Name: cortisol extraction from sturgeon fin and jawbone matrices
Uploaded: 2019-09-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices at JoVE.com

Este trabalho foi conduzido com o apoio do programa de pesquisa cooperativa de ciência da agricultura & desenvolvimento tecnológico (título do projeto: análise de mudança de produtividade pecuária com mudanças climáticas, projeto n º. PJ012771), administração de desenvolvimento rural, República da Coréia. Além disso, este estudo foi apoiado por uma subvenção (no. PJ01344604) da nutrição animal & equipe de Fisiologia, Instituto Nacional de Zootecnia, RDA, Seul, República da Coréia. Os autores reconhecem com gratidão o CEO do persa gesto Mohammad Hassan Salmanzadeh e sua equipe, que forneceu peixes das três espécies de esturjão examinadas neste estudo.

Os seguintes procedimentos e métodos experimentais foram aprovados pela autoridade de ética e bem-estar dos animais da Universidade Nacional de Kangwon, Chuncheon, República da Coréia.
1. coleção da aleta
<ol><li>Capture o esturjão delicadamente usando uma rede para minimizar ferimento e esforço.</li>
	<li>Enxágüe o peixe cuidadosamente com água fresca e, em seguida, limpe a superfície do corpo com uma toalha absorvente antes da eutanásia.</li>
	<li>Bata a cabeça do peixe usand...

<ol>
	<li>Meyer, J. S., Novak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cortisol:+a+novel+biomarker+of+hypothalamic-pituitary-+adrenocortical+activity.">Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity.</a> Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cortisol+study:+facial+hair+and+nails.">A cortisol study: facial hair and nails.</a> Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).</li><li>Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+analysis+of+cortisol+from+human+and+monkey+hair.">Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).</li><li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques.">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).</li><li>Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+validation+of+measuring+Hanwoo+hair+cortisol+concentration+using+bead+beater+and+surgical+scissors.">Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors.</a> Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wool+cortisol+is+a+better+indicator+of+stress+than+blood+cortisol+in+ewes+exposed+to+heat+stress+and+water+restriction.">Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction.</a> Animal. 8, 128-132 (2014).</li><li>Brossa, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).</li><li>Carbajal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortisol+detection+in+fish+scales+by+enzyme+immunoassay:+biochemical+and+methodological+validation.">Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation.</a> Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).</li><li>Bertotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+matrices+for+cortisol+measurement+in+fish.">Alternative matrices for cortisol measurement in fish.</a> Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).</li><li>Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedded+dental+cortisol+content:+a+pilot+study.">Embedded dental cortisol content: a pilot study.</a> Endocrinology &amp; Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).</li><li>Pankhurst, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrinology+of+stress+in+fish:+an+environmental+perspective.">The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective.</a> General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).</li><li>Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coat+and+hair+color:+hair+cortisol+and+serotonin+levels+in+lactating+Holstein+cows+under+heat+stress+conditions.">Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions.</a> Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).</li><li>Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+factors+influencing+stress+hormones+in+fish+and+wildlife.">Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife.</a> Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).</li><li>Aerts, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scales+tell+a+story+on+the+stress+history+of+fish.">Scales tell a story on the stress history of fish.</a> PLoS One. 10, e0123411 (2015).</li><li>Heimb&#252;rge, S., Kanitz, E., Otten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+hair+cortisol+for+the+assessment+of+stress+in+animals.">The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals.</a> General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+hair+cortisol+concentrations+from+various+body+sites+and+serum+cortisol+in+Holstein+lactating+cows+and+heifers+during+thermal+comfort+zone.">Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone.</a> Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).</li><li>Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cortisol+in+lake+sturgeon+(Acipenser+fulvescens)+eggs+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).</li><li>SAS. 1999. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).</li><li>Barton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+in+fishes:+a+diversity+of+responses+with+particular+reference+to+changes+in+circulating+corticosteroids.">Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids.</a> Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).</li><li>Ghassemi Nejad, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+hair+and+blood+cortisol+in+sheep+and+dairy+cattle+using+RIA+and+ELISA+assay:+a+comparison.">Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison.</a> Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).</li></ol>

O esturjão é às vezes chamado de "fóssil vivo" porque exibiu poucas adaptações ao longo dos últimos milênios. O gênero de esturjão Acipenser contém 27 espécies que produzem caviar; no entanto, três espécies (beluga, baerii e Sevruga) produzem a maior parte do suprimento global de caviar. Esturjão são vulneráveis à sobrepesca e interferência em seu habitat natural e, portanto, são mais criticamente ameaçadas do que qualquer outro grupo de espécies. O esturjão pertence ao grupo o mais velho ...

