Name: cortisol extraction from sturgeon fin and jawbone matrices
Uploaded: 2019-09-10T13:00:00
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Questo lavoro è stato condotto con il supporto del Programma di Ricerca Cooperativa per l'Agricoltura Scienza & Sviluppo Tecnologico (titolo del progetto: Analisi della produttività del bestiame con il cambiamento climatico, Progetto n. PJ012771), Amministrazione dello sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Inoltre, questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (No. PJ01344604) dell'Animal Nutrition & Physiology Team, Istituto Nazionale di Scienze Animali, RDA, Seoul, Repubblica di Corea. Gli autori riconoscono con gratitudine il CEO dei gesti persiani Mohammad Hassan Salmanzadeh e il suo team, che ha fornito pesce delle tre specie di storione esaminate in questo studio.

Le seguenti procedure e metodi sperimentali sono stati approvati dall'Autorità per il benessere e l'etica degli animali della Kangwon National University, Chuncheon, Repubblica di Corea.
1. Collezione Fin
<ol><li>Catturare delicatamente lo storione usando una rete per ridurre al minimo le lesioni e lo stress.</li>
	<li>Sciacquare il pesce con attenzione con acqua dolce e quindi pulire la superficie del corpo con un asciugamano assorbente prima dell'eutanasia.</li>
	<li>Colpisci la testa del...

<ol>
	<li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol:+a+novel+biomarker+of+hypothalamic-pituitary-+adrenocortical+activity.">Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cortisol+study:+facial+hair+and+nails.">A cortisol study: facial hair and nails.</a> Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).</li><li>Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+analysis+of+cortisol+from+human+and+monkey+hair.">Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).</li><li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques.">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).</li><li>Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+validation+of+measuring+Hanwoo+hair+cortisol+concentration+using+bead+beater+and+surgical+scissors.">Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors.</a> Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wool+cortisol+is+a+better+indicator+of+stress+than+blood+cortisol+in+ewes+exposed+to+heat+stress+and+water+restriction.">Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction.</a> Animal. 8, 128-132 (2014).</li><li>Brossa, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).</li><li>Carbajal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+detection+in+fish+scales+by+enzyme+immunoassay:+biochemical+and+methodological+validation.">Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation.</a> Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).</li><li>Bertotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+matrices+for+cortisol+measurement+in+fish.">Alternative matrices for cortisol measurement in fish.</a> Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).</li><li>Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+dental+cortisol+content:+a+pilot+study.">Embedded dental cortisol content: a pilot study.</a> Endocrinology &amp; Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).</li><li>Pankhurst, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrinology+of+stress+in+fish:+an+environmental+perspective.">The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective.</a> General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).</li><li>Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coat+and+hair+color:+hair+cortisol+and+serotonin+levels+in+lactating+Holstein+cows+under+heat+stress+conditions.">Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions.</a> Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).</li><li>Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+factors+influencing+stress+hormones+in+fish+and+wildlife.">Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife.</a> Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).</li><li>Aerts, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scales+tell+a+story+on+the+stress+history+of+fish.">Scales tell a story on the stress history of fish.</a> PLoS One. 10, e0123411 (2015).</li><li>Heimb&#252;rge, S., Kanitz, E., Otten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+hair+cortisol+for+the+assessment+of+stress+in+animals.">The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals.</a> General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+hair+cortisol+concentrations+from+various+body+sites+and+serum+cortisol+in+Holstein+lactating+cows+and+heifers+during+thermal+comfort+zone.">Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone.</a> Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).</li><li>Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cortisol+in+lake+sturgeon+(Acipenser+fulvescens)+eggs+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).</li><li>SAS. 1999. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).</li><li>Barton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+in+fishes:+a+diversity+of+responses+with+particular+reference+to+changes+in+circulating+corticosteroids.">Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids.</a> Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+hair+and+blood+cortisol+in+sheep+and+dairy+cattle+using+RIA+and+ELISA+assay:+a+comparison.">Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison.</a> Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).</li></ol>

Sturgeon è talvolta chiamato un "fossile vivente" perché ha mostrato pochi adattamenti nel corso dei millenni passati. Il genere storione Acipenser contiene 27 specie che producono caviale; tuttavia, tre specie (beluga, baerii e sevruga) producono la maggior parte dell'approvvigionamento di caviale globale. Gli storioni sono vulnerabili alla pesca eccessiva e alle interferenze nel loro habitat naturale e sono quindi più a rischio di estinzione di qualsiasi altro gruppo di specie. Sturgeon appartiene al più a...

