Name: introducing a gene knockout directly into the amastigote stage of trypanosoma cruzi using the crispr/cas9 system
Uploaded: 2019-07-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System at JoVE.com

この作品は、JSPS KAKENHI助成金番号18K15141からY.Tまで一部サポートされました。

注:実験フロー全体の概要を図 1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59962/59962fig01.jpg"> 図1:EAを用いたノックアウト実験の概要組織培養由来トリポスチゴテスは、EAに収穫され、EAに分化される. gRNAは、エレクトロポレーションによってCas9発現のアマスティゴテスにトランスフェ...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , (2017).</li><li>Clayton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease+101.">Chagas disease 101.</a> Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).</li><li>Apt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+developing+therapeutic+agents+in+the+treatment+of+Chagas+disease.">Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease.</a> Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).</li><li>Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-induced+disruption+of+paraflagellar+rod+protein+1+and+2+genes+in+Trypanosoma+cruzi+reveals+their+role+in+flagellar+attachment.">CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment.</a> mBio. 6 (4), e01012 (2015).</li><li>Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+single-gene+and+gene+family+disruption+in+Trypanosoma+cruzi.">CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi.</a> mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).</li><li>Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+the+CRISPR/Cas9+system+for+high+efficiency+gene+disruption+in+Trypanosoma+cruzi.">Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi.</a> Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).</li><li>Burle-Caldas, G. A., Soares-Sim&#245;es, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+two+CRISPR-Cas9+genome+editing+protocols+for+rapid+generation+of+Trypanosoma+cruzi+gene+knockout+mutants.">Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants.</a> International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).</li><li>Costa, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolbox+for+Trypanosoma+cruzi:+A+parasite+line+incorporating+a+bioluminescence-fluorescence+dual+reporter+and+streamlined+CRISPR/Cas9+functionality+for+rapid+in+vivo+localisation+and+phenotyping.">Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).</li><li>Soares Medeiros, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Efficiency+Genome+Editing+in+Protozoan+Parasites+Using+CRISPR-Cas9+Ribonucleoproteins.">High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins.</a> mBio. 8 (6), (2017).</li><li>Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axenic+amastigote+system+for+drug+screening.">An axenic amastigote system for drug screening.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).</li><li>Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+culture+of+Leishmania+amastigotes.">Axenic culture of Leishmania amastigotes.</a> Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).</li><li>Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+luciferase+expressing+Leishmania+donovani+axenic+amastigotes+as+primary+model+for+in+vitro+screening+of+antileishmanial+compounds.">Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds.</a> Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).</li><li>N&#252;hs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Novel+Leishmania+donovani+Screening+Cascade+for+High-Throughput+Screening+Using+a+Novel+Axenic+Assay+with+High+Predictivity+of+Leishmanicidal+Intracellular+Activity.">Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).</li><li>De Rycker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+a+high-throughput+high-content+intracellular+Leishmania+donovani+assay+with+an+axenic+amastigote+assay.">Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).</li><li>Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparative+RNA+expression+profiling+of+axenic+and+intracellular+amastigote+forms+of+Leishmania+infantum.">Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).</li><li>Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Sp&#228;th, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteome+profiling+informs+on+phenotypic+traits+that+adapt+Leishmania+donovani+for+axenic+and+intracellular+proliferation.">Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation.</a> Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).</li><li>Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+surface+antigens+expressed+during+the+morphogenesis+of+vertebrate+forms+of+Trypanosoma+cruzi.">Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi.</a> Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).</li><li>Pan, S. 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S., Nussenzweig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amastigotes+of+Trypanosoma+cruzi+sustain+an+infective+cycle+in+mammalian+cells.">Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).</li><li>Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. 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F., Castellani, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+and+chemical+composition+of+Trypanosoma+cruzi.">Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi.</a> Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).</li><li>Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+Functional+Analysis+of+Flagellar+Proteins+in+African+Trypanosomes.">Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes.</a> Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).</li><li>van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+&#8216;intracellular&#8217;+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in &#8216;intracellular&#8217; buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).</li><li>Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+gene+delivery+to+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+through+nucleofection.">Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection.</a> Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).</li><li>Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amastin+mRNA+abundance+in+Trypanosoma+cruzi+is+controlled+by+a+3&#8217;-untranslated+region+position-dependent+cis-element+and+an+untranslated+region-binding+protein.">Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3&#8217;-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).</li><li>Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Gene+Expression+Is+Responsive+to+Starvation+Stress+and+Developmental+Transition+in+Trypanosoma+cruzi.">Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi.</a> mSphere. 1 (2), (2016).</li><li>Chao, D., Dusanic, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+of+the+isolation+of+metacyclic+trypomastigotes+of+Trypanosoma+cruzi+by+DEAE+ion+exchange+chromatography.">Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography.</a> Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).</li><li>Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+selective+lysis+and+purification+of+Trypanosoma+cruzi.">Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi.</a> The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).</li><li>Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+steady-state+transcriptome+of+the+four+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+cruzi.">The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 10, 370 (2009).</li><li>Rico, E., Jeacock, L., Kov&#225;&#345;ov&#225;, J., Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+high-efficiency+CRISPR-Cas9-targeted+gene+editing+and+precision+base+editing+in+African+trypanosomes.">Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+mitochondrial+calcium+uniporter+complex+subunits+in+growth+and+infectivity+of+Trypanosoma+cruzi.">Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi.</a> mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).</li></ol>