O cortisol é um indicador fiável do stress animal. Extração de cortisol fornece um quadro válido para os pesquisadores para monitorar os níveis de estresse e padrões gerais em estressores. Por exemplo, estudos prévios realizaram validação metodológica de medições de cortisol capilar utilizando vários métodos em humanos1,2, macacos3,4, bovinos5, ovinos6e Goldfish7,8. Em espécies de peixes, as medições de cortisol em matrizes como escalas, muco cutâneo, fezes e sangue9 foram mostradas para fornecer informações sobre a saúde dos peixes. Quando a amostragem de sangue é problemática ou as escalas faltam, matrizes alternativas para a extração do cortisol são necessários. Em peixes, matrizes alternativas podem incluir o osso maxilar, um tecido duro semelhante ao dente humano10.
O desenvolvimento de novas matrizes e técnicas validadas para determinar os níveis de estresse dos peixes é de particular interesse para a indústria de caviar, onde o esturjão pode experimentar exposição prolongada a fatores de estresse ambiental11. O sexo do esturjão não pode ser determinado antes dos 2 anos de idade, e o esturjão não tem escalas. Porque o cortisol se acumula gradualmente em matrizes sólidas durante a fase de crescimento2,7,12, dados de acumulação de cortisol de longo prazo de matrizes duras, tais como barbatanas e Jawbones poderia fornecer insight sobre o stress níveis em diferentes estágios de crescimento. Em contrapartida, os níveis de cortisol no sangue proporcionam um instantâneo dos níveis de estresse no momento da morte e não podem representar com precisão o estresse durante as condições de criação de longo prazo13,14. Com o aumento da concorrência no mercado de caviar, novas abordagens para melhorar as condições de stress para a produção de ovos mais saudáveis entre as espécies de esturjão durante a criação de longo prazo (8-12 anos ou mais) são uma área cada vez mais importante de pesquisa. Devido ao alto custo do esturjão, as amostras colhidas são extremamente dispendiosas ($ 8000-15000 por peixe maduro, dependendo da espécie e do estágio de crescimento), um fator limitante para projetos de pesquisa. No entanto, o desenvolvimento de uma técnica adequada para a extração de cortisol de barbatanas de esturjão e mandíbula poderia ser aplicado de forma útil tanto para sistemas de piscicultura e em peixes selvagens para melhorar a qualidade e colheita de ovos de esturjão para consumo e Conservação.
Além de fornecer resultados confiáveis6, a seleção de uma técnica de extração de cortisol adequada é de importância crucial para garantir que outros compostos presentes na matriz durante a preparação da amostra não confundir a saída, o que pode levar a resultados inconsistentes. É igualmente importante determinar se os níveis de cortisol da aleta e do Jawbone são influenciados pelos níveis hormonais na água circunvizinha. Heimbürge et al.15 sugeriram que uma série de fatores pode influenciar os níveis de cortisol, incluindo idade, sexo, gravidez, estação, cor12e região do corpo a partir do qual o cortisol é extraído16. No entanto, pouca informação está disponível sobre os efeitos da lavagem de solventes na extração de cortisol em matrizes de corpo de peixe8, e nenhum sobre estes efeitos em esturjão, exceto para os ovos de esturjão17.
Embora a análise dos níveis basais de cortisol das barbatanas e mandíbula do esturjão exija que o peixe seja eutanasiado, essa abordagem não implica as técnicas invasivas necessárias para a amostragem de sangue em esturjão vivo. As amostras da aleta e do Jawbone são coletadas facilmente, e a extração destes tecidos pode ser executada ràpida. Da mesma forma, extração e análise hormonal são simples e exigem pouco equipamento especializado.
Neste estudo, apresentamos uma técnica nova e facilmente aplicada para a extração, lavagem e determinação do cortisol a partir de barbatanas de peixe e mandíbula, com o objetivo de determinar se os níveis de cortisol medidos a partir dessas matrizes podem ser utilizados de forma confiável como estresse Indicadores. As vantagens desta técnica incluem uma abordagem fácil e não invasiva8 , menor variação de dados e saída confiável1,6,8,17; a técnica é aplicável a espécies de peixes sem escalas como o esturjão. A técnica requer abate dopeixe, seleçãode solventes de lavagem apropriados2,4, moagemadequada das amostras3,5, ensaio imunoenzimático profissional (ELISA) aplicação5,7e amplo conhecimento da incorporação de fontes de cortisol em matrizes sólidas6.
