Name: genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish
Uploaded: 2020-01-28T12:00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить сотрудников биомедицинских служб в Оксфорде и Бирмингеме за отличное животноводство. T.D. финансировалась стипендией Wellcome Trust Chromosome and Developmental Biology PhD Scholarship (#WT102345/13/13/) R.M. и M.K. были профинансированы Британским фондом сердца (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) и благодарны за их щедрую поддержку. R.M. подтверждает поддержку центра передового опыта BHF (RE/13/1/30181), Оксфорд.

Процедуры, касающиеся животных, регулируются Законом 1986 года о животных (научные процедуры) и были утверждены министерством внутренних дел и местным органом по защите животных и этическому обзору.
1. Изображение ISH-окрашенных эмбрионов
<ol><li>Подготовьте раствор глицерола (50%-80% в буфере 1x PBS) и смешайте для гомогенизации раствора (например, оставьте в ролике не менее 5 мин). Это решение может храниться в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.</li>
	<li>После на месте гибридизации14,15,16,17, передача эмбрионов в раствор глицерола с 3 мл Пастер пипетка и оставить, чтобы поселиться, по крайней мере 5 мин. Если изображения эмбрионов старше 24 л.с. (часы после оплодотворения), они могут быть отбелены, как описано18.<ol>
<li>Подготовка и этикетка достаточно ПЦР трубки для передачи ISH-окрашенных эмбрионов после изображения.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Добавьте 100% глицерол на дно колодца в стеклянной депрессии слайд с 3 мл Пастер пипетка.</li>
	<li>Используя пипетку Pasteur объемом 3 мл, перенесите один эмбрион, окрашенный ISH, на стеклянную горку и ориентируйся по мере необходимости под стереомикроскоп, оснащенный цифровой камерой и нижней и верхней подсветкой. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гель загрузки пипетки советы для размещения эмбрионов для визуализации, но другие инструменты (например, щипцы, вскрытие иглы) будет в равной степени адекватным.</li>
	<li>Используя первый эмбрион, отрегулируйте освещение и время экспозиции при нужном увеличении. Используйте эти условия для ВСЕХ эмбрионов в том же эксперименте (т.е. если визуализация 40 эмбрионов из гетерозиготного мутанта incross, убедитесь, что освещение, время экспозиции и увеличение одинаковы для всех).</li>
	<li>Изображение столько эмбрионов, сколько требуется. Наметьте каждое изображение уникальным номером. После визуализации перенесите эмбрион в трубку ПЦР/пластину с одинаковым номером. ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения должны быть сохранены как файлы TIF, но другие форматы также являются адекватными.<ol>
<li>При необходимости удалите избыток глицерола в пЦР-трубках/пластинах. ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент эмбрионы могут храниться в трубках ПЦР в течение нескольких недель при комнатной температуре.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Извлеките ДНА и генотип зародить ISH-окрашенные
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используйте надежный и недорогой метод изоляции геномной ДНК на основе метода HoTSHOT19 с эффективностью извлечения ДНК 95%-100%3.
<ol><li>После завершения изображения добавьте 40-75 qL щелочным лисисовым буфером (например, HoTSHOT) к каждой трубке.</li>
	<li>Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут и охладить трубки до 4 градусов по Цельсию, прежде чем добавить равный объем буфера нейтрализации. Ночная инкубация при 4 градусах По Цельсию может повысить эффективность ПЦР. ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент геномная ДНК может быть использована для генотипирования или храниться при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока это не потребуется.</li>
	<li>Образцы генотипа с соответствующим методом (например, HRMA, RFLP)3,20,21, как требуется для мутации интереса.</li>
	<li>Обратите внимание на генотип, соответствующий каждому образцу (например, с использованием программного обеспечения электронной таблицы).</li>
</ol>3. Количественная интенсивность пикселей окрашенных ISH эмбрионов (анализ изображений с использованием программного обеспечения Фиджи)
<ol><li>Чтобы количественно количественно на месте гибридизации (ISH) окрашивания интенсивности сигнала, преобразовать все изображения в 8-битный серый масштаб, как описано3. Если изображения были сохранены как . TIF файлы, используйте макрос Фиджи для преобразования партии3. Кроме того, конвертировать изображения в других форматах (например, . JPG) до . TIF с использованием соответствующего программного обеспечения, а затем преобразовать в 8-битный серый с помощью Фиджи. Для удобства, вот пошаговая процедура, которая была опубликована ранее3, с некоторыми изменениями.</li>
	<li>Откройте изображения на Фиджи и инвертировать изображение с Edit Затем измените тип изображения на 8-битный(Изображение</li>
	<li>Используя инструмент выбора полигона, нарисуйте область интереса (ROI) вручную на изображении вокруг области, содержащей сигнал.</li>
	<li>Нажмите т, чтобы открыть рентабельность инвестиций менеджера. Используйте команду «Мера» менеджера ROI для измерения интенсивности рентабельности инвестиций. Копирование средней стоимости из окна результатов в программное обеспечение электронной таблицы.</li>
	<li>Переместите ту же рентабельность инвестиций, обеспечивая тот же размер и форму, что и исходный регион, в область зебры, не содержащую окрашивания. Повторите шаг 3.4 для измерения фона.</li>
	<li>Чтобы получить среднее пиксельную интенсивность сигнала ISH, вычесть среднее значение интенсивности фоновой области из запятнанной области для каждого эмбриона.</li>
	<li>Присвоить каждому значению интенсивности генотип (от шага 2.3).</li>
</ol>4. Анализ результатов с помощью соответствующих статистических тестов
<ol><li>Участок все значения на одном участке, чтобы определить любые отклонения от нормального распределения. ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальное распределение также может быть проверено с помощью теста Колмогорова-Смирнова или теста Шапиро-Вилк. Однако для больших размеров выборки существует высокий риск ложных срабатываний в этих тестах.</li>
