Name: identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00
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यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (सं. 2016YFD0102103) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No.31701394) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. तैयारी
<ol><li>
जेड-रे mutagenized आबादी का विकास
	<ol>
<li>लगभग 20,000 सूखे चावल के बीजों का इलाज करें (के नमी सामग्री के साथ 14%) एक Japonica चावल लाइन (उदा., DS552) के साथ 137Cs गामा किरणों के साथ 100 Gy (1 Gy/min) में एक $ विकिरण सुविधा (उदा., ?...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li><li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING,+high-resolution+melting+(HRM),+and+next-generation+sequencing+(NGS)+techniques+in+plant+mutation+breeding.">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).</li><li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING.">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single+nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li><li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling.">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li><li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula.">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis.">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li><li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population.">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+rare+mutations+in+populations:+TILLING+by+sequencing.">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li><li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING+by+Sequencing+(TbyS)+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops.">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14 (2017).</li><li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor.">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).</li><li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application:+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations.">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li><li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction.">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li><li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+(HRM)+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes.">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43 (2011).</li><li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+manual+for+physiological+rice.">Laboratory manual for physiological rice.</a> The International Rice Research Institute. , (1976).</li><li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China.">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li><li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+(Oryza+sativa+L.):+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control.">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li><li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting-based+tilling+of+&#947;+ray-induced+mutations+in+rice.">High-resolution melting-based tilling of &#947; ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li><li>Acanda, Y., &#211;scar, M., Prado, M. J., Gonz&#225;lez, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine.">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li><li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+an+HRM-based,+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice.">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li><li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+&#947;+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing.">Frequency and type of inheritable mutations induced by &#947; rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).</li></ol>

TILLING जीन कार्यात्मक विश्लेषण और फसल प्रजनन के लिए प्रेरित उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिक उपकरण साबित हुआ है. कुछ लक्षण आसानी से मनाया या निर्धारित नहीं के लिए, उच्च throughput ...

उत्परिवर्ती संयंत्र कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान और नई किस्मों के प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण आनुवंशिक संसाधन हैं। एक आगे आनुवंशिकी दृष्टिकोण (यानी उत्परिवर्ती चयन से जीन क्लोनिंग या विविधता के विकास के लिए) के बारे में प्रेरित उत्परिवर्तनों के उपयोग के लिए मुख्य और एकमात्र विधि के रूप में इस्तेमाल किया 20 साल पहले. एक उपन्यास रिवर्स आनुवंशिकी विधि का विकास, TILLING (Targeting प्रेरित स्थानीय Lesions जीनोम्स में) McCallum एट अल द्वारा1 एक नया प्रतिमान खोला और यह तब से पशु और संयंत्र प्रजातियों की एक बड़ी संख्या में लागू किया गया है2. TILLING विशेष रूप से लक्षण है कि तकनीकी रूप से मुश्किल है या निर्धारित किया जा करने के लिए महंगा कर रहे हैं प्रजनन के लिए उपयोगी है (उदाहरण के लिए, रोग प्रतिरोध, खनिज सामग्री).
TILLING शुरू में रासायनिक mutagens द्वारा प्रेरित स्क्रीनिंग बिंदु उत्परिवर्तनों के लिए विकसित किया गया था (उदाहरण के लिए, ईएमएस1,3). यह निम्नलिखित कदम शामिल हैं: एक टिलरिंग आबादी की स्थापना (ओं); डीएनए तैयारी और अलग-अलग पौधों का पूलिंग; पीसीआर लक्ष्य डीएनए टुकड़ा के प्रवर्धन; HEteroduplexes गठन विकृतीकरण और पीसीआर amplicons और सीईएल मैं nuclease द्वारा दरार के अनीलन द्वारा; और उत्परिवर्ती व्यक्तियों और उनके विशिष्ट आणविक घावों की पहचान3,4. हालांकि, इस विधि अभी भी अपेक्षाकृत जटिल है, समय लगता है, और कम throughput. इसे और अधिक कुशल और उच्च थ्रूपुट के साथ बनाने के लिए, कई संशोधित टिलिंग विधियों को विकसित किया गया है, जैसे विलोपन टिलिंग (डी-टिलरिंग) (तालिका 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
एचआरएम वक्र विश्लेषण, जो डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने के दौरान फ्लोरोसेंट परिवर्तन पर आधारित है, उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग और जीनोटाइपिंग13के लिए एक सरल, लागत प्रभावी, और उच्च थ्रूपुट विधि है। एचआरएम पहले से ही ईएमएस mutagenesis14द्वारा प्रेरित एसबीएस उत्परिवर्तनों की जांच के लिए एचआरएम आधारित टिलरिंग (एचआरएम-टिलरिंग) सहित संयंत्र अनुसंधान में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम चावल में गामा (जेड) किरणों से प्रेरित उत्परिवर्तनों (दोनों Indel और एसबीएस) की स्क्रीनिंग के लिए विस्तृत HRM-TILLING प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Taq plus PCR Master Mix</td>
			<td>Tiangen, China</td>
			<td>KT201</td>
			<td>PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Bio-rad, America</td>
			<td>MSP-9651</td>
			<td>Specific plate for PCR in HRM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler nexus</td>
			<td>Eppendorf, German</td>
			<td>6333000073</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td>LCSN-ASY-0011</td>
			<td>For fluorescence sampling and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALL-IT 2.0</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of the fluorescence change</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EvaGreen</td>
			<td>Biotium, USA</td>
			<td>31000-T</td>
			<td>Fluorescence dye of HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>ND2000</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice

