Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Denne forskning blev støttet af tilskud fra NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), Kinas National Natural Science Foundation (Grant No. 81860272), den store forsknings plan for provins videnskab og teknologi Foundation i Guangxi ( Giv nr. AB16380219), China postdoc Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) og Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Etisk godkendelse blev givet af det fælles kinesiske universitet i Hongkong — nye territorier East Cluster klinisk forskning etiske komité (reference nummer: 2013,055)
1. PCR amplifikation
<ol><li>Før start skal du fjerne PCR-buffer blanding, prøvefortynder og DNA-prøver (både test-og reference-DNA) (Se tabellen over materialer) fra-20 °c-fryseren og opbevare dem ved stuetemperatur i 20-30 minutter for at sikre, at alle reagenser og DNA er helt optøede. Vortex, og ...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+fragile+X+CGG+repeat+in+females+with+premutation+or+intermediate+alleles.">Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles.</a> American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).</li><li>Fernandez-Carvajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+an+FMR1+grey-zone+allele+to+a+full+mutation+in+two+generations.">Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).</li><li>Terracciano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+to+full+mutation+of+a+FMR1+intermediate+allele+over+two+generations.">Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations.</a> European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).</li><li>Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+FXTAS.">Advances in understanding the molecular basis of FXTAS.</a> Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).</li><li>Juncos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+clinical+findings+in+the+fragile+X-associated+tremor+ataxia+syndrome+(FXTAS).">New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS).</a> Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).</li><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+premutations+in+familial+premature+ovarian+failure.">Fragile X premutations in familial premature ovarian failure.</a> Lancet. 346, 309-310 (1995).</li><li>Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+early+premature+ovarian+failure+in+two+sisters+compound+heterozygous+for+the+FMR1+premutation.">Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation.</a> European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).</li><li>Bourgeois, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fragile+X+premutation+disorders:+expanding+the+psychiatric+perspective.">A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective.</a> Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).</li><li>Farzin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders+and+attention-deficit/hyperactivity+disorder+in+boys+with+the+fragile+X+premutation.">Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation.</a> Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).</li><li>Hantash, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+premutation+carrier+frequency+in+patients+undergoing+routine+population-based+carrier+screening:+insights+into+the+prevalence+of+fragile+X+syndrome,+fragile+X-associated+tremor/ataxia+syndrome,+and+fragile+X-associated+primary+ovarian+insufficiency+in+the+United+States.">FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States.</a> Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).</li><li>Kraan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1-Related+Disorders.">FMR1-Related Disorders.</a> GeneReviews. , (2012).</li><li>Amos Wilson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+characterization+of+16+FMR1+reference+materials:+a+consortium+study.">Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).</li><li>Kwok, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+carriers+of+premutation-size+alleles+of+the+FMRI+gene--and+implications+for+the+population+genetics+of+the+fragile+X+syndrome.">Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).</li><li>Tassone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+CGG+allele+size+and+prevalence+ascertained+through+newborn+screening+in+the+United+States.">FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States.</a> Genome Medicine. 4, 100 (2012).</li><li>Dombrowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premutation+and+intermediate-size+FMR1+alleles+in+10572+males+from+the+general+population:+loss+of+an+AGG+interruption+is+a+late+event+in+the+generation+of+fragile+X+syndrome+alleles.">Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles.</a> Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).</li><li>Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+instability+of+fragile+X+alleles:+implications+for+offering+fragile+X+prenatal+diagnosis.">Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis.</a> Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).</li><li>Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+assays+for+the+fragile+X-related+disorders.">Recent advances in assays for the fragile X-related disorders.</a> Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).</li><li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS er den næstmest almindelige årsag til intellektuel svækkelse efter trisomi 21, der tegner sig for næsten halvdelen af X-linked mental retardering30, som kan forekomme hos ca. 1 ud af 4.000 hanner og 1 ud af 8.000 hunner. Endnu vigtigere, næsten 1 ud af 250 – 1000 kvinder bære en formutation, og denne frekvens er 1 i 250 – 1600 i mænd26,31,32,33. Da risikoe...

Skrøbelige X syndrom (FXS) og skrøbelige X associerede lidelser, f. eks, tremor og ataksi syndrom (FX-TAS), og primær ovarie insufficiens (FX-POI) er primært forårsaget af cytosin-guanin-guanin (CGG) trinucleotid gentagen ekspansion i 5 ' uoversat region (UTR) for den skrøbelige X mental retardering-1 (FMR1) gen på XQ 27.31,2. Det FMR1 kodede protein (fmrp) er et polyribosome-associeret RNA-bindende protein, der fungerer i neuronal udvikling og synaptisk plasticitet ved at regulere alternative splicing, stabilitet og dendritisk transport af mRNA eller moduerende syntese af partielle postsynaptiske proteiner3,4,5,6,7.