	<li>При наличии сильных отклонений от нормального распределения преобразуйте все значения (с использованием функций ln или sqrt), чтобы убедиться, что они обычно распределены перед началом работы.</li>
	<li>Проанализируйте различия между значениями (преобразованными при необходимости), назначенными каждому генотипу (wt vs. heterozygote vs. mutant) с помощью 2-хвостой ANOVA с 95% уровнем достоверности, что свидетельствует о равенстве дисперсий с тестом Левена и коррекцией Уэлча. Для парных сравнений между каждой парой генотипов используйте пост-специальный тест Tukey's (равные отклонения) или Games-Howell (неравные отклонения).<ol>
<li>Если значения обычно не распределены, несмотря на преобразование, используйте непараметрический тест (Kruskall-Wallis) для анализа различий между ранжированными значениями и тестом нескольких сравнений После Хок Данна с коррекцией Bonferroni для парной Сравнения.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Участок непреобразованных значений (от шага 3.6) в качестве точка участков для лучшего представления результатов.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRz:+a+database+of+zebrafish+validated+sgRNAs.">CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).</li><li>Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+pipeline+for+parallel+image-based+quantification+of+gene+expression+and+genotyping+after+in+situ+hybridisation.">An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation.</a> Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).</li><li>Bresciani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBFbeta+and+RUNX1+are+required+at+2+different+steps+during+the+development+of+hematopoietic+stem+cells+in+zebrafish.">CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish.</a> Blood. 124 (1), 70-78 (2014).</li><li>Gore, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+hematopoiesis+by+DNA+methylation.">Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation.</a> Elife. 5, e11813 (2016).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Specific+Gain+of+RTK+Signalling+Uncovers+Selective+Cell+Vulnerability+during+Embryogenesis.">Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis.</a> PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).</li><li>Wen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA5+SUMOylation+is+indispensable+for+zebrafish+cardiac+development.">GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).</li><li>Espin-Palazon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence.">Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence.</a> Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).</li><li>Genthe, J. R., Clements, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin+1+is+required+for+specification+of+hematopoietic+stem+cells+through+Wnt16+and+Vegfa+signaling+pathways.">R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways.</a> Development. 144 (4), 590-600 (2017).</li><li>Kalev-Zylinska, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+is+required+for+zebrafish+blood+and+vessel+development+and+expression+of+a+human+RUNX1-CBF2T1+transgene+advances+a+model+for+studies+of+leukemogenesis.">Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis.</a> Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).</li><li>Butko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata2b+is+a+restricted+early+regulator+of+hemogenic+endothelium+in+the+zebrafish+embryo.">Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo.</a> Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lleras Forero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmentation+of+the+zebrafish+axial+skeleton+relies+on+notochord+sheath+cells+and+not+on+the+segmentation+clock.">Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Jowett, T., Yan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+fluorescent+in+situ+hybridization+to+zebrafish+embryos.">Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos.</a> Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Narayanan, R., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mRNA+by+Whole+Mount+in+situ+Hybridization+and+DNA+Extraction+for+Genotyping+of+Zebrafish+Embryos.">Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos.</a> Bio-protocol. , e3193 (2019).</li><li>Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gata1/pu.1+lineage+fate+paradigm+varies+between+blood+populations+and+is+modulated+by+tif1gamma.">The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma.</a> EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).</li><li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies.">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoietic+stem/progenitor+cells+manifest+distinct+differentiation+output+in+the+zebrafish+VDA+and+PBI.">Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI.</a> Developement. 136 (4), 647-654 (2009).</li><li>Stainier, D. Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).</li><li>El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation:+A+phenomenon+in+search+of+mechanisms.">Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components.">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).</li><li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation.">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).</li><li>Meier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+binding+partners+of+Ldb1+are+required+for+haematopoietic+development.">Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development.</a> Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Leung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+VEGFA+functions+in+arteriogenesis+and+hematopoietic+stem+cell+specification.">Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification.</a> Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