लक्ष्य प्रेरित स्थानीय Lesions में जीनोम्स (TILLING) प्रेरित उत्परिवर्तनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए रिवर्स आनुवंशिकी की एक रणनीति है. हालांकि, TILLING प्रणाली प्रविष्टि के लिए कम प्रयोज्यता है / विलोपन (इंडेल) का पता लगाने और पारंपरिक TILLING अधिक जटिल कदम की जरूरत है, सीईएल मैं nuclease पाचन और जेल electrophoresis की तरह. थ्रूपुट और चयन दक्षता में सुधार करने के लिए, और दोनों Indels और एकल आधार substitions (SBSs) संभव की स्क्रीनिंग बनाने के लिए, एक नया उच्च संकल्प पिघलने (HRM) आधारित TILLING प्रणाली विकसित की है. यहाँ, हम एक विस्तृत HRM-TILLING प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग में इसके आवेदन को दिखाते हैं। इस विधि उच्च तापमान पर डबल-स्ट्रेंड डीएनए के विकृतीकरण को मापने के द्वारा पीसीआर amplicons के उत्परिवर्तनों का विश्लेषण कर सकते हैं। HRM विश्लेषण सीधे अतिरिक्त संसाधन के बिना पोस्ट-पीसीआर किया जाता है। इसके अलावा, एक सरल, सुरक्षित और तेजी से (एसएसएफ) डीएनए निष्कर्षण विधि दोनों Indels और SBS की पहचान करने के लिए एचआरएम-टिलिंग के साथ एकीकृत है। इसकी सादगी, मजबूती और उच्च थ्रूपुट यह चावल और अन्य फसलों में उत्परिवर्तन स्कैनिंग के लिए संभावित रूप से उपयोगी बनाते हैं।

एचआरएम स्कैनिंग और विश्लेषण
कुल में, 1,140 जमा डीएनए नमूने से 4,560 एम2 अंकुर का उत्पादन किया गया और पीसीआर प्रवर्धन के अधीन. 195 बीपी और 259 बीपी के आकार वाले दो खंडों को क्रमश : OsLCT1 और SPDTके...

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Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

इस आलेख में, हम प्रोटोकॉल जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने विश्लेषण (HRM)-आधारित लक्ष्य प्रेरित स्थानीय Lesions जीनोम्स में (TILLING) के रूप में वर्णित है प्रस्तुत करते हैं। यह विधि डीएनए डुप्लेक्स के पिघलने के दौरान फ्लोरोसेंट परिवर्तन का उपयोग करती है और प्रविष्टि/विलोपन (इंडेल) और एकल आधार सबस्टिशन (एसबीएस) दोनों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है।