Cortisolo è un indicatore affidabile dello stress animale. L'estrazione del cortisolo fornisce un quadro valido per i ricercatori per monitorare i livelli di stress e modelli generali nei fattori di stress. Ad esempio, studi precedenti hanno condotto la convalida metodologica delle misurazioni del cortisolo dei capelli utilizzando vari metodi in esseri umani1,2, scimmie3,4, bovini5, pecore6, e pesce rosso7,8. Nelle specie ittiche, le misurazioni del cortisolo in matrici come squame, muco cutaneo, feci e sangue9 hanno dimostrato di fornire informazioni sulla salute dei pesci. Quando il campionamento del sangue è problematico o mancano le scale, sono necessarie matrici alternative per l'estrazione del cortisolo. Nei pesci, matrici alternative possono includere la mascella, un tessuto duro simile al dente umano10.
Lo sviluppo di nuove matrici e tecniche convalidate per determinare i livelli di stress del pesce è di particolare interesse per l'industria del caviale, dove lo storione può sperimentare un'esposizione prolungata a fattori di stress ambientale11. Il sesso di storione non può essere determinato prima dei 2 anni di età, e lo storione non ha squame. Poiché il cortisolo si accumula gradualmente in matrici solide durante la fase di crescita2,7,12, i dati di accumulo di cortisolo a lungo termine da matrici dure come pinne e mascelle potrebbero fornire informazioni sullo stress diverse fasi di crescita. Al contrario, i livelli di cortisolo nel sangue forniscono un'istantanea dei livelli di stress al momento della morte e non possono rappresentare con precisione lo stress durante le condizioni di allevamento a lungo termine13,14. Con l'aumento della concorrenza nel mercato dei caviale, nuovi approcci per migliorare le condizioni di stress per la produzione di ovuli più sani tra le specie di storione durante l'allevamento a lungo termine (8-12 anni o più) sono un'area di ricerca sempre più importante. A causa dell'elevato costo dello storione, i campioni raccolti sono estremamente costosi (8.000-15.000 dollari per pesce maturo a seconda delle specie e della fase di crescita), un fattore limitante per i progetti di ricerca. Tuttavia, lo sviluppo di una tecnica appropriata per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione e dalle mascelle potrebbe essere utilmente applicato sia ai sistemi di allevamento ittico che ai pesci selvatici per migliorare la qualità e la raccolta delle uova di storione sia per il consumo che per conservazione.
Oltre a fornire risultati affidabili6, la selezione di un'adeguata tecnica di estrazione del cortisolo è di fondamentale importanza per garantire che altri composti presenti nella matrice durante la preparazione del campione non confondano l'output, il che potrebbe portare a risultati incoerenti. È altrettanto importante determinare se i livelli di cortisolo pinna e mascella sono influenzati dai livelli di ormone nell'acqua circostante. L'Heimbàrge et al.15 ha suggerito che una serie di fattori possono influenzare i livelli di cortisolo tra cui età, sesso, gravidanza, stagione, colore12e regione del corpo da cui il cortisolo viene estratto16. Tuttavia, sono disponibili poche informazioni sugli effetti dei solventi per il lavaggio sull'estrazione del cortisolo nelle matrici del corpo dei pesci8e nessuna su questi effetti nello storione, fatta eccezione per le uova di storione17.
Anche se l'analisi dei livelli di cortisolo di base dalle pinne e dalle ossa mascellari dello storione richiede che il pesce sia eutanasia, questo approccio non comporta le tecniche invasive necessarie per il campionamento del sangue nello storione vivo. I campioni di pinne e mascelle sono facilmente raccolti e l'estrazione da questi tessuti può essere eseguita rapidamente. Allo stesso modo, l'estrazione e l'analisi degli ormoni sono semplici e richiedono poche attrezzature specializzate.
In questo studio, presentiamo una nuova tecnica e facilmente applicata per l'estrazione, il lavaggio e la determinazione del cortisolo dalle pinne di pesce e dalle mascelle, con l'obiettivo di determinare se i livelli di cortisolo misurati da queste matrici possono essere utilizzati in modo affidabile come stress Indicatori. I vantaggi di questa tecnica includono un approccio8 facile e non invasivo, meno variazioni di dati e uscita affidabile1,6,8,17; la tecnica è applicabile alle specie ittiche senza squame come lo storione. La tecnica richiede la macellazione del pesce, la selezione di adeguati solventi di lavaggio2,4, corretta macinazione dei campioni3,5, saggio immunosorbente enzimatico professionale (ELISA) applicazione5,7, e una vasta conoscenza dell'incorporazione di fonti di cortisolo in matrici solide6.