我々は、T.クルジアマスティゴテスのアックスカルバチカルが、GRNAをCas9発現EAに直接エレクトロポレートすることにより、CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトで利用できることを実証した。このようにして、amastigote期に特異的に標的遺伝子の本質性は、他の発達段階を経ることなく評価することができる。
アマスティゴットトランスフェクションのもう一つの有益?...

トリパノソマ・クルジは、主にラテンアメリカ1で流行しているシャーガス病の原因となる薬剤である。T. クルジは、昆虫ベクターと哺乳類の宿主2の間を移動する独特のライフサイクルステージを持っています。T.クルジは、血液を吸うトリアトミンバグの中腸内のエピマスチゴテとして複製し、ヒトまたは動物の宿主に沈着する前に、その後腸内の感染性形而上皮トリポマスティゴに分化する。トリポマスティゴテが咬傷部位または粘膜を通して宿主体内に入ると、寄生虫は宿主細胞に侵入し、アマスティゴテと呼ばれるフラゲラレス丸型に変形する。amastigoteは宿主細胞内で複製し、最終的にはトリポマスティゴテに分化し、宿主細胞から破裂し、別の宿主細胞に感染するために血流に入る。
現在利用可能な化学療法剤、ベンズニダゾールおよびニフルティモックスは、有害な副作用を引き起こし、疾患3の慢性相に効果がないため、T.クルジに対する新規な薬物標的を同定することは大きな関心事である。近年、CRISPR/Cas9システムは、GRNAとCas94を含む別個または単一プラスミドのトランスフェクションによって、Cas9およびその後の安定した発現によって、T.クルジで遺伝子ノックアウトを効果的に行う強力なツールとなっています。gRNA 5、6、7またはgRNA8の転写テンプレートの導入、または予形成されたgRNA/Cas9 RNP複合体7、9のエレクトロポレーションによる。この技術の進歩は、シャーガス病の薬物標的研究を加速することが非常に期待されています。
薬剤開発を進めるためには、哺乳類宿主における寄生虫の複製段階であるT.クルジのアマスティゴテにおける標的遺伝子または薬剤候補化合物の有効性を検証することが重要である。しかし、閉塞性宿主細胞が存在するため、アマスティゴットを直接操作することはできないため、これは困難な作業です。リーシュマニアでは、T.クルジに密接に関連する原虫寄生虫、アックスアンスアミゴット培養法が開発され、薬物スクリーニングアッセイ10、11、12、および、 13.アックスアマスティゴテスと細胞内アマスチゴテス14との間の化合物に対する感受性にはいくつかの不一致があるものの、それでもアックス培養を維持する能力は、リーシュマニア15、16の臨床的に関連する段階の基礎生物学。T.クルジの場合、自然発生する細胞外アマスティゴテス(EA)17の存在に関する文献とEA 17、18、19のインビトロ産生何十年も前のことださらに、EAは、トリポスチゴテのそれよりも少ないが、感染能力20を有することが知られており、近年、アマスティゴット宿主侵入のメカニズムが解明されている(Bonfim-Melo et al.21によるレビュー)。しかし、リーシュマニアとは異なり、EAはT.クルジの実験ツールとして利用されていなかった。意味。
最近、我々のグループは、T.クルジのEAを一時的な軸文化22として利用することを提案した。T.クルシトゥラフエン株のアマスティゴテスは、アマスティゴット様特性の大きな劣化または損失なしに最大10日間、37°CでLIT培地中の宿主細胞を含まない複製が可能です。宿主フリー成長期間中、EAは、従来のエレクトロポレーション、トリパノシダル化合物による薬物滴定アッセイ、およびCRISPR/Cas9媒介ノックアウトに続いて成長表現型モニタリングを行い、外因性遺伝子発現に成功しました。本報告では、インビトロ由来EAを生成し、ノックアウト実験でアックスアンマスタゴテを利用するための詳細なプロトコルについて述べた。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% formalin solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>068-03863</td>
			<td>fixing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 double seal cap culture flask</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>3100-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 double seal cap culture flask</td>
			<td>AGC Techno Glass</td>
			<td>3110-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom made</td>
			<td>target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom made</td>
			<td>target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1)</td>
			<td>IDT</td>
			<td>custom made</td>
			<td>target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1072532</td>
			<td>to anneal with crRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector device</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>AAN-1001</td>
			<td>electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Parasite Nucleofector Kit 2</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>VMI-1021</td>
			<td>electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>component of the medium for in-vitro amastigogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker-Turk disposable hemocytometer</td>
			<td>Watson</td>
			<td>177-212C</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>044-29765</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Defined</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>heat-inactivate before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418 Sulfate Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>077-06433</td>
			<td>selection of transformant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-5533</td>
			<td>component of LIT medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver infusion broth, Difco</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>226920</td>
			<td>component of LIT medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>349-01623</td>
			<td>component of the medium for in-vitro amastigogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (&#8211;)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td>
			<td>166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864-10ML</td>
			<td>staining of dead cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1646</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>medium for metacyclogenesis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing a gene knockout directly into the amastigote stage of trypanosoma cruzi using the crispr/cas9 system

