Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het NSFC Emergency Management project (Grant No. 81741004), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), het belangrijkste onderzoeksplan van de provinciale wetenschap en technologiestichting van Guangxi ( Grant No. AB16380219), de China postdoctoral Science Foundation subsidie (Grant No. 2018M630993), en de Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Ethische goedkeuring werd verleend door de joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East cluster klinisch onderzoek ethiek Commissie (referentienummer: 2013,055)
1. PCR-versterking
<ol><li>Verwijder vóór het starten de PCR-buffer mix, monster verdunningsmiddel en DNA-monsters (zowel test-als referentie-DNA) (Zie de tabel met materialen) van de-20 °c vriezer en bewaar ze gedurende 20 – 30 minuten op kamertemperatuur om te controleren of alle reagentia en DNA...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+fragile+X+CGG+repeat+in+females+with+premutation+or+intermediate+alleles.">Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles.</a> American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).</li><li>Fernandez-Carvajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+an+FMR1+grey-zone+allele+to+a+full+mutation+in+two+generations.">Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).</li><li>Terracciano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+to+full+mutation+of+a+FMR1+intermediate+allele+over+two+generations.">Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations.</a> European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).</li><li>Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+FXTAS.">Advances in understanding the molecular basis of FXTAS.</a> Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).</li><li>Juncos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+clinical+findings+in+the+fragile+X-associated+tremor+ataxia+syndrome+(FXTAS).">New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS).</a> Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).</li><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+premutations+in+familial+premature+ovarian+failure.">Fragile X premutations in familial premature ovarian failure.</a> Lancet. 346, 309-310 (1995).</li><li>Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+early+premature+ovarian+failure+in+two+sisters+compound+heterozygous+for+the+FMR1+premutation.">Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation.</a> European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).</li><li>Bourgeois, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fragile+X+premutation+disorders:+expanding+the+psychiatric+perspective.">A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective.</a> Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).</li><li>Farzin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders+and+attention-deficit/hyperactivity+disorder+in+boys+with+the+fragile+X+premutation.">Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation.</a> Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).</li><li>Hantash, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+premutation+carrier+frequency+in+patients+undergoing+routine+population-based+carrier+screening:+insights+into+the+prevalence+of+fragile+X+syndrome,+fragile+X-associated+tremor/ataxia+syndrome,+and+fragile+X-associated+primary+ovarian+insufficiency+in+the+United+States.">FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States.</a> Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).</li><li>Kraan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1-Related+Disorders.">FMR1-Related Disorders.</a> GeneReviews. , (2012).</li><li>Amos Wilson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+characterization+of+16+FMR1+reference+materials:+a+consortium+study.">Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).</li><li>Kwok, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+carriers+of+premutation-size+alleles+of+the+FMRI+gene--and+implications+for+the+population+genetics+of+the+fragile+X+syndrome.">Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).</li><li>Tassone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+CGG+allele+size+and+prevalence+ascertained+through+newborn+screening+in+the+United+States.">FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States.</a> Genome Medicine. 4, 100 (2012).</li><li>Dombrowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premutation+and+intermediate-size+FMR1+alleles+in+10572+males+from+the+general+population:+loss+of+an+AGG+interruption+is+a+late+event+in+the+generation+of+fragile+X+syndrome+alleles.">Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles.</a> Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).</li><li>Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+instability+of+fragile+X+alleles:+implications+for+offering+fragile+X+prenatal+diagnosis.">Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis.</a> Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).</li><li>Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+assays+for+the+fragile+X-related+disorders.">Recent advances in assays for the fragile X-related disorders.</a> Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).</li><li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS is de tweede meest voorkomende oorzaak van verstandelijke beperking na trisomie 21, die bijna de helft van de X-gebonden mentale retardatie30, die ongeveer 1 bij 4.000 mannetjes en 1 in 8.000 vrouwtjes kan treffen. Nog belangrijker is dat bijna 1 op de 250 – 1000 vrouwtjes een premutatie dragen, en deze frequentie is 1 in 250 – 1600 bij mannetjes26,31,32,33. Omda...