При использовании этого метода следует учитывать несколько факторов для количественной оценки экспрессии генов. Условия визуализации должны поддерживаться на протяжении всего эксперимента (например, освещение, время экспозиции и позиционирование эмбриона), чтобы уменьшить изменчивость между измерениями. Критический момент заключается в том, чтобы избежать чрезмерного окрашивания образцов, так как различия в окрашивании между образцами могут быть замаскированы. Например, снижение экспрессии VegfA при отсутствии Eto2 в эмбрионах Xenopus laevis 30 может быть обнаружено только путем тщательного мониторинга окрашивания в течение 24-часового периода. Таким образом, это хорошая практика, чтобы эмпирически определить адекватные уровни окрашивания для каждого гена, которые лучше всего представляют его выражение, не достигая насыщения. Чрезмерное погревение также искусственно увеличит интенсивность фоновых пикселей в преобразованных 8-битных серых изображениях и исказит результаты количественной оценки. В крайних случаях фоновый уровень эмбриональных тканей может быть выше, чем сигнал ISH в выбранной рентабельности инвестиций, и эти образцы должны быть исключены из анализа. Аналогичное явление наблюдалось при проверке пригодности неокрашенного желтка для коррекции фона(рисунок 4). После инверсии и преобразования в 8-битные темные пиксели в желтоковой области становятся ярче, чем сигнал ISH в эмбрионе и делают фон исправленные значения отрицательными. Таким образом, избегайте использования желтка для коррекции фона. Измерение фонового сигнала в пигментированных областях эмбриона (например, глаза или тонченная часть ствола от 26/28 л.с. и далее) будет в равной степени искажать результаты количественной оценки и также следует избегать. Существуют протоколы для отбеливания эмбрионов зебры, либо до или после ISH18 и отбеливания эмбрионов старше 24 л.с. до визуализации рекомендуется.
Поскольку этот метод опирается на измерение интенсивности пикселей в определенной области на фоне интенсивности пикселей в эквивалентной неокрашенной области, он не подходит для количественной оценки вездесущих или почти вездесущих генов как есть. Вместо этого, он хорошо подходит для измерения экспрессии генов с пространственно ограниченным распределением, где область для измерения интенсивности фоновых пикселей может быть легко идентифицирована. Наш дополнительный анализ теперь показывает, что использование меньшей площади (3-4x меньше) для коррекции фона дает аналогичные результаты с использованием эквивалентной площади рентабельности инвестиций. Это расширяет применимость метода к генам, выраженным в более широких пространственных областях (и, таким образом, требующих больших рентабельности инвестиций для измерения интенсивности), до тех пор, пока можно использовать четко неокрашенные области эмбриона для фоновой коррекции.
Наконец, мы предлагаем, чтобы генотипирование выполнялось параллельно или после количественной оценки изображения, чтобы свести к минимуму предвзятость экспериментатора. Просить второго экспериментатора повторить количественную оценку на анонимизированных образцах и сравнить его с первым набором измерений также поможет уменьшить предвзятость экспериментаторов. Если изображения, которые будут количественно от сравнения между лечения, которые не требуют генотипирования (например, дикий тип против химического ингибитора или дикий тип против MO нокдаун), экспериментатор выполнения измерений должны быть ослеплены к личности Образец.