Abbiamo applicato due diversi solventi per il lavaggio (acqua ultrapura e isopropanolo) per ottenere livelli di cortisolo basale nelle pinne da tre specie di storione: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii), e sevruga (A. stellatussa ), in condizioni ambientali standard per ciascuna specie. Le ossa di H. huso furono usate anche per valutare lo stress nello storione. Questo è il primo studio per misurare i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari di storione. I risultati di questo studio forniranno dati comparativi di cortisolo per le specie di storione nella fase di crescita precoce (1 anno) prima della determinazione del sesso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:654px;" width="653">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposal latex surgical gloves</td>
			<td style="width:222px;">Ansell</td>
			<td style="width:137px;">63754090</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platform scale-electronic weighing 100kg</td>
			<td>Baskoolnikoo</td>
			<td>101 EM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipette to deliver up to 24 mL</td>
			<td style="width:222px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:137px;">35-7550</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent reservoirs</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>703459</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zipper storage plastic bag&#160;</td>
			<td>Cleanwrap</td>
			<td>30cm x100m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:222px;">Daejung chemicals &#38; Metals&#160;</td>
			<td style="width:137px;">5035-4400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl alcohol</td>
			<td style="width:222px;">Daejung chemicals &#38; Metals&#160;</td>
			<td style="width:137px;">5558-4100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube rotator- MX-RL-Pro</td>
			<td>DLAB Scientific&#160;</td>
			<td>824-222217777</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>M21518D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; Precision pipette to deliver 15 and 25 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>R25623C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Weighing paper (107 x 210 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-898-12B</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bead beater, 50/60 Hz 2A</td>
			<td style="width:222px;">GeneReach Biotechnology Corp</td>
			<td style="width:137px;">tp0088</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Plate rotator with orbit capable of 500 rpm</td>
			<td style="width:222px;">Hangzhou Miu Instrument&#160;</td>
			<td style="width:137px;">MU-E30-1044</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL</td>
			<td style="width:222px;">Hyundai Micro&#160;</td>
			<td style="width:137px;">H20050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fume hood</td>
			<td>Kwang Dong Industrial</td>
			<td>KD 901-22128175</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-centrifuge capable of 1500 x g</td>
			<td style="width:222px;">Labo Gene</td>
			<td style="width:137px;">&#160;9.900.900.729</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini vortex mixer</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX-3000L&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lotte aluminum foil roll&#160;</td>
			<td>Lotte Aluminum</td>
			<td>B0722X5FK5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital scale</td>
			<td style="width:222px;">Mettler Toledo&#160;</td>
			<td style="width:137px;">&#160;ME204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:222px;">MDM</td>
			<td style="width:137px;">MDM-0110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>REF 2100.N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large fish net</td>
			<td>Pond H2O</td>
			<td>Hoz135&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salivary cortisol kit</td>
			<td>Salimetrics</td>
			<td>1-3002-4</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Bone cutting forceps</td>
			<td>Sankyo</td>
			<td>26-188A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Precision multichannel pipette to deliver 50 &#956;L and 200 &#956;L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>18A68756</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Towel</td>
			<td style="width:222px;">Yuhan Kimberly</td>
			<td style="width:137px;">1707921546</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Tissue paper (107 &#215; 210)</td>
			<td style="width:222px;">Yuhan Kimberly</td>
			<td style="width:137px;">41117</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortisol extraction from sturgeon fin and jawbone matrices