トリパノソマ・クルジは、主にラテンアメリカでシャーガス病を引き起こす病原性原虫寄生虫である。T.クルジに対する新しい薬物標的を同定するためには、寄生虫の哺乳動物期における標的遺伝子の本質性を検証することが重要である。T.クルジのアマスティゴットは、宿主細胞内で複製する。したがって、他の発達段階を経ずにノックアウト実験を行うのは困難です。最近、我々のグループは、アマスティゴテのような特性を失うことなく、最大10日間軸を複製することができる成長条件を報告した。この側軸アミスティゴテ培養を用いることで、遺伝子ノックアウトを引き起こすCas9発現アマスティゴテに直接gRNAを導入し、その表現型をアマスティゴテ段階でのみ解析することに成功した。本報告では、インビトロ由来細胞外アマティストを生成し、CRISPR/Cas9媒介ノックアウト実験で軸培養を利用するための詳細なプロトコルについて述べる。ノックアウト・アマスティゴテスの増殖表現型は、軸培養の細胞数、または宿主細胞侵入後の細胞内アマスティゴットの複製によって評価することができる。この方法は、通常、トランスジェニックまたはノックアウト・アマスティゴテの産生に関与する寄生虫段階の分化をバイパスする。時間的軸アマスティゴテ培養の利用は、T.クルジにおけるステージ特異的研究の実験的自由を拡大する可能性を有する。

スイムアウト手順によるトリポマスティゴットの分離
スイムアウト手順によって古いEAを汚染から新鮮なトリポスチゴテスを収穫するには、細胞ペレットを少なくとも1時間インキュベートする必要があります。図2B)。この特定の実験では、最初の混合物におけるトリポマスティゴテの割合は38%であり、泳ぎ後の割合は任意の時点で98%を...

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Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

ここでは、CRISPR/Cas9システムを用いてトリパノノーマ・クルジの細胞外アマスティゴテに遺伝子ノックアウトを導入するプロトコルについて述べた。成長表現型は、アックスアンマスティゴテ培養の細胞カウントまたは宿主細胞侵入後の細胞内アマスティゴテスの増殖のいずれかによって追跡することができる。