Den dynamiske variation med en CGG-gentagelses størrelse på > 200 beskrives som fuld mutation, hvilket inducerer den afvigende hypermethylering og efterfølgende transkriptional hæmning af FMR1 Promoter8. Den deraf følgende fravær eller mangel på FMPS-proteinet forstyrrer normal neuronal udvikling og forårsager FXS9, karakteriseret ved forskellige kliniske symptomer, herunder moderat til svær intellektuel invaliditet, udviklingsmæssige forsinkelser, hyperaktiv adfærd, dårlige kontakter og autistiske manifestationer10,11,12. Præsentationen hos kvindelige FXS patienter er generelt mildere end den hos mænd. CGG-gentagelses størrelsen, der spænder fra 55 til 200 og 45 til 54, klassificeres som henholdsvis præmutation og mellemliggende status. På grund af den høje grad af ustabilitet, CGG gentage størrelse i en premutation eller mellemliggende allel formentlig udvider når overføres fra forældre til afkom13,14. Således er bærere med præmutation alleler i høj risiko for at få børn ramt af FXS på grund af gentagen ekspansion, og i nogle tilfælde kan mellemliggende alleler udvide deres gentagelses størrelse til hele Mutations området over to generationer15, 16. Desuden, mænd med premutation også formidle øget risiko for at udvikle sent-debut fx-tas17,18,19, mens præmutation hunner er disponerede for både fx-tas og fx-POI20, 21,22. For nylig er det blevet rapporteret, at autistiske spektrum lidelser med udviklingsmæssige forsinkelse og problemer i social adfærd er præsenteret hos børn med premutation FMR1 alleler23,24.
For at bestemme den nøjagtige CGG gentagelse størrelse er af stor betydning for klassificering og forudsigelse af FXS og skrøbelige X-associerede lidelser25,26. Historisk, CGG gentage region-specifikke polymerase kædereaktion (PCR) med fragment dimensionering plus Southern blot analyse har været den gyldne standard for Molekylær profil af FMR1 CGG Gentag27. Men, traditionel specifik PCR er mindre følsom over for store præmutationer med mere end 100 til 130 gentagelser og er ude af stand til at forstærke fuld mutationer27,28. Desuden undlader kapillær elektroforese på en traditionel genetisk analysator til gentagen dimensionering at detektere FMR1 PCR-produkter med mere end 200 CGG-gentagelser. Southern blot-analysen gør det muligt at differentiere en bredere vifte af gentagelses størrelser, fra normal til fuld mutation gentagne tal, og er blevet meget brugt til at bekræfte fuld mutationer (hos mænd) og differentiere heterozygot alleler med en fuld mutation fra tilsyneladende homozygot alleler med normale gentagelses størrelser (hos kvinder). Beslutningen om at kvantificere gentagelserne er dog begrænset. Endnu vigtigere er, at denne trin-for-trintest strategi er arbejdskraftintensiv, tidskrævende og omkostningseffektiv.