Fragiele X syndroom (FXS) en fragiele X geassocieerde aandoeningen, bijvoorbeeld tremor en ataxie syndroom (FX-TAS), en primaire ovariële insufficiëntie (FX-POI) worden voornamelijk veroorzaakt door Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide herhalings uitbreiding in de 5 ' onvertaalde regio (UTR) van het fragiele X Mental Retardation-1 (FMR1) gen op xq 27,31,2. De FMR1 gecodeerd eiwit (FMRP) is een poly ribosome-geassocieerde RNA-bindende proteïne dat functioneert in neuronale ontwikkeling en synaptische plasticiteit door het reguleren van alternatieve splicing, stabiliteit, en dendritische transport van mRNA of modulerende synthese van partiële postsynaptische eiwitten3,4,5,6,7.
De dynamische variatie met een CGG herhalings grootte van > 200 wordt beschreven als volledige mutatie, die de afwijkende hypermethylatie en daaropvolgende transcriptionele uitschakeling van de FMR1 Promoter8induceert. De resulterende afwezigheid of het ontbreken van het FMRP-eiwit verstoort de normale neuronale ontwikkeling en veroorzaakt FXS9, gekenmerkt door verschillende klinische symptomen, waaronder matige tot ernstige verstandelijke handicap, ontwikkelingsachterstand, hyperactieve gedragingen, slechte contacten en autistische manifestaties10,11,12. De presentatie bij vrouwelijke FXS-patiënten is over het algemeen mildere dan die bij mannen. De CGG herhalings grootte variërend van 55 tot 200 en 45 tot 54 zijn geclassificeerd als premutatie en tussenliggende status, respectievelijk. Vanwege de hoge mate van instabiliteit, breidt de CGG-herhalings grootte in een premutatie of intermediair allel vermoedelijk uit wanneer ze worden overgebracht van ouders naar nakomelingen13,14. Zo zijn dragers met premutatie allelen met een hoog risico op het krijgen van kinderen getroffen met FXS vanwege de herhaalde expansie, en in sommige gevallen kunnen intermediaire allelen hun herhalings grootte uitbreiden tot het volledige mutatie bereik van twee generaties15, 16. Bovendien geven mannetjes met premutatie ook een verhoogd risico op het ontwikkelen van Late-onset FX-tas17,18,19, terwijl premutatie vrouwtjes voorbestemd zijn voor zowel FX-tas als FX-POI20, 21,22. Onlangs is gemeld dat autistische spectrum stoornissen met vertraging in de ontwikkeling en problemen in sociaal gedrag worden gepresenteerd bij kinderen met premutatie FMR1 allelen23,24.
Om te bepalen van de exacte CGG REPEAT grootte is van groot belang voor de classificatie en voorspelling van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen25,26. Historisch gezien is de CGG herhalings regiospecifieke polymerase kettingreactie (PCR) met fragment dimensionering plus Southern blot analyse de gouden standaard voor moleculaire profilering van de FMR1 CGG REPEAT27. Traditionele specifieke PCR is echter minder gevoelig voor grote premutaties met meer dan 100 tot 130 herhalingen en is niet in staat om volledige mutaties te versterken27,28. Bovendien kan capillaire elektroforese op een traditionele genetische analysator voor herhaalde dimensionering FMR1 PCR-producten niet detecteren met meer dan 200 CGG-herhalingen. De Southern blot-analyse maakt differentiatie mogelijk van een breder scala aan herhalings grootte, van normale tot volledige mutatie herhalings nummers, en is op grote schaal gebruikt voor het bevestigen van volledige mutaties (bij mannetjes) en het differentiëren van heterozygoot allelen met een volledige mutatie uit blijkbaar homozygoot allelen met normale herhaalde maten (bij vrouwtjes). De resolutie voor het kwantificeren van de herhalingen is echter beperkt. Nog belangrijker is dat deze stapsgewijze teststrategie arbeidsintensieve, tijdrovende en kosten ineffectief is.
