Name: identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (No 2016YFD0102103) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31701394).

1. ההכנות
<ol><li>
פיתוח מγ לאוכלוסיות מוטחות
	<ol>
<li>התייחס כ 20,000 זרעי אורז יבשים (עם תוכן לחות של ca. 14%) של קו אורז יפני (למשל, DS552) עם 137למדעי השורה ב-100 Gy (1 gy/min) במתקן הקרנה γ (למשל, תא גמא). הערה: זרעים המשמשים לטיפול צריך להיות בעל יכולת קיום גבוהה (למשל, עם קצב נביטה > 85%). מי?...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li><li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING,+high-resolution+melting+(HRM),+and+next-generation+sequencing+(NGS)+techniques+in+plant+mutation+breeding.">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).</li><li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING.">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single+nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li><li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling.">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li><li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula.">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis.">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li><li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population.">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+rare+mutations+in+populations:+TILLING+by+sequencing.">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li><li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING+by+Sequencing+(TbyS)+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops.">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14 (2017).</li><li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor.">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).</li><li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application:+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations.">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li><li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction.">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li><li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+(HRM)+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes.">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43 (2011).</li><li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+manual+for+physiological+rice.">Laboratory manual for physiological rice.</a> The International Rice Research Institute. , (1976).</li><li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China.">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li><li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+(Oryza+sativa+L.):+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control.">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li><li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting-based+tilling+of+&#947;+ray-induced+mutations+in+rice.">High-resolution melting-based tilling of &#947; ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li><li>Acanda, Y., &#211;scar, M., Prado, M. J., Gonz&#225;lez, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine.">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li><li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+an+HRM-based,+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice.">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li><li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+&#947;+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing.">Frequency and type of inheritable mutations induced by &#947; rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).</li></ol>

לעיבוד קרקע הוכיחה להיות כלי גנטי עוצמה הפוכה לזיהוי מוטציות המושרה עבור ניתוח פונקציונלי גנטי הרבייה יבול. עבור תכונות מסוימות לא בקלות נצפתה או נחוש, לעיבוד קרקע עם זיהוי מוטציה בתפוקה גבוהה PCR המבוסס יכול להיות שיטה שימושית כדי להשיג מוטציות עבור גנים שונים. שיטת "HRM-לעיבוד קרקע" שימש בא...

מוטציות הן משאבים גנטיים חשובים עבור צמח גנומיקה פונקציונלית מחקר ורבייה של זנים חדשים. הגישה הגנטית הקדמי (כלומר מתוך בחירת מוטציה לשכפול גנים או מגוון התפתחות) היתה השיטה העיקרית והבלעדית לשימוש של מוטציות המושרה על 20 שנה לפני. הפיתוח של שיטת גנטיקה הפוכה הרומן, לעיבוד קרקע (כיעד המושרה נגעים מקומיים Genomes) על ידי McCallum ואח '1 פתחה פרדיגמה חדשה והיא הוחלה מאז מספר רב של בעלי חיים ומינים צמח2. לעיבוד קרקע הוא שימושי במיוחד עבור תכונות רבייה כי הם מבחינה טכנית קשה או יקר להיקבע (למשל, עמידות למחלות, תוכן מינרלי).
לעיבוד הקרקע פותחה בתחילה עבור מוטציות פוינט הנגרמת על ידי מוטגנים כימיים (למשל, EMS1,3). הוא כולל את השלבים הבאים: הקמת אוכלוסיית לעיבוד קרקע (ים); ה-DNA הכנה ואיגוד של צמחים בודדים; הגברה של מקטע הדנ א של המטרה הטרודופלקסים היווצרות על ידי דנטורציה וריפוי של הגברה ומחשוף של ה-PCR באמצעות CEL I nuclease; ועל הנגעים המולקולריים. הספציפיים שלהם3,4 עם זאת, שיטה זו עדיין מורכבת יחסית, גוזלת זמן ותפוקה נמוכה. כדי להפוך אותה ליעילה יותר ובעלת תפוקה גבוהה יותר, פותחו שיטות רבות לעיבוד קרקע, כגון מחיקה לעיבוד קרקע (לפני הקרקע) (טבלה 1)1,3,5,6, . שבע,שמונה,תשע,10,11,12
הניתוח HRM עיקול, אשר מבוסס על שינויי הזריחה במהלך המסת ה-DNA דופלקס, הוא פשוט, חסכוני, והתפוקה גבוהה שיטה להקרנה מוטציה ו-הקלדה13. HRM כבר נעשה שימוש נרחב במחקר הצמח כולל מבוסס HRM לעיבוד קרקע (HRM-לעיבוד קרקע) עבור סינון מוטציות SBS הנגרמת על ידי EMS מוטגנזה14. כאן, הצגנו פרוטוקולים מפורטים HRM-לעיבוד קרקע להקרנה של מוטציות (הן Indel ו-SBS) הנגרמת על ידי גמא (γ) קרני אורז.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Taq plus PCR Master Mix</td>
			<td>Tiangen, China</td>
			<td>KT201</td>
			<td>PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Bio-rad, America</td>
			<td>MSP-9651</td>
			<td>Specific plate for PCR in HRM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler nexus</td>
			<td>Eppendorf, German</td>
			<td>6333000073</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td>LCSN-ASY-0011</td>
			<td>For fluorescence sampling and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALL-IT 2.0</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of the fluorescence change</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EvaGreen</td>
			<td>Biotium, USA</td>
			<td>31000-T</td>
			<td>Fluorescence dye of HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>ND2000</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice

היעד המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע) היא אסטרטגיה של גנטיקה הפוכה עבור הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות המושרה. עם זאת, למערכת לעיבוד קרקע יש פחות ישימות לצורך הכנסה/מחיקה (indel) ולעיבוד קרקע מסורתי צריך שלבים מורכבים יותר, כמו העיכול של CEL I נוקלאז ואלקטרופורזה ג'ל. כדי לשפר את יעילות התפוקה והבחירה, וכיצד להפוך את ההקרנה של שני האינדידלים והבסיס היחיד (SBSs) אפשרי, מערכת לעיבוד קרקע מבוססת (HRM) חדשה ברזולוציה גבוהה מפותחת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט HRM-לעיבוד קרקע ולהראות יישום שלה בהקרנה מוטציה. שיטה זו יכולה לנתח את המוטציות של ה-PCR הגברה על ידי מדידת הדנטורציה של דנ א כפול שנתקע בטמפרטורות גבוהות. ניתוח HRM מבוצע ישירות פוסט-PCR ללא עיבוד נוסף. יתר על כן, פשוטה, בטוחה ומהירה (SSF) שיטת הפקת DNA משולב עם HRM-לעיבוד לקרקע כדי לזהות הן Indels ו-SBSs. הפשטות שלה, חוסן ותפוקה גבוהה להפוך אותו שימושי לסריקת מוטציה אורז וגידולים אחרים.

מחקר וסריקה של HRM
בסך הכל, 1,140 במאגר דגימות DNA מ 4,560 M2 שתילים יוצרו ונתון הגברה PCR. שני שברי עם גודל של 195 bp ו 259 bp הוגברה עבור OsLCT1 ו spdt, בהתאמה (שולחן2). רוב הדגימות היו עקומות התכה לא שונה באופן משמעותי מן WT (ΔF < 0.05). עקומות HRM שונה באופן משמעותי מן WT (...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice at JoVE.com

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול המתואר כניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM)-היעד מבוסס המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע). שיטה זו משתמשת שינויים פלואורסצנטית במהלך ההיתוך של דופלקס ה-DNA והוא מתאים הקרנת תפוקה גבוהה של הן הכניסה/מחיקה (Indel) ו-substition בסיס יחיד (SBS).

זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

זה יהיה שימושי למדי עבור תכונות רבייה כי הם מבחינה טכנית קשה או יקר להיקבע, כגון עמידות למחלות, תוכן מינרלי. זו טכניקה די פשוטה, חסכונית ותפוקה גבוהה. כדי להתחיל, למקם ארבעה דיסקים עלה לתוך כל באר של צלחת PCR 96-well.הוסף 50 מיליליטר של מאגר פתרון לתוך כל באר. להקפיא את הצלחת במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לנטרל את הצלחת בטמפרטורת החדר.דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מאגר B לכל באר, ומערבבים היטב על ידי מערבולת. צנטריפוגה הצלחת במשך דקה אחת ב 1, 500 פעמים גרם.לאסוף את העל טבעי כמו DNA עבור PCR. ראשית, השתמש ב- DNA supernatant מתבנית PCR אחת טובה כדי לייעל את טמפרטורת החיטוי. הוסף רייגנטים ומיקרוליטר אחד של דנ"א על-טבעי לתוך כל PCR היטב.מניחים את צינורות PCR בבלוק תרמי בעל יכולת הדרגתית, ומתאימים את תוכנית החימום לפי כתב היד כדי לקבוע את טמפרטורת ההתחסנות האופטימלית עבור כל שבר יעד. בצע אלקטרופורזה עבור מוצר PCR על 1%agarose ג'לים כדי לבדוק אמפיקונס. לקבוע את טמפרטורת חישול אופטימלית המאפשרת הגברה ספציפית של שבר היעד.כדי לבצע ניתוח HRM, לשלב reagents, כולל microliter אחד של צבע פלואורסצנטי 10 פעמים מיקרוליטר אחד של על טבעי DNA בכל באר של לוחות תואמי HRM. בכל לוחית, יש לכלול דגימת הורות אחת מסוג פראי ושליטה שלילית אחת ללא דנ"א. מוסיפים טיפת שמן מינרלי לכל באר כדי למנוע אידוי.לאחר מכן, לאטום את הצלחת עם סרט דבק, צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת. הפעל את PCR באמצעות טמפרטורת חישול ממוטבת. עכשיו, להסיר את סרט דבק מהצלחת, ולהכניס את הצלחת למכונת HRM.בתוכנה, בחר הפעלה חדשה מתפריט הקובץ או לחץ על לחצן הפעל בחלק העליון של המסך. ציין את טמפרטורות ההתחלה והסיום להמסה מ-55 עד 95 מעלות צלזיוס. בחר דגימות לניתוח התכה ברזולוציה גבוהה ואל תכלול דגימות דומות לפקד השלילי.לנרמל את עקומות ההיתוך כדי לקבל את אותה פלואורסצנטיות התחלה וסיום. באופן חזותי, ודאו כי סמני הטמפרטורה המקסימליים המינימליים הנמוכים והתחתונים נמצאים באזור של העקומות. שמור על הדלתא F, הפרש פלואורסצנטיות, רמה בהגדרת ברירת המחדל של 05.מהרשימה בחירת תקנים, בחר את המשתנה הנפוץ לעומת ובחר את הרגישות הרגילה. בחר H12 כדי להשתמש בסוג הפראי כפקד. דגימות עם ערך דלתא F גדול מ 05 נחשבים מכילים צמח מוטנטים.לאחר מכן, בשיטת CTAB, לחלץ DNA מכל אחד מארבעת הצמחים ממאגר המוטנטים עם עקומת ההיתוך שונה באופן משמעותי מסוג הבר. לאחר כימות באמצעות ספקטרופוטומטר, להתאים את ה-DNA עם NanoDrop 2000 לריכוז סופי של כ 25 ננוגרם למיקרוליטר. הוסף 0.4 מיקרוליטרים של פריימרים PCR לתוך דגימת ה-DNA בצינורות PCR, למקם אותם במחזור תרמי, ולהתאים את התוכנית כדי להגביר את שבר היעד.לאחר מכן, שלח את מוצרי PCR לחברה לצורך רצף. לאחר רצף סנגר, להשוות את הנגע המולקולרי על ידי השוואת הרצפים בין הצמח M2 ואת סוג הבר. במחקר זה, סריקה וניתוח HRM של שתילים M2 עבור מוטציות בגנים OsLCT1 או SPDT הראו רוב הדגימות היו עקומות התכה לא שונה באופן משמעותי מסוג הבר עם דלתא F פחות מ 05.המוטנטים הראו עקומות HRM שונות באופן משמעותי עם דלתא Fs גדול מ 05 בטמפרטורות של 90 עד 92 מעלות צלזיוס ו 81.5 עד 83.5 מעלות צלזיוס, בהתאמה. סוג המוטציה ומיקום על הגנים מ 4, 560 שתילים M2 אושרו על ידי כרומטוגרמות רצף. אתר הטרוזיגי עם מוטציה של G ל- A ב 4, 304 זוגות בסיס של OsLCT1 זוהה.נוקליאוטיד אחד בודד הכנסה הופיעה ב 4, 240 זוגות בסיס של OsLCT1, ומחיקה trinucleotide TTC נצפתה בעמדה של 5, 948 כדי 5, 950 זוגות בסיס של SPDT. אני ממטב את ה-PCR לפני ניתוח HRM. הצבע בג'ל קצת מזיק.זכור ללבוש כפפות בעת הפעלת הג'ל.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

ברזולוציה גבוהה ההיתוך PCR עבור המשלים קולטן 1 אורך פולימורפיזם גנוטיפינג: כלי חדשני למחלת אלצהיימר הערכת רגישות גנים

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

השוואה ברזולוציה גבוהה של תדרים קוניוגציה

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...