Aplicamos dois diferentes solventes de lavagem (água ultrapura e isopropanol) para obter níveis de cortisol basal em barbatanas de três espécies de esturjão: beluga (Huso Huso), Siberian (Acipenser baerii) e Sevruga (A. stellatus ), em condições ambientais padrão para cada espécie. Os Jawbones de H. Huso foram usados igualmente para avaliar o esforço no Sturgeon. Este é o primeiro estudo para medir os níveis de cortisol em mandíbula de esturjão. Os resultados deste estudo proporcionarão dados comparativos de cortisol para espécies de esturjão na fase inicial de crescimento (~ 1 ano) antes da determinação do sexo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:654px;" width="653">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Disposal latex surgical gloves</td>
			<td style="width:222px;">Ansell</td>
			<td style="width:137px;">63754090</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platform scale-electronic weighing 100kg</td>
			<td>Baskoolnikoo</td>
			<td>101 EM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipette to deliver up to 24 mL</td>
			<td style="width:222px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:137px;">35-7550</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagent reservoirs</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>703459</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zipper storage plastic bag&#160;</td>
			<td>Cleanwrap</td>
			<td>30cm x100m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:222px;">Daejung chemicals &#38; Metals&#160;</td>
			<td style="width:137px;">5035-4400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl alcohol</td>
			<td style="width:222px;">Daejung chemicals &#38; Metals&#160;</td>
			<td style="width:137px;">5558-4100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube rotator- MX-RL-Pro</td>
			<td>DLAB Scientific&#160;</td>
			<td>824-222217777</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>M21518D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160; Precision pipette to deliver 15 and 25 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research Plus</td>
			<td>R25623C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Weighing paper (107 x 210 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-898-12B</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bead beater, 50/60 Hz 2A</td>
			<td style="width:222px;">GeneReach Biotechnology Corp</td>
			<td style="width:137px;">tp0088</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Plate rotator with orbit capable of 500 rpm</td>
			<td style="width:222px;">Hangzhou Miu Instrument&#160;</td>
			<td style="width:137px;">MU-E30-1044</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL</td>
			<td style="width:222px;">Hyundai Micro&#160;</td>
			<td style="width:137px;">H20050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fume hood</td>
			<td>Kwang Dong Industrial</td>
			<td>KD 901-22128175</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-centrifuge capable of 1500 x g</td>
			<td style="width:222px;">Labo Gene</td>
			<td style="width:137px;">&#160;9.900.900.729</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini vortex mixer</td>
			<td>LMS</td>
			<td>VTX-3000L&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lotte aluminum foil roll&#160;</td>
			<td>Lotte Aluminum</td>
			<td>B0722X5FK5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital scale</td>
			<td style="width:222px;">Mettler Toledo&#160;</td>
			<td style="width:137px;">&#160;ME204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:222px;">MDM</td>
			<td style="width:137px;">MDM-0110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette tips</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>REF 2100.N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large fish net</td>
			<td>Pond H2O</td>
			<td>Hoz135&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Salivary cortisol kit</td>
			<td>Salimetrics</td>
			<td>1-3002-4</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Bone cutting forceps</td>
			<td>Sankyo</td>
			<td>26-188A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Precision multichannel pipette to deliver 50 &#956;L and 200 &#956;L</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>18A68756</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Towel</td>
			<td style="width:222px;">Yuhan Kimberly</td>
			<td style="width:137px;">1707921546</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:20px;">Tissue paper (107 &#215; 210)</td>
			<td style="width:222px;">Yuhan Kimberly</td>
			<td style="width:137px;">41117</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortisol extraction from sturgeon fin and jawbone matrices