Hier presenteren we een accurate en robuuste PCR-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 Promoter met behulp van de FRAGIELE X PCR Kit. De PCR-producten worden gezuiverd en fragment dimensionering wordt uitgevoerd op een microfluïdisch capillair elektroforese instrument, en de daaropvolgende interpretatie van het aantal CGG herhalingen met behulp van de analyse software door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen op basis van de de reden dat de lengte van het PCR-fragment recht evenredig is aan het aantal CGG-herhalingen. Het PCR-systeem omvat reagentia die de versterking van het zeer GC-rijke trinucleotide herhalingsgebied vergemakkelijken. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan alle bereiken van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren. Dit is een kosteneffectieve methode die een brede toepassing kan vinden in de moleculaire diagnostiek en screening van FXS en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met minder turn-around tijd en investeringen in apparatuur en dus kan worden gebruikt in een breder spectrum van klinische Laboratoria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Fragiel X-syndroom (FXS) en geassocieerde aandoeningen worden veroorzaakt door uitbreiding van de Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide REPEAT in de 5 ' onvertaalde regio (UTR) van de fragiele X Mental Retardation-1 (FMR1) Gene Promoter. Conventioneel, capillaire elektroforese fragment analyse op een genetische analysator wordt gebruikt voor de dimensionering van de CGG herhalingen van FMR1, maar extra Southern blot analyse is vereist voor exacte meting wanneer het herhalingsnummer hoger is dan 200. Hier presenteren we een accurate en robuuste polymerase kettingreactie (PCR)-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG-herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ' UTR van de FMR1 -promotor met behulp van een fragiele X PCR-Kit, gevolgd door zuivering van de PCR-producten en fragment dimensionering op een microfluïdisch capillair elektroforese-instrument, en latere interpretatie van het aantal CGG herhalingen door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen met behulp van de analyse software. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan het volledige bereik van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren, waaronder die met een herhaald aantal van meer dan 200 (geclassificeerd als volledige mutatie), 55 tot 200 (premutatie), 46 tot 54 (intermediair) en 10 tot 45 (normaal). Het is een kosteneffectieve methode die de classificatie van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen met robuustheid en snelle rapportage tijd vergemakkelijkt.

De dimensionerings resultaten van het vrouwelijke referentiemonster van de premutatie (NA20240, herhalings grootten van 30 en 80) en het vrouwelijke referentiemonster voor de volledige Mutatie (NA20239, herhalings grootten van 20 en 200) worden respectievelijk weergegeven in Figuur 1a en Figuur 1b. Meestal zijn twee markerings pieken (lagere marker 50 basis paren [BP] en bovenste marker 10.380 BP) opgenomen in het fragment grootte profiel. Er is meestal een prim...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Een nauwkeurige en robuuste polymerase kettinggebaseerde assay test voor het kwantificeren van Cytosine-guanine-guanine trinucleotide herhalingen in het fragiele X mentale retardatie-1 gen vergemakkelijkt de moleculaire diagnose en screening van fragiel X-syndroom en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met kortere turn-around tijd en investering in apparatuur.

Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Deze kosteneffectieve methode kan brede toepassingen vinden in moleculaire diagnose en screening van FXS en Fragile X-gerelateerde aandoeningen. Het is snel in doorlooptijd en minder investeringen in apparatuur. Onze pcr-gebaseerde test kan de classificatie van het volledige spectrum van de FXS en Fragile X-geassocieerde aandoeningen vergemakkelijken, inclusief tussenliggende, premutatie en volledige mutatie met robuustheid en snelle rapportagetijd.De procedure zal worden aangetoond door Weng Chua uit PerkinElmer Singapore. Begin met het verwijderen van de PCR buffer mix, monster verdunningsbedunning, en DNA-monsters uit de 20 graden Celsius vriezer, en laat ze op kamertemperatuur voor 20 tot 30 minuten te ontdooien. Voorafgaand aan het gebruik van de reagentia, vortex en kort draai ze naar beneden.Meet de concentratie van het DNA-monster met een spectrofotometer en verdun deze indien nodig tot 25 nanogram per microliter met monsterverdunningsstof. Label de putten van een PCR-plaat om referentie- en geteste DNA-monsters te identificeren en het aantal reacties te berekenen dat nodig is voor de test-, referentie- en negatieve controlemonsters. Bereid de PCR master mix door het combineren van 15 microliters van PCR buffer mix tot 0,6 microliter monster verdunningsproducten en 0,4 