Name: identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice
Uploaded: 2019-09-02T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2016YFD0102103) e dalla National Natural Science Foundation of China (N. 31701394).

1. Preparativi
<ol><li>
Sviluppo delle popolazioni mutagenizzate a raggi di raggi
	<ol>
<li>Trattare circa 20.000 semi di riso essiccati (con contenuto di umidità di ca. 14%) di una linea di riso japonica (ad esempio, DS552) con 137raggi gamma Cs a 100 Gy (1 Gy/min) in un impianto di irradiazione z (ad esempio, cellula gamma). NOTA: I semi utilizzati per il trattamento devono avere un'elevata redditività (ad esempio, con un tasso di germinazione >85%). La dose di irradi...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).</li><li>Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING,+high-resolution+melting+(HRM),+and+next-generation+sequencing+(NGS)+techniques+in+plant+mutation+breeding.">TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding.</a> Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).</li><li>Till, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+induced+point+mutations+with+high+throughput+TILLING.">Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING.</a> Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single+nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single nucleotide mutation discovery.</a> The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).</li><li>Comai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+discovery+of+DNA+polymorphisms+in+natural+populations+by+Ecotilling.">Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling.</a> The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).</li><li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicagotruncatula.">Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula.</a> Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+arabidopsis.">ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis.</a> Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).</li><li>Colasuonno, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHPLC+technology+for+high-throughput+detection+of+mutations+in+a+durum+wheat+TILLING+population.">DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population.</a> BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+rare+mutations+in+populations:+TILLING+by+sequencing.">Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing.</a> Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).</li><li>Kumar, A. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING+by+Sequencing+(TbyS)+for+targeted+genome+mutagenesis+in+crops.">TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops.</a> Molecular Breeding. 37, 14 (2017).</li><li>Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+detection+of+three+homoeologous+genes+in+wheat+by+High+Resolution+Melting+analysis+and+Mutation+Surveyor.">Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor.</a> BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).</li><li>Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+two+high+through-put+techniques+in+a+novel+application:+detecting+point+mutations+in+large+EMS+mutated+plant+populations.">Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations.</a> Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).</li><li>Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+differentiation+by+analysis+of+DNA+melting+curves+during+the+polymerase+chain+reaction.">Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.</a> Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).</li><li>Lochlainn, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+(HRM)+analysis+is+an+efficient+tool+to+genotype+EMS+mutants+in+complex+crop+genomes.">High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes.</a> Plant Methods. 7, 43 (2011).</li><li>Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+manual+for+physiological+rice.">Laboratory manual for physiological rice.</a> The International Rice Research Institute. , (1976).</li><li>Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers+selection+and+purity+detection+of+major+hybrid+rice+combinations+and+their+parents+in+China.">SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China.</a> Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissues+using+cetyltrimethymmonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide.</a> Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).</li><li>Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revisit+of+mutation+induction+by+gamma+rays+in+rice+(Oryza+sativa+L.):+implications+of+microsatellite+markers+for+quality+control.">A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control.</a> Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).</li><li>Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting-based+tilling+of+&#947;+ray-induced+mutations+in+rice.">High-resolution melting-based tilling of &#947; ray-induced mutations in rice.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).</li><li>Acanda, Y., &#211;scar, M., Prado, M. J., Gonz&#225;lez, M. V., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMS+mutagenesis+and+qPCR-HRM+prescreening+for+point+mutations+in+an+embryogenic+cell+suspension+of+grapevine.">EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine.</a> Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).</li><li>Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+an+HRM-based,+safe+and+high-throughput+genotyping+system+for+photoperiod+sensitive+genic+male+sterility+gene+in+rice.">Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice.</a> Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).</li><li>Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+and+type+of+inheritable+mutations+induced+by+&#947;+rays+in+rice+as+revealed+by+whole+genome+sequencing.">Frequency and type of inheritable mutations induced by &#947; rays in rice as revealed by whole genome sequencing.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).</li></ol>

TILLING si è dimostrato un potente strumento genetico inverso per identificare le mutazioni indotte per l'analisi funzionale genica e l'allevamento delle colture. Per alcuni tratti non facilmente osservabili o determinati, TILLING con rilevamento di mutazioni ad alto contenuto di velocità PCR può essere un metodo utile per ottenere mutanti per diversi geni. Il metodo HRM-TILLING è stato utilizzato nelle popolazioni mutagenizzate Di pomodoro12,grano11 e vine<sup class="x...