Her præsenterer vi en nøjagtig og robust PCR-baseret metode til kvantificering af CGG-gentagelserne af FMR1. Det første trin i denne test er PCR-forstærkning af gentagelses sekvenserne i 5 ' UTR for FMR1 -arrangøren ved hjælp af et skrøbeligt X PCR-sæt. PCR-produkterne er renset og fragment dimensionering udføres på et mikrofluidisk kapillar-elektroforese instrument, og efterfølgende fortolkning af antallet af CGG gentages ved hjælp af analysesoftwaren ved at referere til standarder med kendte gentagelser baseret på begrundelse, at PCR fragment længde er direkte proportional med antallet af CGG gentagelser. PCR-systemet omfatter reagenser, der letter amplificeringen af den meget GC-rige trinucleotid-gentagelses region. Denne PCR-baserede analyse er reproducerbar og i stand til at identificere alle intervaller af CGG gentagelser af FMR1 promotorer. Dette er en omkostningseffektiv metode, der kan finde bred anvendelse i molekylær diagnose og screening af FXS og skrøbelige X-relaterede lidelser med mindre turn-around tid og investeringer i udstyr og dermed, kan udnyttes i et bredere spektrum af kliniske Laboratorier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Skrøbelige X syndrom (FXS) og tilknyttede lidelser er forårsaget af udvidelse af cytosin-guanin-guanin (CGG) trinucleotid Gentag i 5 ' ikke oversat region (UTR) af den skrøbelige X mental retardering-1 (FMR1) gene Promoter. Konventionelt, kapillar elektroforese fragment analyse på en genetisk analysator anvendes til dimensionering af CGG gentagelser af FMR1, men yderligere sydlige blot analyse er nødvendig for nøjagtig måling, når gentagelses tallet er højere end 200. Her præsenterer vi en nøjagtig og robust polymerase kædereaktion (PCR)-baseret metode til kvantificering af CGG gentagelser af FMR1. Det første trin i denne test er PCR amplifikation af gentagelses sekvenserne i 5 ' UTR af FMR1 -promotoren ved hjælp af et skrøbeligt X PCR-kit, efterfulgt af rensning af PCR-produkterne og fragment dimensionering på et mikrofluidisk kapillar-elektroforese-instrument, og efterfølgende fortolkning af antallet af CGG gentager ved at referere standarder med kendte gentagelser ved hjælp af Analysis software. Denne PCR-baserede analyse er reproducerbar og i stand til at identificere hele spektret af CGG-gentagelser af FMR1 -promotorer, herunder dem med et gentagelses nummer på mere end 200 (klassificeret som fuld mutation), 55 til 200 (premutation), 46 til 54 (mellemliggende) og 10 til 45 (normal). Det er en omkostningseffektiv metode, der letter klassificeringen af FXS og skrøbelige X-associerede lidelser med robusthed og hurtig rapporteringstid.

Størrelses resultaterne af den formutation kvindelige referenceprøve (NA20240, gentagne størrelser på 30 og 80) og den fulde mutation kvindelige referenceprøve (NA20239, gentagne størrelser på 20 og 200) er vist i henholdsvis figur 1a og figur 1b. Typisk er to markør toppe (nedre markør 50 base Pairs [BP] og øvre markør 10.380 BP) inkluderet i fragment størrelses profilen. Der er normalt en primer kompleks peak med en størrelse på næsten 95 BP. Ge...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En nøjagtig og robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-trinucleotid gentager i den skrøbelige X mental retardering-1-gen letter Molekylær diagnose og screening af skrøbeligt X-syndrom og skrøbelige X-relaterede problemer med kortere tid og investeringer i udstyr.

En robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-Trinucleotid gentages i skrøbelig X mental retardering-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Denne omkostningseffektive metode kan finde brede anvendelser i molekylær diagnose og screening af FXS og Fragile X-relaterede lidelser. Det er hurtigt i ekspeditionstiden og mindre investering i udstyr. Vores PCR-baserede analyse kan lette klassificeringen af hele spektret af FXS og Fragile X-associerede lidelser, herunder mellemliggende, formutation, og fuld mutation med robusthed og hurtig rapportering tid.Proceduren vil blive demonstreret af Weng Chua fra PerkinElmer Singapore. Start med at fjerne PCR buffer mix, prøve fortyndingsposer, og DNA-prøver fra 20 grader Celsius fryser, og lade dem ved stuetemperatur i 20 til 30 minutter at tø op. Før reagenserne skal du bruge vortex og kort dreje dem ned.Koncentrationen af DNA-prøven måles med et spektrofotometer, og fortyndes om nødvendigt til 25 nanogram pr. mikroliter med prøvefortyndingstynding. Mærke brøndene på en PCR-plade for at identificere reference- og testede DNA-prøver og beregne antallet af reaktioner, der er nødvendige for test-, reference- og negative kontrolprøver. Forbered PCR master mix ved at kombinere 15 mikroliter AF PCR buffer mix til 0,6 mikroliter af prøve