Name: identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2016YFD0102103) und der National Natural Science Foundation of China (Nr.31701394) unterstützt.

1. Vorbereitungen
<ol><li>
Entwicklung von mutagenisierten Populationen
	<ol>
<li>Behandeln Sie ca. 20.000 getrocknete Reissamen (mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 14%) einer Japonica-Reislinie (z.B. DS552) mit 137Cs Gammastrahlen bei 100 Gy (1 Gy/min) in einer Bestrahlungsanlage (z.B. Gammazelle). ANMERKUNG: Saatgut, das zur Behandlung verwendet wird, sollte eine hohe Lebensfähigkeit haben (z. B. mit einer Keimrate von >85 %). Die Bestrahlungsdosis für Indica-Reis ...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li><li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING,+high-resolution+melting+(HRM),+and+next-generation+sequencing+(NGS)+techniques+in+plant+mutation+breeding.">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).</li><li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING.">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single+nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li><li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling.">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li><li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula.">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis.">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li><li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population.">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+rare+mutations+in+populations:+TILLING+by+sequencing.">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li><li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING+by+Sequencing+(TbyS)+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops.">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14 (2017).</li><li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor.">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).</li><li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application:+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations.">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li><li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction.">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li><li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+(HRM)+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes.">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43 (2011).</li><li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+manual+for+physiological+rice.">Laboratory manual for physiological rice.</a> The International Rice Research Institute. , (1976).</li><li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China.">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li><li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+(Oryza+sativa+L.):+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control.">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li><li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting-based+tilling+of+&#947;+ray-induced+mutations+in+rice.">High-resolution melting-based tilling of &#947; ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li><li>Acanda, Y., &#211;scar, M., Prado, M. J., Gonz&#225;lez, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine.">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li><li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+an+HRM-based,+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice.">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li><li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+&#947;+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing.">Frequency and type of inheritable mutations induced by &#947; rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).</li></ol>

TILLING hat sich als ein leistungsfähiges reverse genetisches Werkzeug zur Identifizierung induzierter Mutationen für die Genfunktionalanalyse und Pflanzenzüchtung erwiesen. Für einige Merkmale, die nicht leicht beobachtet oder bestimmt werden können, kann TILLING mit PCR-basierter Mutationsdetektion mit hohem Durchsatz eine nützliche Methode sein, um Mutanten für verschiedene Gene zu erhalten. Die HRM-TILLING-Methode wurde in EMS-mutagenisierten Populationen von Tomaten12,Weizen<sup class=...