Внедрение технологий редактирования генома (ЗФН, TALENs и совсем недавно, CRISPR/Cas9) привело к массовому увеличению числа лабораторий по всему миру, которые используют эти системы для изучения функции конкретных генов in vivo. Зебрафиш, в частности, поддаются генетическим манипуляциям, и многие мутанты были созданы в недавнем прошлом1,2. Для биологов в области развития, один из наиболее распространенных методов для оценки фенотипических последствий генных мутаций в эмбриональном развитии находится в situ гибридизации (ISH). При отсутствии очевидных морфологических дефектов, отделяющих гомозиготных мутантов от их дикого типа или гетерозиготных братьев и сестер, важно уметь точно идентифицировать различные генотипы.
Классический ISH опирается на качественный анализ интенсивности сигнала для получения выводов о регулятивных взаимодействиях между геном интереса и выбранными генами маркеров. Хотя эти анализы являются полезными, они могут быть предвзятыми ожиданиями исследователей. Таким образом, был разработан метод количественной оценки экспрессии генов после визуализации эмбрионов, окрашенных ISH, без предварительного знания соответствующего генотипа. За этим последовала эффективная экстракция ДНК и генотипирование, что позволило нам количественно соотнести генотип с экспрессией генов3. В то время как генотипирование эмбрионов после ISH был использован до4,5, изображение на основе количественной оценки ISH моделей не был широко использован, кроме нескольких исследований6,7. Наиболее популярные альтернативы полагаются на визуальный скоринг или подсчет МГ-окрашенных клеток8,9,10, как склонны к плохой воспроизводимости и исследователь смещения. Этот метод особенно полезен для изучения изменений в генах с экспрессией моделей, которые пространственно ограничены, такие как runx1 или gata2b, как выражается в ограниченном подмножество клеток аорты пола называется гемогенный эндотелий11,12.
Здесь мы стремимся предоставить практическое руководство по осуществлению количественной оценки с помощью анализа изображений с использованием Фиджи13, а также днк-экстракции и генотипирования протокола. Это предназначено для визуальной иллюстрации нашего ранее опубликованного метода3. Наш метод позволяет точно едить вариации экспрессии генов, обнаруженные ISH, и объективное назначение уровней экспрессии генов на конкретные генотипы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids)</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>A1402-3700</td>
			<td>96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavity slides</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR475535-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0)</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>10289651</td>
			<td>the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3000 Fiber Optic Cold Light Source</td>
			<td>Photonic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.01</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT alkaline lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td>25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HotSHOT neutralization buffer</td>
			<td></td>
			<td>Tris HCl 40 mM, pH 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X) pH 7.4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping and quantification of in situ hybridization staining in zebrafish

На месте гибридизации (ISH) является важным методом, который позволяет исследователям изучать распределение мРНК на месте и был критическим методом в биологии развития на протяжении десятилетий. Традиционно, большинство исследований экспрессии генов опирались на визуальную оценку сигнала ISH, метода, который склонен к предвзятости, особенно в тех случаях, когда идентификационные данные образцов известны априори. Ранее мы сообщали о методе, чтобы обойти эту предвзятость и обеспечить более точную количественную оценку сигналов ISH. Здесь мы представляем простое руководство по применению этого метода для количественной оценки уровней экспрессии генов, представляющих интерес для эмбрионов, окрашенных ISH, и соотносить это с их соответствующими генотипами. Этот метод особенно полезен для количественной оценки пространственно ограниченных сигналов экспрессии генов в образцах смешанных генотипов и обеспечивает объективную и точную альтернативу традиционным методам визуального скоринга.

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish at JoVE.com

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Технологии редактирования генов позволили исследователям генерировать мутантов зебры для исследования функции генов с относительной легкостью. Здесь мы предоставляем руководство для выполнения параллельных генотипирования эмбрионов и количественной оценки сигналов гибридизации на месте у зебры. Такой объективный подход обеспечивает большую точность в фенотипивных анализах, основанных на гибридизации in situ.

Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Последствия мутаций для экспрессии генов часто оцениваются качественно путем гибридизации на месте и в целом оцениваются визуально, что субъективно и предвзято ожиданиями исследователя. Этот метод обеспечивает более последовательный способ сравнения экспериментов на месте путем количественной оценки интенсивности изображения и устраняет эту предвзятость. Это также может быть легко адаптировано к другим модельным системам, которые используют гибридизацию на месте в качестве читателя экспрессии генов.Начните с визуализации эмбрионов, окрашенных на месте гибридизации или ISH. Приготовьте раствор глицерола и смешайте его для гомогенизации. Перенесите эмбрионы в раствор глицерола с трехми миллилитровой пипеткой Pasteur и оставьте их поселиться не менее чем на пять минут.Подготовка и этикетка достаточно ПЦР труб для передачи ISH окрашенных эмбрионов после изображения, а затем использовать три миллилитров Пастер пипетки, чтобы добавить 100% глицерол на дно колодец стеклянной депрессии слайд. Перенесите один эмбрион, окрашенный ISH, на стеклянную горку и сориентировать его под стерео микроскопом, оснащенным цифровой камерой и нижней и верхней подсветкой. Используя первый эмбрион, отрегулируйте время освещения и экспозиции при желаемом увеличении.Изображение столько эмбрионов, сколько требуется, и пометить каждое изображение с уникальным номером. После визуализации перенесите каждый эмбрион в трубку ПЦР, помеченную одним и тем же номером, и при необходимости аспирировать избыток глицерола из ПЦР-труб. Чтобы извлечь ДНК, добавьте от 40 до 75 микролитров щелочного буфера лиза, таких как HoTSHOT к каждой трубке.Инкубировать трубки при 95 градусах по Цельсию в течение примерно 30 минут, а затем охладить их до четырех градусов по Цельсию. Добавьте равный объем буфера нейтрализации и приступайте к генотипизации для мутации интереса. Для выполнения анализа изображений выберите и откройте изображение на Фиджи и инвертировать его, нажав на Edit, а затем инвертировать, затем преобразовать тип изображения в 8-битный, нажав на вкладку Изображения, выбрав тип и выбрав 8-битный.Выберите инструмент полигона и вручную нарисуйте область интереса или рентабельности инвестиций на изображении по всему региону, который содержит сигнал ISH для измерений. Нажмите T, чтобы открыть ROI Manager и выбрать область интереса, а затем нажмите Мера. Копирование среднего значения из окна результатов в электронную таблицу.Чтобы измерить фоновую интенсивность, перемести рентабельность инвестиций в область эмбриона без окрашивания и нажмите Добавить в ROI Manager. Выберите фоновый регион и нажмите Измерение, а затем завестите среднее значение интенсивности в электронной таблице. Получить среднее интенсивность пикселей сигнала гибридизации NC2, вычитая средняя интенсивность фона из окрашенных области.После определения среднего интенсивности пикселей каждого образца назначьте генотип каждому образцу. Если генотип не может быть определен, исключите образец из последующего анализа. Сортировать средние значения интенсивности выборки в соответствии с генотипом и приступить к статистическим тестам.Полезность этой техники была продемонстрирована на ISH для dnmt3bb. 1 в эмбрионах из runx1 гетерозиготных incross. Снижение dnmt3bb.1 выражение было обнаружено в runx1 гомозиготных мутантов в то время как гетерозиготные эмбрионы показали никаких существенных различий в dnmt3bb. 1 выражение. При попытке определить влияние мутации lmo4 на экспрессию runx1 этот анализ не показал существенных различий в выражении между диким типом и гомозиготными мутантами lmo4.Тем не менее, небольшое снижение экспрессии runx1 было обнаружено одним эмбрионом qPCR. Примерно в 0,4% эмбрионов, исследованных runx1, ISH имел высокий фон, что привело к отрицательному числу, когда он был вычтен из сигнала. В таких случаях эмбрионы были исключены из анализа.Четыре различных региона на эмбрионах были протестированы для оптимизации фоновых коррекций. Несмотря на относительно стабильную разницу в интенсивности окупаемости инвестиций в любой из фоновых областей, R3 всегда демонстрировала более высокую интенсивность, чем рентабельность инвестиций, и не должна использоваться для фоновой коррекции. R1 и R4 оказались наиболее подходящими областями для фоновой коррекции.Важно найти наилучшие условия для визуализации и сохранить их неизменными на протяжении всего эксперимента. Мы также рекомендуем количественно оценить интенсивность пикселей, прежде чем назначать генотип каждому образцу.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Использование флюоресценции в Situ гибридизация (рыбы) для контроля состояния руку сплоченности в Прометафаза и метафаза я дрозофилы ооцитов

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Флуоресцентные изображения кальция и последующей на месте гибридизации для нейрональной характеристики прекурсоров в Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Количественная оценка уровней этанола в эмбрионах зебрафиш с использованием хроматографии космического газа головы

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...