Gli obiettivi di questo studio erano di sviluppare una tecnica per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione utilizzando due solventi di lavaggio (acqua e isopropanolo) e quantificare eventuali differenze nei livelli di cortisolo tra tre specie di storione principali. Le pinne sono state raccolte da 19 storioni sacrificati tra cui sette beluga (Huso huso), sette siberiani (Acipenser baerii), e cinque sevruga (A. stellatus). Gli storioni sono stati raccolti nelle aziende agricole iraniane per 2 anni (2017-2018), e l'analisi dell'estrazione del cortisolo è stata condotta in Corea del Sud (gennaio-febbraio 2019). Le ossa della Mascella di cinque H. huso furono usate anche per l'estrazione del cortisolo. I dati sono stati analizzati utilizzando la procedura glM (General Linear Model) nell'ambiente SAS. I coefficienti di variazione intra-e inter-saggio sono stati rispettivamente di 14,15 e 7,70. In breve, la tecnica di estrazione del cortisolo prevedeva il lavaggio dei campioni (300 x 10 mg) con 3 mL di solvente (acqua ultrapura e isopropanolo) due volte, rotazione a 80 giri/ per 2,5 min, asciugatura d'aria dei campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni, ulteriore i campioni che utilizzano un battitore di perline a 50 Hz per 32 min e li macinano in polvere, applicando 1,5 mL di metanolo alla polvere essiccata (75 x 5 mg) e una rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente con miscelazione continua. Dopo l'estrazione, i campioni sono stati centrifugati (9.500 x g per 10 min), e 1 supernatante mL è stato trasferito in un nuovo tubo di microcentrifuga (1,5 mL), incubato a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo e analizzato tramite l'analisi immunosorante legata agli enzimi (ELISA) . Non sono state osservate differenze nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie o nei livelli di cortisolo a pinna e mascella tra i solventi di lavaggio. I risultati di questo studio dimostrano che la matrice della mascella dello storione è un indicatore di sollecitazione alternativa promettente alle matrici solide.