I mutanti sono importanti risorse genetiche per la ricerca di genomica funzionale delle piante e l'allevamento di nuove varietà. Un approccio genetico in avanti (cioè dalla selezione mutante alla clonazione genica o allo sviluppo di varietà) era il metodo principale e unico per l'uso di mutazioni indotte circa 20 anni fa. Lo sviluppo di un nuovo metodo di genetica inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) di McCallum et al.1 ha aperto un nuovo paradigma e da allora è stato applicato in un gran numero di specie animali e vegetali2. TILLING è particolarmente utile per l'allevamento di tratti tecnicamente difficili o costosi da determinare (ad esempio, resistenza alle malattie, contenuto minerale).
TILLING è stato inizialmente sviluppato per le mutazioni dei punti di screening indotte da mutageni chimici (ad esempio, EMS1,3). Esso comprende i seguenti passaggi: la creazione di una popolazione/e TILLING; preparazione e raggruppamento del DNA di singole piante; amplificazione PCR del frammento di DNA bersaglio; eterodulessi formazione per denaturazione e annessione di amplificatori PCR e scissione da ceL I nucleasi; e l'identificazione degli individui mutanti e delle loro specifiche lesioni molecolari3,4. Tuttavia, questo metodo è ancora relativamente complesso, richiede tempo e bassa velocità effettiva. Per renderlo più efficiente e con una maggiore produttività, sono stati sviluppati molti metodi TILLING modificati, come la cancellazione DI TILLING (De-TILLING) (Tabella 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
L'analisi della curva HRM, che si basa sui cambiamenti di fluorescenza durante lo scioglimento del DNA duplex, è un metodo semplice, conveniente e ad alta produttività per lo screening delle mutazioni e la genotipizzazione13. HRM è già stato ampiamente utilizzato nella ricerca vegetale tra cui HRM basato SU TILLING (HRM-TILLING) per lo screening delle mutazioni SBS indotte dalla mutagenesi EMS14. Qui, abbiamo presentato protocolli HRM-TILLING dettagliati per lo screening delle mutazioni (sia Indel che SBS) indotti dai raggi gamma (z) nel riso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Taq plus PCR Master Mix</td>
			<td>Tiangen, China</td>
			<td>KT201</td>
			<td>PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Bio-rad, America</td>
			<td>MSP-9651</td>
			<td>Specific plate for PCR in HRM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler nexus</td>
			<td>Eppendorf, German</td>
			<td>6333000073</td>
			<td>PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightScanner</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td>LCSN-ASY-0011</td>
			<td>For fluorescence sampling and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALL-IT 2.0</td>
			<td>Idaho Technology, USA</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of the fluorescence change</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EvaGreen</td>
			<td>Biotium, USA</td>
			<td>31000-T</td>
			<td>Fluorescence dye of HRM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>ND2000</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying mutations by high resolution melting in a tilling population of rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) è una strategia di genetica inversa per lo screening ad alto throughput delle mutazioni indotte. Tuttavia, il sistema TILLING ha meno applicabilità per il rilevamento di inserimento/eliminazione (Indel) e TILLING tradizionale richiede passaggi più complessi, come la digestione di nucleale CEL I e l'elettroforesi gel. Per migliorare la produttività e l'efficienza di selezione, e per rendere possibile lo screening di entrambi gli Indels e le singole sottostizioni di base (SBS), viene sviluppato un nuovo sistema DI fusione ad alta risoluzione (HRM) basato su . Qui, presentiamo un protocollo DETTAGLIATO HRM-TILLING e mostriamo la sua applicazione nello screening delle mutazioni. Questo metodo è in grado di analizzare le mutazioni degli amplificatori PCR misurando la denaturazione del DNA a doppio filamento ad alte temperature. L'analisi HRM viene eseguita direttamente dopo la PCR senza ulteriori elaborazioni. Inoltre, un metodo di estrazione del DNA semplice, sicuro e veloce (SSF) è integrato con HRM-TILLING per identificare sia Indels che SBS. La sua semplicità, robustezza e produttività elevata lo rendono potenzialmente utile per la scansione delle mutazioni nel riso e in altre colture.

Scansione e analisi HRM
In totale, sono stati prodotti e sottoposti ad amplificazione PCR 1.140 campioni di DNA in pool da 4.560 M2. Due frammenti delle dimensioni di 195 bp e 259 bp sono stati amplificati rispettivamente per OsLCT1 e SPDT(tabella2). La maggior parte dei campioni presentava curve di fusione non significativamente diverse da quella del WT (WT & lt; 0,05). Le curve HRM significativamente diverse dal WT (F > 0,05) son...

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Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

In questo articolo, presentiamo il protocollo descritto come ad alta risoluzione di fusione di analisi di fusione (HRM)-based Target Induced Local Lesions In ducedato In genomes (TILLING). Questo metodo utilizza cambiamenti di fluorescenza durante la fusione del DNA duplex ed è adatto per lo screening ad alto throughput di inserimento/eliminazione (Indel) e singola sostituzione di base (SBS).