चावल की एक लिंग आबादी में पिघल उच्च संकल्प द्वारा उत्परिवर्तनों की पहचान

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

यह उन लक्षणों के प्रजनन के लिए काफी उपयोगी होगा जो तकनीकी रूप से कठिन या महंगे हैं, जैसे रोग प्रतिरोध, खनिज सामग्री। यह एक काफी सरल, लागत प्रभावी, और उच्च थ्रूपुट तकनीक है। शुरू करने के लिए, एक ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में चार पत्ती डिस्क जगह है ।प्रत्येक कुएं में बफर ए सॉल्यूशन के 50 मिलीलीटर जोड़ें। 10 मिनट के लिए एक शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में थाली फ्रीज । फिर, कमरे के तापमान पर प्लेट को डिफ्रीज करें।10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। प्रत्येक कुएं में बफर बी के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, और भंवर से अच्छी तरह से मिलाएं। 1, 500 बार जी पर एक मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रलाइज करें।पीसीआर के लिए डीएनए के रूप में सुपरनिटेंट ले लीजिए। सबसे पहले, एनीलिंग तापमान को अनुकूलित करने के लिए एक साथ पीसीआर टेम्पलेट से डीएनए सुपरनैंट का उपयोग करें। प्रत्येक पीसीआर में रिएजेंट्स और डीएनए सुपरनेट का एक माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें।पीसीआर ट्यूबों को ढाल-सक्षम थर्मल ब्लॉक में रखें, और प्रत्येक लक्ष्य टुकड़े के लिए इष्टतम एनीलिंग तापमान निर्धारित करने के लिए पांडुलिपि के अनुसार हीटिंग प्रोग्राम को समायोजित करें। एम्प्लिकॉन की जांच करने के लिए 1% एगरल्ड जैल पर पीसीआर उत्पाद के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस करें। इष्टतम एनीलिंग तापमान निर्धारित करें जो लक्ष्य टुकड़े के विशिष्ट प्रवर्धन को सक्षम बनाता है।एचआरएम विश्लेषण करने के लिए, आरईएजेंटों को मिलाएं, जिनमें 10 गुना फ्लोरेसेंस डाई का एक माइक्रोलीटर और एचआरएम-संगत प्लेटों के प्रत्येक कुएं में डीएनए सुपरनेटेंट का एक माइक्रोलीटर शामिल है। प्रत्येक प्लेट में, डीएनए के बिना एक जंगली प्रकार के पेरेंटेड नमूना और एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में खनिज तेल की एक बूंद जोड़ें।फिर, चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेट को सील करें, और एक मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। अनुकूलित एनीलिंग तापमान का उपयोग करके पीसीआर चलाएं। अब, चिपकने वाली फिल्म को प्लेट से हटा दें, और प्लेट को एचआरएम मशीन में डालें।सॉफ्टवेयर में, फ़ाइल मेनू से नए रन का चयन करें, या स्क्रीन के शीर्ष पर रन बटन दबाएं। ५५ से ९५ डिग्री सेल्सियस तक पिघलने के लिए शुरू और समाप्त तापमान निर्दिष्ट करें । उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण के लिए नमूनों का चयन करें, और नकारात्मक नियंत्रण के समान नमूनों को बाहर करें।एक ही शुरुआत और समाप्त फ्लोरेसेंस के लिए पिघलने वाले घटता को सामान्य करें। नेत्रहीन पुष्टि करते हैं कि कम न्यूनतम और कम अधिकतम तापमान कर्सर घटता के क्षेत्र में हैं। डेल्टा एफ, फ्लोरेसेंस का अंतर, 05 की डिफ़ॉल्ट सेटिंग में स्तर रखें।मानक चयन सूची से, आम बनाम संस्करण का चयन करें, और सामान्य संवेदनशीलता चुनें। नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार का उपयोग करने के लिए H12 का चयन करें। 05 से अधिक डेल्टा एफ मूल्य वाले नमूनों में उत्परिवर्ती पौधे को शामिल करने के लिए विचार किया जाता है।फिर, सीटीएबी विधि का उपयोग करके, उत्परिवर्ती पूल से चार पौधों में से प्रत्येक से डीएनए निकालें, जिसमें पिघलने की अवस्था जंगली प्रकार से काफी अलग है। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्राकरण के बाद, नैनोड्रॉप 2000 के साथ डीएनए को लगभग 25 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें। पीसीआर ट्यूबों में डीएनए नमूने में पीसीआर प्राइमर के 0.4 माइक्रोलीटर जोड़ें, उन्हें थर्मल साइकिलर में रखें, और लक्ष्य टुकड़े को बढ़ाने के लिए कार्यक्रम को समायोजित करें।इसके बाद पीसीआर प्रोडक्ट्स को सीक्वेंसिंग के लिए किसी कंपनी में भेजें। सेंगर अनुक्रमण के बाद, एम 2 पौधे और जंगली प्रकार के बीच के दृश्यों की तुलना करके आणविक घाव की तुलना करें। इस अध्ययन में, HRM स्कैनिंग और OsLCT1 या SPDT जीन में उत्परिवर्तन के लिए M2 रोपण के विश्लेषण से पता चला ज्यादातर नमूनों को पिघलने घटता था डेल्टा एफ से कम 05 के साथ जंगली प्रकार से काफी अलग नहीं है ।म्यूटेंट ने डेल्टा एफएस के साथ काफी अलग एचआरएम घटता दिखाया जो क्रमशः ९० से ९२ डिग्री सेल्सियस और ८१.५ से ८३.५ डिग्री सेल्सियस के तापमान पर ०५ से अधिक है । 4, 560 एम 2 रोपण से जीन पर उत्परिवर्तन प्रकार और स्थिति अनुक्रमण क्रोमेटोग्राम द्वारा पुष्टि की गई थी। OsLCT1 के 4, ३०४ आधार जोड़े में जी से एक के उत्परिवर्तन के साथ एक विषमता साइट की पहचान की गई थी ।ओसएलसीटी1 के 4, 240 आधार जोड़े में एक एकल न्यूक्लियोटाइड ए प्रविष्टि दिखाई दी, और एसपीडीटी के 5, 948 से 5, 950 आधार जोड़े की स्थिति में टीटीसी ट्राइन्यूक्लियोटाइड विलोपन देखा गया। मैं एचआरएम विश्लेषण से पहले पीसीआर को अनुकूलित करता हूं। जेल में डाई थोड़ी हानिकारक है।जेल चलाते समय दस्ताने पर डालना याद रखें।

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कम्प्लीमेंट रीसेप्टर के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलती पीसीआर 1 लम्बाई पोलीमॉर्फिजिस जीनोटाइपिंग: अल्जाइमर रोग जीन संवेदनशीलता आकलन के लिए एक अभिनव उपकरण

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

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