La tecnica di estrazione del cortisolo pinna presentata è stata sviluppata e confermata in questo studio utilizzando tre specie di storione. I livelli di cortisolo ottenuti utilizzando acqua ultrapura e isopropanolo come solventi per il lavaggio sono stati confrontati (Figura 2). Cortisolo da H. huso mascella ossa è stato esaminato per determinare se gli storioni possono essere utilizzati come matrice alternativa alle pinne. Gli effetti del solvent...

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In questo studio, presentiamo un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalla pinna e mascella delle specie di storione. I livelli di cortisolo di pinna e mascella sono stati ulteriormente esaminati confrontando due solventi per il lavaggio seguiti dai saggi ELISA. Questo studio ha sperimentato la fattibilità del cortisolo mascellare come un nuovo indicatore di stress.

Estrazione di Cortisol da Sturgeon Fin e Matrici Jawbone

The aims of this study were to develop a technique for the extraction of cortisol from sturgeon fins using two washing solvents (water and isopropanol) ...

Il nostro metodo introduce un nuovo indicatore di stress alternativo che potrebbe essere una piattaforma per numerosi studi futuri per misurare il cortisolo in nuove matrici non trame e capelli. I vantaggi di questa tecnica sono la sua semplicità e la sua capacità di essere utilizzato per valutare i livelli di stress anche negli animali macellati. Stabilire una relazione tra alti livelli di cortisolo e animali sani o umani usando questa tecnica può aiutare con la diagnosi di alcune malattie.Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare campioni biologici secolari come questi vecchi fossili per valutare i livelli di stress all'interno della durata del campione. Per l'estrazione del cortisolo, pesare 300 più o meno 10 milligrammi di ciascun campione su una scala analitica digitale con una precisione di 0,0001 prima di posizionare i campioni in singoli tubi conici da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di isopropanolo a ciascun tubo campione e ruotare i tubi a 80 rotazioni al minuto per 2,5 minuti per lavare il cortisolo e rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione esterna.Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente per sette giorni prima di lavare i campioni altre tre volte, come dimostrato utilizzando acqua fresca ultra pura per ogni lavaggio. Pesare 75 più o meno cinque milligrammi di pinne secche o campione di mascella e utilizzare un battitore di perline per macinare finalmente il campione a 50 hertz per 32 minuti. Quindi, consegnare 1,5 millilitri di metanolo a ciascun tubo di pinna in polvere o mascella e posizionare i campioni su un rotatore di tubi a 40 rotazioni al minuto per 18 ore a temperatura ambiente.Dopo l'estrazione del cortisolo, sedimentare i tessuti campione per centrifugazione. E trasferire il millilitro superiore del cortisolo organico giallastro contenente lo strato da ogni campione in singoli tubi micro-centrifugati da 1,5 millilitri. Asciugare i campioni di cortisolo a 38 gradi Celsius in una cappa di fumi durante la notte per evaporare il metanolo.La mattina seguente, aggiungere 400 microlitri di PBS a ciascun tubo e vortice e centrifugare i campioni per raccogliere il cortisolo. Per ELISA Analysis, caricare 25 microlitri di ogni campione di cortisolo standard estratto e controllare in duplicato nei pozzi appropriati di una piastra ELISA da 96 poggi. Caricare 25 microlitri di diluente assay in due pozzi per servire come zero e in ogni pozzo di legame non specifico.Mescolare 15 microlitri di coniugato enzimatico con 24 millilitri di diluente assay e aggiungere 200 microlitri di coniugato ad ogni pozzo. Mescolare la piastra su un rotatore per cinque minuti a 500 rotazioni al minuto. Seguito da un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra quattro volte con 300 microlitri di 1x Wash Buffer per pozzo. Invertire rapidamente la piastra sul lavandino dopo ogni lavaggio per scartare il tampone e soffiare la piastra su una pila di tovaglioli di carta. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di soluzione di substrato TMB ad ogni pozzo e posizionare la piastra sul rotatore per cinque minuti a 500 rotazioni al minuto.Dopo la miscelazione, incubare la piastra per 25 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo. E mescolare il contenuto della piastra sul rotatore per tre minuti a 500 rotazioni al minuto o fino a quando tutti i pozzi sono stati girati dal verde al giallo.Quindi, leggere la densità ottica dei campioni e utilizzare il software a microschede per convertire i livelli di cortisolo in ogni campione in picogrammi per milligrammo. In questa analisi rappresentativa, i livelli di cortisolo tendevano ad essere più elevati nei campioni di pinne lavati con isopropanolo rispetto a quelli lavati con acqua, ma non sono state osservate differenze significative nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie di storione. Non c'è stata alcuna interazione significativa tra solventi di lavaggio e specie di storione.L'esame del cortisolo dalle mascelle H.Huso per determinare se le mascelle di storione possano essere utilizzate come matrice alternativa alle pinne ha rivelato che il solvente di lavaggio non ha avuto effetti significativi sul livello di cortisolo misurato nello storione di H.Huso. Inoltre, i dati hanno rivelato un'elevata somiglianza tra le pinne di tre specie di storioni testate e nelle mascelle H.Huso. È importante utilizzare il battitore di perline per macinare i campioni in polvere fine e utilizzare un kit di dosaggio ELISA commerciale appropriato per una misurazione del cortisolo di successo.Questo metodo può anche essere utilizzato per rilevare il cortisolo nei denti e in altre matrici dure poiché le misurazioni a livello di cortisolo forniscono informazioni importanti su come l'ambiente influisce sulla biologia animale. Il metodo potrebbe essere utilizzato come nuovo approccio per valutare i livelli di cortisolo nei denti da latte dei bambini umani e negli studi endocrinologici pediatrici, psicobiologici, comportamentali, archeologici e forensi.

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