microliter polymerase voor elke reactie.Vortex de mix en draai het naar beneden. Dan afzien van 18 microliter van het mengsel in elke put. Dan pipette twee microliters van elk DNA in de juiste put.Meng de reagentia door vijf keer op en neer te pipetten en sluit de plaat af. Plaats de plaat in de thermocycler en voer de PCR volgens de handschriftaanwijzing. Verwarm de incubatorshaker voor op 65 graden Celsius en voeg 80 microliter 1x TE-buffer toe aan elk PCR-product.Gebruik een multichannel pipet om de monsters over te zetten naar een PCR opschoning plaat en zet de plaat in de shaker. Incubeer het bij 65 graden Celsius terwijl het schudden bij 1200 RPM gedurende 10 minuten. Na de incubatie koelt u de incubatorshaker af tot 25 graden Celsius, stelt u het vacuüminstrument op 250 millibar en zuigt u de oplossing door het filter.Na 15 minuten mogen de putten geen vloeistof meer hebben. Schakel het vacuüm uit en voeg 50 microliters 1X TE-buffer toe aan elke put. De oplossing gedurende 10 minuten aanzuigen met behulp van de vorige vacuüminstellingen.Droog de onderkant van de filterplaat door het stevig op een stapel papieren handdoeken te drukken en voeg vervolgens 20 microliter van 1X TE-buffer toe aan het onderste midden van elke put. Plaats de plaat in de shaker en incubbateren op 25 graden Celsius tijdens het schudden op 1200 RPM gedurende vijf minuten. Breng na de incubatie minstens 15 microliter van het gezuiverde PCR-product over op een verse 96 put PCR-plaat.Breng voor aanvang het DNA-kleurconcentraat, DNA-gelmatrix, DNA-marker, DNA-ladder en gezuiverde DNA-monsters naar kamertemperatuur. Stel het primingstation in door de spuit te vervangen en de bodemplaat aan te passen, laat vervolgens de hendel van de spuitclip los en schuif deze naar de bovenste positie. Start de maatsoftware en bereid de gelverfmix voor.Vortex de kleurstof concentreren voor 10 seconden, dan draai het naar beneden. Voeg vervolgens 25 microliter van de kleurstof toe aan een gelmatrix flacon en vortex de oplossing om te mengen. Breng de gelverfmix over op een spinfilter, plaats het in de centrifuge en draai deze 10 minuten op 1500 keer g.Wanneer u klaar bent om de gelverfmix te laden, plaatst u een nieuwe DNA-chip in het primingstation en voegt u negen microliters van de gelkleurstofmix toe in de put die is gemarkeerd met G.Sluit het primingstation en zorg ervoor dat de zuiger op het merk van één milliliter wordt geplaatst. Druk de spuitzuiger naar beneden totdat deze door de clip wordt vastgehouden. Wacht precies 30 seconden en laat de clip los.Wacht nog vijf seconden, en trek dan langzaam de zuiger terug naar de een milliliter positie. Open het priming station en voeg negen microliters van gel kleurstof mix in de putten gemarkeerd met G.Voeg vijf microliters van marker in de put gemarkeerd met een ladder symbool en elk van de 12 monster putten. Voeg een microliter van de ladder aan de put met de ladder symbool en een microliter van het PCR-product of water aan de monster putten.Vortex de chip voor een minuut op 2400 RPM. Steek het in de bioanalyzer en voer de chip binnen vijf minuten. Wanneer de run is voltooid, exporteert u de piekgegevens als csv-tabelbestanden.Een premutatie vrouwelijk monster en een volledige mutatie vrouwelijk monster worden gebruikt als referentiemonsters. Een bovenste en onderste marker piek zijn opgenomen in het fragment grootte profiel, en er is meestal een primer complexe piek op ongeveer 95 basisparen. Deze referentiemonsters worden gebruikt om een regressiestandaardcurve te maken.De lineaire regressiestandaardcurve wordt vervolgens gebruikt om herhalingsgroottes van onbekende monsters te berekenen. Klinische normale, intermediaire, premutatie, volledige mutatie, en mozaïek volledige mutatie monsters kunnen correct worden ingedeeld met deze methode. In sommige gevallen wordt slechts één piek weergegeven in de microfluïde elektroforeseresultaten, wat waarschijnlijk te wijten is aan de aanwezigheid van normale homozygoot allelen.Een type suboptimaal resultaat is baseline bias, die dubbelzinnig of oninterpreteerbaar kan zijn, en wordt vermoed dat wordt veroorzaakt door instrument storing. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de juiste hoeveelheid DNA en kwaliteit te garanderen voordat u met het protocol begint. FMR1-gensequencing kan worden uitgevoerd om het AGG-onderbrekingspatroon te identificeren.En methylatie-gevoelige beperking enzym of bisulfide modificatie test kan worden gebruikt om de methylatie status te controleren. Dit is een snelle, robuuste en kosteneffectieve techniek. Het zal andere onderzoekers helpen bij het uitvoeren van een populatie-gebaseerde studie over de drager status van FXS en Fragile X-geassocieerde aandoeningen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Één druppel digitale Polymerase-kettingreactie voor alomvattende en gelijktijdige detectie van mutaties in Hotspot regio 's

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...