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

アマスチゴテは細胞内寄生虫であるため、T.cruziの宿主感染段階を実験に使用することは困難である。私たちの培養技術により、アマスチゴテは宿主細胞の外で一時的に複製することができるので、寄生虫のこの臨床的に関連する段階で直接実験を行うことができます。この手順のデモンストレーションは、当研究所の技術者である「つくつゆえ」です。原稿の指示に従って宿主寄生虫の共文化を維持する。Cas9発現用寄生虫が分化の準備ができたら、上澄み物を円錐形のチューブに集め、顕微鏡下でサンプルの品質を確認します。かなりの数の細胞外アマスチゴがある場合は、トリポマスチゴスを分離するためのスイムアウト手順を実行する。トリポマスチゴトとアマスティゴットの混合物を15分間2、100回G.100回スピンダウンし、上清のほとんどを捨て、チューブに0.5〜1ミリリットルの培地を残します。チューブをゆるくキャップし、ペレットを摂氏37度で1〜2時間インキュベートし、アクティブなトリポマスティゴがペレットから泳ぎ出すことができます。インキュベーション後、トリポマスチゴスを用いて上清を1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。それを回転させ、5ミリリットルのDMEMでペレットを再中断します。寄生虫をT-25培養フラスコに移し、加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素の下で摂氏37度でフラスコをインキュベートする。寄生虫の約95%は24時間後にアマスチゴテに分化する。遠心分離機は、細胞外アマスチゴの培養を2で15分間、100倍G、上清を捨てる。提供された補液を含むエレクトロポレーションバッファーでペレットを再懸濁し、1ミリリットル当たり8番目の細胞に10倍の最終細胞密度を与える。アリコート100マイクロリットルの再懸濁された寄生虫を1.5リットルのマイクロ遠心分離管に。その後、ガイドRNAの5〜10マイクログラムを追加し、ピペットで穏やかに混合します。混合物を2ミリメートルのギャップエレクトロポレーションキュベットに移し、エレクトロポレーション装置とパルスを印加する。次に、キュベットの内容物をT-25フラスコに移し、5ミリリットルのプリウォームリット培地を含み、キャップを緩めたままにし、5%の二酸化炭素の下で37°Cでフラスコをインキュベートする。細胞増殖を、無菌培養の継続または宿主細胞感染後の細胞内アマスチゴとして監視する。細胞の成長をアキセン酸アマスチゴテとしてモニタリングする場合は、フラスコを穏やかに振って細胞外アマスチゴスを溶液中に再懸濁し、培養液の20マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに1マイクロヨウ化プロピジウム溶液と混合する。温度はアマスチゴテの無比増殖を可能にする要因の一つであるため、培養フラスコを必要以上に長く培養器の外に残さなくすることが重要です。試料をヘモサイトメーターに塗布し、蛍光顕微鏡で観察します。次に、ヨウ化プロピジウムによって染色されない生存可能なアマスティゴの数を数える。ノックアウト細胞の増殖を細胞内アマスチゴトとしてモニタリングするために、シードはDMEMを用いた12ウェルプレートに3T3細胞を宿宿する。エレクトロポレーションの翌日、遠心分離によってノックアウトアマスティゴを収集し、上清を捨て、2ミリリットルのDMEMで寄生虫を再中断する。宿主細胞培養液から培地を取り出し、再懸濁したアマスチゴスを加える。2日間、5%の二酸化炭素の下で摂氏37度でプレートをインキュベートし、アマスティゴスが感染を確立できるようにします。2日後、DMEMで宿主細胞の外の細胞外アマスチゴを洗い流し、新鮮なDMEMを加える。さらに2日間インキュベーションを続け、宿主細胞の核と細胞内アマスチゴテを可視化する。必須遺伝子TcCGM1に対してガイドRNAをトランスフェクトしたT.Cruziアマスティゴは、対照群と比較して有意な成長欠陥を示す。細胞内アマスチゴスとしての増殖をモニタリングする場合、T.Cruzi核に関連する宿主核の割合は、コントロールと比較してTcCGM1ノックアウト群において有意に低い。逆に、パラフラフラーロッドタンパク質TcPAR1の1つに対するガイドRNAのトランスフェクションは、4日間の無分離培養後の細胞増殖に有意に影響を及ぼさないか、または細胞内アマスチゴテの増殖を阻害する。しかしながら、感染後5日間、宿主細胞から出てくるトリポマスチゴの数は、対照共培養と比較してTcPAR1ノックアウト共培養において有意に少ない。さらに、対照群の宿主細胞内の分化されたトリポマスチゴスは、ノックアウト群のものよりも活性に見えた。この方法は、ガイドRNAをCas9発現アマスチゴテにトランスフェクトする代わりに、アマスチゴテステージに対する外因性遺伝子の効果を研究するためにも使用でき、プラスミドを野生型アマスチゴテにトランスフェクトして外因性遺伝子を発現させることができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...