Os objetivos deste estudo foram desenvolver uma técnica para a extração de cortisol a partir de barbatanas de esturjão utilizando dois solventes de lavagem (água e isopropanol) e quantificar quaisquer diferenças nos níveis de cortisol Fin entre três espécies principais de esturjão. As barbatanas foram colhidas de 19 esturjão sacrificados, incluindo sete beluga (Huso Huso), sete siberianos (Acipenser baerii), e cinco Sevruga (A. stellatus). Os esturjão foram levantados em fazendas iranianas por 2 anos (2017-2018), e a análise da extração do cortisol foi conduzida em Coreia sul (janeiro-fevereiro 2019). Os Jawbones de cinco H. Huso foram usados igualmente para a extração do cortisol. Os dados foram analisados utilizando-se o procedimento de modelo linear geral (GLM) no ambiente SAS. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram de 14,15 e 7,70, respectivamente. Resumidamente, a técnica de extração de cortisol envolveu a lavagem das amostras (300 ± 10 mg) com 3 mL de solvente (água ultrapura e isopropanol) duas vezes, rotação a 80 rpm por 2,5 min, secagem de ar as amostras lavadas à temperatura ambiente (22-28 ° c) por 7 dias, secagem adicional as amostras usando um batedor de talão em 50 Hz para 32 min e moagem-los em pó, aplicando 1,5 mL de metanol para o pó seco (75 ± 5 mg), e rotação lenta (40 rpm) para 18 h em temperatura ambiente com mistura contínua. Após a extração, as amostras foram centrifugadas (9.500 x g por 10 min), e 1 ml de sobrenadante foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), incubados a 38 ° c para evaporar o metanol e analisados via ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) . Não foram observadas diferenças nos níveis de cortisol Fin entre as espécies ou nos níveis de cortisol de barbatana e mandíbula entre solventes de lavagem. Os resultados deste estudo demonstram que a matriz do Jawbone do esturjão é um indicador alternativo prometedor do esforço às matrizes contínuas.