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Sarebbe abbastanza utile per l'allevamento di tratti tecnicamente difficili o costosi da determinare, come la resistenza alle malattie, il contenuto minerale. È una tecnica abbastanza semplice, economica e ad alta produttività. Per iniziare, posizionare quattro dischi foglia in ogni pozzo di una piastra PCR da 96 po '.Aggiungere 50 millilitri di tampone A soluzione in ogni pozzo. Congelare la piastra in un congelatore Celsius meno 80 gradi per 10 minuti. Quindi, degelare il piatto a temperatura ambiente.Incubare a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 50 microlitri di tampone B ad ogni pozzo e mescolare bene con il vortice. Centrifugare la piastra per un minuto a 1.500 volte g.Raccogli il supernatante come DNA per PCR. In primo luogo, utilizzare il supernatante DNA di un modello PCR per ottimizzare la temperatura di ricottura. Aggiungere reagenti e un microlitro di supernatante di DNA in ogni pozzo PCR.Posizionare i tubi PCR in un blocco termico compatibile con gradiente e regolare il programma di riscaldamento in base al manoscritto per determinare la temperatura di ricottura ottimale per ogni frammento bersaglio. Eseguire l'elettroforesi per il prodotto PCR su gel di agarosio all'1% per esaminare gli ampliconi. Determinare la temperatura di ricottura ottimale che consente un'amplificazione specifica del frammento bersaglio.Per eseguire l'analisi HRM, combinare reagenti, tra cui un microliter di colorante a fluorescenza 10 volte e un microliter del supernatante del DNA in ogni pozzo di piastre compatibili con HRM. In ogni piastra, includere un campione genitore di tipo selvatico e un controllo negativo senza DNA. Aggiungere una goccia di olio minerale ad ogni pozzo per evitare l'evaporazione.Quindi, sigillare la piastra con pellicola adesiva e centrifugare a 1.000 volte g per un minuto. Eseguire la PCR utilizzando la temperatura di ricottura ottimizzata. Ora, rimuovere la pellicola adesiva dalla piastra e inserire la piastra in una macchina HRM.Nel software selezionare Nuova esecuzione dal menu file oppure premere il pulsante Esegui nella parte superiore dello schermo. Specificare le temperature di inizio e di fine per la fusione da 55 a 95 gradi Celsius. Selezionare campioni per l'analisi di fusione ad alta risoluzione ed escludere campioni simili al controllo negativo.Normalizzare le curve di fusione per avere la stessa fluorescenza iniziale e finale. Verificare visivamente che i cursori di temperatura minima e massima inferiore si trovano in una regione delle curve. Mantenere il delta F, differenza di fluorescenza, livello all'impostazione predefinita di 05.Nell'elenco di selezione Standard selezionare la variante comune rispetto alla variante e scegliere la sensibilità normale. Selezionare H12 per utilizzare il tipo jolly come controllo. Si ritiene che i campioni con un valore delta F maggiore di 05 contengano piante mutanti.Quindi, usando un metodo CTAB, estrarre il DNA da ciascuna delle quattro piante dalla piscina mutante con la curva di fusione significativamente diversa dal tipo selvaggio. Dopo la quantificazione utilizzando uno spettrofotometro, regolare il DNA con il NanoDrop 2000 ad una concentrazione finale di circa 25 nanogrammi per microlitro. Aggiungere 0,4 microlitri di primer PCR nel campione di DNA nei tubi PCR, posizionarli in un ciclore termico e regolare il programma per amplificare il frammento bersaglio.Quindi, invia i prodotti PCR a un'azienda per il sequenziamento. Dopo il sequenziamento di Sanger, confrontare la lesione molecolare confrontando le sequenze tra la pianta M2 e il tipo selvaggio. In questo studio, la scansione hrm e l'analisi delle piantine M2 per mutazioni nei geni OsLCT1 o SPDT hanno mostrato che la maggior parte dei campioni aveva curve di fusione non significativamente diverse dal tipo selvaggio con delta F inferiore a 05.I mutanti hanno mostrato curve HRM significativamente diverse con delta Fs superiori a 05 a temperature da 90 a 92 gradi Celsius e da 81,5 a 83,5 gradi Celsius, rispettivamente. Il tipo di mutazione e la posizione sui geni di 4.560 piantine M2 sono stati confermati dai cromatogrammi di sequenziamento. È stato identificato un sito eterozigote con una mutazione da G ad A a 4.304 coppie di basi di OsLCT1.Un singolo inserimento nucleotidico A apparve alle 4.240 coppie di basi di OsLCT1, e fu osservata una cancellazione ttc trinucleotide nella posizione da 5.948 a 5.950 coppie di basi di SPDT. Ottimizzere il PCR prima dell'analisi HRM. Il colorante nel gel è un po 'dannoso.Ricorda di indossare i guanti quando corri il gel.

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