28 hpf wild type (blu), eteroziggous (verde) e lmo4auob100/uob100 (arancione) embrioni, mostrando l'espressione nell'aorta dorsale. (B) Quantificazione del segnale mRNA runx1, rilevato da ISH, da 28 hpf wild type (n.15), lmo4a etesoygous lmo4a(/- (het) (n-34) e lmo4auob100/uob100 embrioni mutanti (n.18) da una frizione non mostra alcuna differenza significativa nell'intensità pixelnaria di runx1 tra i diversi genotipi (ANOVA,> p 0.6). Il punto dati blu, verde e arancione corrisponde alle immagini di esempio del pannello A. Le barre rappresentano i Boxplot media (s.d. (C) che mostrano i livelli normalizzati di mRNA runx1 (2-CT) in singolo tipo selvaggio (blu; n.12) e lmo4auob100/uob100 (mut, arancione n-12) embrioni, misurati da qRT-PCR, che mostrano i livelli di runx1 nei mutanti rispetto al tipo selvatico. p < 0,05(t test). (D) Esempio di esperimento ISH su un embrione da 28 cv (colorato per runx1, punte di freccia gialla) che mostra uno sfondo elevato. Figura adattata da Dobrzycki et al.3<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59956/59956fig04.jpg"> Figura 4: Effetto della correzione dell'intensità di sfondo sui risultati della misurazione. (A) Immagine rappresentativa della colorazione runx1 ISH in un embrione di tipo selvatico a 28 hpf. (B) Stessa immagine dopo l'inversione e la conversione a 8 bit. La regione di interesse (ROI) è evidenziata in verde e quattro diverse aree utilizzate per la correzione dello sfondo (R1-R4) sono evidenziate in giallo. (C) Misurazioni dell'intensità dei pixel grezzi in tutte le regioni mostrate nel pannello B. Notare che l'intensità in R3 (yolk) è costantemente superiore al segnale ISH effettivo nel ROI (n. 11). (D) Livelli di espressione Runx1 nel ROI utilizzando le aree di sfondo R1, R2 e R4. Aree per ROI, R1, R2 e R3-28500 pixel; R4-8500 pixel. Si noti che lo sfondo R3 non è stato utilizzato per questo confronto poiché la correzione dello sfondo (ROI-R3) ha prodotto in modo coerente valori negativi. (E) Livelli di espressione Runx1 in tipo selvaggio e dll4-/- mutanti utilizzando R1 o R4 per la correzione dello sfondo (n. 10 per ogni campione). L'analisi statistica nei pannelli D ed E è stata eseguita utilizzando un test Kruskal-Wallis non parametrico, supponendo che i valori di intensità dei pixel non siano normalmente distribuiti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59956/59956fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Le tecnologie di editing genico hanno permesso ai ricercatori di generare mutanti di pesci zebra per studiare la funzione genica con relativa facilità. Qui, forniamo una guida per eseguire la genotipizzazione embrionale parallela e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nel pesce zebra. Questo approccio imparziale fornisce una maggiore precisione nelle analisi fenotipiche basate sull'ibridazione in situ.

Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Le conseguenze delle mutazioni sull'espressione genica sono spesso valutate qualitativamente dall'ibridazione in situ e generalmente valutate visivamente, il che è soggettivo e di parte dalle aspettative del ricercatore. Questo metodo fornisce un modo più coerente per confrontare gli esperimenti in situ quantificando le intensità dell'immagine e rimuove tale distorsione. Questo può anche essere facilmente adattato ad altri sistemi modello che usano l'ibridazione in situ come lettore di un'espressione genica.Inizia con l'imaging degli embrioni macchiati di ibridazione in situ o ISH. Preparare una soluzione di glicerolo e mescolarla per omogeneizzare. Trasferire gli embrioni alla soluzione di glicerolo con una pipetta Pasteur da tre millilitri e lasciarli depositare per almeno cinque minuti.Preparare ed etichettare abbastanza tubi PCR per trasferire gli embrioni macchiati di ISH dopo l'imaging, quindi utilizzare una pipetta Pasteur da tre millilitri per aggiungere il 100% di glicerolo sul fondo del pozzo di uno scivolo di depressione del vetro. Trasferire un singolo embrione macchiato di ISH allo scivolo di vetro e orientarlo sotto un microscopio stereo dotato di fotocamera digitale e illuminazione inferiore e superiore. Utilizzando il primo embrione, regolare l'illuminazione e il tempo di esposizione all'ingrandimento desiderato.Immagine di tutti gli embrioni necessari ed etichetta ogni immagine con un numero univoco. Dopo l'imaging, trasferire ogni embrione su un tubo PCR etichettato con lo stesso numero e, se necessario, aspirare l'eccesso di glicerolo dai tubi PCR. Per estrarre il DNA, aggiungere da 40 a 75 microlitri di un tampone di lysis alcalina come HoTSHOT ad ogni tubo.Incubare i tubi a 95 gradi Celsius per circa 30 minuti e quindi raffreddarli a quattro gradi Celsius. Aggiungere un volume uguale di buffer di neutralizzazione e procedere con il genotipizzazione per la mutazione di interesse. Per eseguire l'analisi delle immagini, selezionare e aprire l'immagine nelle Figi e invertire facendo clic su Modifica e quindi su Inverti, quindi convertire il tipo di immagine a 8 bit facendo clic sulla scheda Immagine, selezionando Tipo e selezionando 8 bit.Selezionare lo strumento poligono e disegnare manualmente l'area di interesse o il ROI sull'immagine intorno all'area che contiene il segnale ISH da misurare. Premere T per aprire Gestione ROI e selezionare l'area di interesse, quindi fare clic su Misura. Copiare il valore medio dalla finestra Risultati in un foglio di calcolo.Per misurare l'intensità dello sfondo, spostare il ROI in un'area dell'embrione senza colorazione e fare clic su Aggiungi nel gestore del ROI. Selezionare l'area di sfondo e fare clic su Misura, quindi registrare il valore di intensità media nel foglio di calcolo. Ottenere l'intensità media in pixel del segnale di ibridazione NC2 sottraendo l'intensità media dello sfondo da quella della regione macchiata.Dopo aver determinato l'intensità media dei pixel di ogni campione, assegnare un genotipo a ciascun campione. Se il genotipo non può essere determinato, escludere il campione dall'analisi successiva. Ordinare i valori medi di intensità del campione in base al genotipo e procedere con i test statistici.L'utilità di questa tecnica è stata dimostrata su ISH per dnmt3bb. 1 in embrioni da un incross eterozigote runx1. Una diminuzione di dnmt3bb.1 espressione è stata rilevata nei mutanti omozigoti runx1 mentre gli embrioni eterozigoti non hanno mostrato differenze significative in dnmt3bb. 1 espressione. Quando si tenta di determinare l'effetto della mutazione lmo4 sull'espressione runx1, questa analisi non ha mostrato differenze significative nell'espressione tra mutanti lmo4 omozigoti.Tuttavia, una piccola diminuzione dell'espressione runx1 è stata rilevata da un singolo embrione qPCR. In circa lo 0,4% degli embrioni sondati da runx1, l'ISH aveva uno sfondo elevato che ha portato a un numero negativo quando è stato sottratto dal segnale. In questi casi, gli embrioni sono stati esclusi dall'analisi.Quattro diverse regioni sugli embrioni sono state testate per ottimizzare le correzioni di fondo. Sebbene vi fosse una differenza relativamente stabile nell'intensità del ROI in nessuna delle aree di fondo, R3 mostrava sempre un'intensità maggiore rispetto al ROI e non doveva essere utilizzato per la correzione dello sfondo. R1 e R4 si sono rivelate le aree più appropriate per la correzione dello sfondo.È importante trovare le migliori condizioni per l'imaging e mantenerle invariate durante l'esperimento. Si consiglia inoltre di quantificare l'intensità dei pixel prima di assegnare un genotipo a ciascun campione.

Research

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Developmental Biology

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Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

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