A técnica de extração de cortisol Fin apresentada foi desenvolvida e confirmada neste estudo com três espécies de esturjão. Os níveis de cortisol obtidos com água ultrapura e isopropanol como solventes de lavagem foram comparados (Figura 2). O cortisol de H. Huso Jawbones foi examinado para determinar se os Jawbones do esturjão puderam ser usados como uma matriz alternativa às nadadeiras. Os efeitos do solvente de lavagem, espécies de estu...

Watch this Scientific Journal Video about Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices at JoVE.com 

Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices (Video) | JoVE 

Neste estudo, apresentamos um protocolo de extração de cortisol da barbatana e mandíbula de espécies de esturjão. Os níveis do cortisol da aleta e do Jawbone foram examinados mais adicional comparando dois solventes de lavagem seguidos por ensaios de ELISA. Este estudo pilotou a viabilidade do cortisol do Jawbone como um indicador novo do esforço.

Extração de cortisol de matrizes de Sturgeon Fin e Jawbone

The aims of this study were to develop a technique for the extraction of cortisol from sturgeon fins using two washing solvents (water and isopropanol) ...

Nosso método introduz um novo indicador alternativo de estresse que pode ser uma plataforma para inúmeros estudos futuros para medir o cortisol em novas matrizes não parcelas e cabelos. As vantagens dessa técnica são sua simplicidade e sua capacidade de ser usado para avaliar os níveis de estresse mesmo em animais abatidos. Estabelecer uma relação entre altos níveis de cortisol e animais saudáveis ou humanos usando essa técnica pode ajudar no diagnóstico de algumas doenças.Este método também pode ser usado para estudar amostras biológicas centenários, como esses fósseis antigos, para avaliar os níveis de estresse dentro da vida útil da amostra. Para extração de cortisol, pese 300 mais ou menos 10 miligramas de cada amostra em uma escala analítica digital com uma precisão de 0,0001 antes de colocar as amostras em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Adicione três mililitros de isopropanol a cada tubo de amostra e gire os tubos a 80 rotações por minuto durante 2,5 minutos para lavar o cortisol e remover qualquer contaminação externa potencial.Após a última lavagem, o ar seque as amostras à temperatura ambiente por sete dias antes de lavar as amostras mais três vezes, como demonstrado usando água ultra pura fresca para cada lavagem. Pese 75 mais ou menos cinco miligramas de barbatana seca ou amostra de mandíbula e use um batedor de contas para finalmente moer a amostra a 50 hertz por 32 minutos. Em seguida, entregue 1,5 mililitros de metanol em cada tubo de barbatana em pó ou mandíbula e coloque as amostras em um rotador de tubo a 40 rotações por minuto durante 18 horas em temperatura ambiente.Após a extração de cortisol, sedimente os tecidos amostrais por centrifugação. E transfira o mililitro superior do cortisol orgânico amarelado contendo camada de cada amostra em tubos microcentrífugas individuais de 1,5 mililitro. Seque as amostras de cortisol a 38 graus Celsius em um capô de fumaça durante a noite para evaporar o metanol.Na manhã seguinte, adicione 400 microliters de PBS a cada tubo e vórtice e centrífugue as amostras para coletar o cortisol. Para análise ELISA, carregue 25 microlitadores de cada amostra padrão de cortisol extraído e controle em duplicação nos poços apropriados de uma placa ELISA de 96 poços. Carregue 25 microlitres de ensaio diluído em dois poços para servir como zero e em cada poço de ligação não específico.Misture 15 microlitadores de enzima conjugados com 24 mililitros de diluente assay e adicione 200 microliters de conjugado a cada poço. Misture a placa em um rotador por cinco minutos a 500 rotações por minuto. Seguido de uma incubação de uma hora em temperatura ambiente.No final da incubação, lave a placa quatro vezes com 300 microliters de 1x Wash Buffer por poço. Invertendo rapidamente a placa sobre a pia após cada lavagem para descartar o tampão e manchando a placa em uma pilha de toalhas de papel. Após a última lavagem, adicione 200 microliters de solução de substrato TMB a cada poço e coloque a placa no rotador por cinco minutos a 500 rotações por minuto.Após a mistura, incubar a placa por 25 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, adicione 50 microliters de solução stop a cada poço. E misture o conteúdo da placa no rotador por três minutos a 500 rotações por minuto ou até que todos os poços tenham virado de verde para amarelo.Em seguida, leia a densidade óptica das amostras e use o software de microplacão para converter os níveis de cortisol em cada amostra em picogramas por miligrama. Nesta análise representativa, os níveis de cortisol tendem a ser mais elevados em amostras de barbatana lavadas com isopropanol do que nas lavadas com água, mas não foram observadas diferenças significativas nos níveis de cortisol na barbatana entre as espécies de esturjão. Não houve interação significativa entre solventes de lavagem e espécies de esturjão.O exame de cortisol das mandíbulas de H.Huso para determinar se as mandíbulas de esturjão poderiam ser usadas como uma matriz alternativa às barbatanas revelou que o solvente de lavagem não teve nenhum efeito significativo no nível de cortisol medido no esturjão de H.Huso. Além disso, os dados revelaram uma alta semelhança entre as barbatanas de três espécies de esturjão testadas e em mandíbulas H.Huso. É importante usar o batedor de contas para moer as amostras em pó fino e usar um kit comercial de ensaio elisa adequado para uma medição bem sucedida de cortisol.Este método também pode ser usado para detectar cortisol em dentes e outras matrizes duras, pois as medidas de nível de cortisol fornecem informações importantes sobre como o ambiente afeta a biologia animal. O método poderia ser usado como uma nova abordagem para avaliar os níveis de cortisol nos dentes de leite de crianças humanas e em endocrinologia pediátrica, psico biologia, estudos comportamentais, arqueológicos e forenses.

Research

JoVE Journal

Environment

Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices

Helminth Collection and Identification from Wildlife

Helminth Collection and Identification from Wildlife (Video) | JoVE 

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

Ambiente

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions (Video) | JoVE 

Sedimentos Núcleo de corte e extração de Pore Waters sob condições anóxicas

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants (Video) | JoVE 

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR (Video) | JoVE 

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon (Video) | JoVE 

Método alternativo de remoção de otólitos de Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils (Video) | JoVE 

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge (Video) | JoVE 

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA (Video) | JoVE 

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples (Video) | JoVE 

Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis (Video) | JoVE 

Extração de Pesticidas Organoclorados de Pelotização de Plástico e Análise de Tipo de Plástico

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...