Mutanten sind wichtige genetische Ressourcen für die pflanzenfunktionelle Genomforschung und die Züchtung neuer Sorten. Ein Forward-Genetik-Ansatz (d.h. von der mutierten Selektion bis zum Genklonen oder der Sortenentwicklung) war vor etwa 20 Jahren die wichtigste und einzige Methode für die Verwendung induzierter Mutationen. Die Entwicklung einer neuartigen Reverse-Genetik-Methode, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) von McCallum et al.1 eröffnete ein neues Paradigma und wurde seitdem bei einer großen Anzahl von Tier- und Pflanzenarten angewendet2. TILLING ist besonders nützlich für Zuchteigenschaften, die technisch schwierig oder kostspielig zu bestimmen sind (z. B. Krankheitsresistenz, Mineralgehalt).
TILLING wurde ursprünglich für Screening-Punktmutationen entwickelt, die durch chemische Mutagene induziert werden (z.B. EMS1,3). Sie umfasst die folgenden Schritte: die Einrichtung einer TILLING-Bevölkerung; DNA-Vorbereitung und -Pooling einzelner Pflanzen; PCR-Verstärkung des Ziel-DNA-Fragments; Heteroduplexe Bildung durch Denaturierung und Glühen von PCR-Amplicons und Spaltung durch CEL I Nuklease; und Identifizierung mutierter Individuen und ihrer spezifischen molekularen Läsionen3,4. Diese Methode ist jedoch nach wie vor relativ komplex, zeitaufwändig und mit geringem Durchsatz. Um es effizienter und mit höherem Durchsatz zu machen, wurden viele modifizierte TILLING-Methoden entwickelt, wie z.B. Löschen TILLING (De-TILLING) (Tabelle 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
Die HRM-Kurvenanalyse, die auf Fluoreszenzänderungen beim Schmelzen des DNA-Duplexs basiert, ist eine einfache, kostengünstige und hochdurchsatzstarke Methode für Mutationsscreening und Genotypisierung13. HRM wurde bereits weit verbreitet in der Pflanzenforschung einschließlich HRM-basierteTILLING (HRM-TILLING) für das Screening von SBS-Mutationen durch EMS-Mutagenese14induziert. Hier präsentierten wir detaillierte HRM-TILLING-Protokolle zum Screening von Mutationen (sowohl Indel als auch SBS), die durch Gamma-Strahlen im Reis induziert werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Taq plus PCR Master Mix</td>
			<td>Tiangen, China</td>
			<td>KT201</td>
			<td>PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Bio-rad, America</td>
			<td>MSP-9651</td>
			<td>Specific plate for PCR in HRM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler nexus</td>
			<td>Eppendorf, German</td>
			<td>6333000073</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td>LCSN-ASY-0011</td>
			<td>For fluorescence sampling and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALL-IT 2.0</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of the fluorescence change</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EvaGreen</td>
			<td>Biotium, USA</td>
			<td>31000-T</td>
			<td>Fluorescence dye of HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>ND2000</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) ist eine Strategie der Reverse-Genetik für das Hochdurchsatz-Screening von induzierten Mutationen. Das TILLING-System ist jedoch weniger anwendbar für die Insertion/Deletion (Indel)-Erkennung und herkömmliche TILLING-Schritte benötigen komplexere Schritte, wie cel I Nuklease-Verdauung und Gelelektrophorese. Um den Durchsatz und die Selektionseffizienz zu verbessern und das Screening sowohl von Indels als auch von Single Base Substitions (SBSs) zu ermöglichen, wird ein neues HIGH-Resolution-Melting-System (HRM) entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes HRM-TILLING Protokoll vor und zeigen dessen Anwendung im Mutationsscreening. Diese Methode kann die Mutationen von PCR-Amplicons analysieren, indem die Denaturierung von doppelsträngiger DNA bei hohen Temperaturen gemessen wird. Die HRM-Analyse erfolgt direkt nach der PCR ohne zusätzliche Verarbeitung. Darüber hinaus ist eine einfache, sichere und schnelle (SSF) DNA-Extraktionsmethode in HRM-TILLING integriert, um sowohl Indels als auch SBSs zu identifizieren. Seine Einfachheit, Robustheit und hoher Durchsatz machen es potenziell nützlich für Mutationsscans in Reis und anderen Kulturen.

HRM Scanning und Analyse
Insgesamt wurden 1.140 gepoolte DNA-Proben aus 4.560 M2-Sämlingen hergestellt und einer PCR-Verstärkung unterzogen. Zwei Fragmente mit der Größe von 195 bp und 259 bp wurden für OsLCT1 bzw. SPDT(Tabelle 2) verstärkt. Die meisten Proben hatten Schmelzkurven, die sich nicht wesentlich von der WT unterschieden (F < 0,05). HRM-Kurven, die sich deutlich von der WT unterscheiden (F > 0,05), wurden von der S...

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Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

In diesem Artikel stellen wir das Protokoll vor, das als HRM-basiertes Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) beschrieben wird. Diese Methode nutzt Fluoreszenzänderungen beim Schmelzen des DNA-Duplex und eignet sich für das Hochdurchsatz-Screening sowohl der Insertion/Deletion (Indel) als auch der Single Base Substition (SBS).

Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Es wäre sehr nützlich für Zuchteigenschaften, die technisch schwierig oder kostspielig zu bestimmen sind, wie Krankheitsresistenz, Mineralgehalt. Es ist eine ziemlich einfache, kostengünstige und hohe Durchsatztechnik. Legen Sie zunächst vier Blattscheiben in jeden Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.Fügen Sie 50 Milliliter Puffer Eine Lösung in jeden Brunnen. Einfrieren der Platte in einem minus 80-Grad-Gefrierschrank für 10 Minuten. Dann die Platte bei Raumtemperatur einfrieren.Bei 95 Grad Celsius 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie 50 Mikroliter Puffer B zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie gut durch Wirbeln. Zentrifugieren Sie die Platte für eine Minute bei 1, 500 mal g.Sammeln Sie den Überstand als DNA für PCR. Verwenden Sie zunächst den DNA-Überstand aus einer sowie PCR-Vorlage, um die Glühtemperatur zu optimieren. Fügen Sie Reagenzien und einen Mikroliter DNA-Überstand in jeden PCR-Brunnen ein.Legen Sie die PCR-Rohre in einen gradientenfähigen Wärmeblock und passen Sie das Heizprogramm entsprechend dem Manuskript an, um die optimale Glühtemperatur für jedes Zielfragment zu bestimmen. Führen Sie die Elektrophorese für das PCR-Produkt auf 1%Agarose-Gelen durch, um Amplicons zu untersuchen. Bestimmen Sie die optimale Glühtemperatur, die eine spezifische Verstärkung des Zielfragments ermöglicht.Kombinieren Sie zur Durchführung der HRM-Analyse Reagenzien, einschließlich eines Mikroliters des 10-fachen Fluoreszenzfarbstoffs und eines Mikroliters des DNA-Überstands in jedem Brunnen der HRM-kompatiblen Platten. In jeder Platte, enthalten eine wilde Art parented Probe und eine negative Kontrolle ohne DNA. Fügen Sie jedem Brunnen einen Tropfen Mineralöl hinzu, um Verdunstung zu verhindern.Versiegeln Sie die Platte dann mit Klebefolie und zentrifugieren Sie eine Minute lang 1000 mal g. Führen Sie die PCR mit der optimierten Glühtemperatur aus. Entfernen Sie nun den Klebefilm von der Platte, und legen Sie die Platte in eine HRM-Maschine ein.Wählen Sie in der Software Neue Ausführung aus dem Dateimenü aus, oder drücken Sie die Schaltfläche Ausführen am oberen Bildschirmrand. Geben Sie die Anfangs- und Endtemperaturen für die Schmelze von 55 bis 95 Grad Celsius an. Wählen Sie Proben für die hochauflösende Schmelzanalyse aus, und schließen Sie Proben aus, die dem Negativkontroll ähnelt.Normalisieren Sie die Schmelzkurven, um die gleiche Anfangs- und Endfluoreszenz zu haben. Bestätigen Sie visuell, dass sich die Cursor der unteren minimalen und unteren maximalen Temperatur in einem Bereich der Kurven befinden. Halten Sie das Delta F, die Fluoreszenzdifferenz, auf dem Niveau der Standardeinstellung 05.Wählen Sie in der Auswahlliste Standards die allgemeine/Variante aus, und wählen Sie die normale Empfindlichkeit aus. Wählen Sie H12 aus, um den Wildtyp als Steuerelement zu verwenden. Proben mit einem Delta-F-Wert größer als 05 werden als mutierte Pflanze betrachtet.Dann, mit einer CTAB-Methode, extrahieren SIE DNA aus jeder der vier Pflanzen aus dem Mutantenbecken mit der Schmelzkurve deutlich anders als die Wild-Typ. Nach der Quantifizierung mit einem Spektralphotometer passen Sie die DNA mit dem NanoDrop 2000 auf eine Endkonzentration von ca. 25 Nanogramm pro Mikroliter an. Fügen Sie 0,4 Mikroliter PCR-Primer in die DNA-Probe in den PCR-Röhren, legen Sie sie in einen thermischen Cycler und passen Sie das Programm an, um das Zielfragment zu verstärken.Senden Sie dann die PCR-Produkte zur Sequenzierung an ein Unternehmen. Vergleichen Sie nach der Sanger-Sequenzierung die molekulare Läsion, indem Sie die Sequenzen zwischen der M2-Pflanze und der Wildart vergleichen. In dieser Studie zeigten HRM-Scans und Analysen von M2-Sämlingen auf Mutationen in OsLCT1- oder SPDT-Genen, dass die meisten Proben Schmelzkurven hatten, die sich nicht signifikant vom Wildtyp mit Delta F unter 05 unterschieden.Die Mutanten zeigten signifikant unterschiedliche HRM-Kurven mit Delta Fs größer als 05 bei Temperaturen von 90 bis 92 Grad Celsius bzw. 81,5 bis 83,5 Grad Celsius. Der Mutationstyp und die Position der Gene von 4, 560 M2 Sämlingen wurden durch die Sequenzierungschromatogramme bestätigt. Es wurde eine heterozygote Stelle mit einer Mutation von G zu A bei 4, 304 Basenpaaren von OsLCT1 identifiziert.Eine einzige Nukleotid-Einfügung erschien bei den 4, 240 Basispaaren von OsLCT1, und eine TTC-Trinukleotid-Deletion wurde an der Position 5, 948 bis 5, 950 Basispaare von SPDT beobachtet. Ich optimiere die PCR vor der HRM-Analyse. Der Farbstoff im Gel ist etwas schädlich.Denken Sie daran, Handschuhe anzuziehen, wenn Sie das Gel laufen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Forschung

Genetik

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Hochauflösende Schmelz-PCR für Komplement-Rezeptor 1 Länge Polymorphismus Genotypisierung: Ein innovatives Werkzeug für die Alzheimer-Krankheit Gen-Anfälligkeits-Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Hochauflösende Vergleich der bakteriellen Konjugation Frequenzen

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...