fortyndingstynd og 0,4 mikroliter af polymerase for hver reaktion.Vortex blandingen og spin det ned. Derefter dispenseres 18 mikroliter af blandingen i hver brønd. Derefter pipette to mikroliter af hver DNA i den relevante godt.Bland reagenserne ved at pipettere op og ned fem gange, og luk derefter pladen. Ansk af pladen i termocymanen, og kør PCR i henhold til håndskriftsanvisningerne. Forvarm inkubatorshakeren til 65 grader Celsius og tilsæt 80 mikroliter 1X TE-buffer til hvert PCR-produkt.Brug en multikanalpipette til at overføre prøverne til en PCR-oprydningsplade og læg pladen i shakeren. Inkuber den ved 65 grader Celsius, mens du ryster ved 1200 RPM i 10 minutter. Efter inkubationen afkøles inkubatorryseren ned til 25 grader Celsius, vakuuminstrumentet indstilles til 250 millibar, og opløsningen aspirere gennem filteret.Efter 15 minutter bør brøndene ikke have væske tilbage. Sluk for vakuum og tilføje 50 mikroliter af 1X TE buffer til hver brønd. Aspirere opløsningen i 10 minutter ved hjælp af de tidligere vakuumindstillinger.Tør bunden af filterpladen ved at trykke den fast på en stak papirservietter og derefter tilføje 20 mikroliter af 1X TE buffer til bunden midten af hver brønd. Anstænker pladen i shakeren og inkuberes ved 25 grader Celsius, mens den rystes ved 1200 omdr./min. i fem minutter. Efter inkubationen overføres mindst 15 mikroliter af det rensede PCR-produkt til en frisk 96 brønd PCR-plade.Før du starter, bringe DNA farvestof koncentrat, DNA gel matrix, DNA markør, DNA stigen, og renset DNA-prøver til stuetemperatur. Opsæt spædstationen ved at udskifte sprøjten og justere bundpladen, slip derefter sprøjteclipsens håndtag og skub den til den øverste position. Start dimensionering software og forberede gel farvestof mix.Vortex farvestoffet koncentrat i 10 sekunder, så drej den ned. Derefter tilsættes 25 mikroliter af farvestoffet til en gel matrix hætteglas og vortex opløsningen til at blande. Overfør gelfarveblandingen til et spinfilter, placer den i centrifugen, og drej den i 10 minutter ved 1500 gange g.Når du er klar til at indlæse gelfarveblandingen, skal du indsætte en ny DNA-chip i primingstationen og tilføje ni mikroliter af gelfarveblandingen i brønden, der er markeret med G.Luk primingstationen, og sørg for, at stemplet er placeret ved et millilitermærke. Tryk sprøjtestempren ned, indtil det holdes af clipsen. Vent i præcis 30 sekunder, og slip derefter klippet.Vent i yderligere fem sekunder, og træk derefter langsomt stemplet tilbage til en milliliterposition. Åbn priming station og tilsæt ni mikroliter af gel farvestof mix i brøndene markeret med G.Add fem mikroliter af markør i godt markeret med en stige symbol og hver af de 12 prøve brønde. Tilføj en mikroliter af stigen til brønden med stigen symbol og en microliter af PCR produkt eller vand til prøven brønde.Vortex chippen i et minut ved 2400 RPM. Sæt den i bioanalyzeren og kør chippen inden for fem minutter. Når kørslen er fuldført, skal du eksportere topdataene som csv-tabelfiler.En formutationshuntingsprøve og en fuld mutationshunneprøve anvendes som referenceprøver. En øvre og nedre markørtop er inkluderet i fragmentstørrelsesprofilen, og der er normalt en primer kompleks top på omkring 95 basepar. Disse referenceprøver bruges til at konstruere en regressionsstandardkurve.Den lineære regressionsstandardkurve bruges derefter til at beregne gentagelsesstørrelser af ukendte prøver. Klinisk normal, mellemliggende, formutation, fuld mutation, og mosaik fuld mutation prøver kan klassificeres korrekt med denne metode. I nogle tilfælde vises kun én top i de mikrofluidiske elektroforeseresultater, hvilket sandsynligvis skyldes tilstedeværelsen af normale homozygot-alleler.En type suboptimalt resultat er baseline bias, som kan være tvetydige eller ufortolkelige, og mistænkes for at være forårsaget af instrumentfejl. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at sikre en passende mængde DNA og kvalitet, før du starter protokollen. FMR1 gensekvensering kan udføres for at identificere AGG afbrydelse mønster.Og methylering-følsomme begrænsning enzym eller bisulfid modifikation assay kan bruges til at overvåge methylering status. Dette er en hurtig, robust og omkostningseffektiv teknik. Det vil hjælpe andre forskere med at gennemføre en befolkningsbaseret undersøgelse af luftfartsselskabet status FXS og Fragile X-associerede lidelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantificering af abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Enkelt dråbe Digital Polymerase Chain Reaction for omfattende og samtidige påvisning af mutationer i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation af genfunktioner i mexicansk Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...