Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Cette recherche a été appuyée par des subventions du NSFC Emergency Management Project (Grant no 81741004), de la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), du Plan de recherche majeur de la Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Subvention No. AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) et la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

L'approbation éthique a été accordée par le Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (Numéro de référence: 2013.055)
1. Amplification de PCR
<ol><li>Avant de commencer, retirez le mélange tampon PCR, les échantillons de diluant et d'ADN (ADN de test et d'ADN de référence) (voir le tableau des matériaux)du congélateur de -20 oC et gardez-les à température ambiante pendant 20 à 30 min pour s'assurer q...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+fragile+X+CGG+repeat+in+females+with+premutation+or+intermediate+alleles.">Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles.</a> American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).</li><li>Fernandez-Carvajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+an+FMR1+grey-zone+allele+to+a+full+mutation+in+two+generations.">Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).</li><li>Terracciano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+to+full+mutation+of+a+FMR1+intermediate+allele+over+two+generations.">Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations.</a> European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).</li><li>Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+FXTAS.">Advances in understanding the molecular basis of FXTAS.</a> Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).</li><li>Juncos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+clinical+findings+in+the+fragile+X-associated+tremor+ataxia+syndrome+(FXTAS).">New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS).</a> Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).</li><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+premutations+in+familial+premature+ovarian+failure.">Fragile X premutations in familial premature ovarian failure.</a> Lancet. 346, 309-310 (1995).</li><li>Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+early+premature+ovarian+failure+in+two+sisters+compound+heterozygous+for+the+FMR1+premutation.">Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation.</a> European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).</li><li>Bourgeois, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fragile+X+premutation+disorders:+expanding+the+psychiatric+perspective.">A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective.</a> Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).</li><li>Farzin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders+and+attention-deficit/hyperactivity+disorder+in+boys+with+the+fragile+X+premutation.">Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation.</a> Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).</li><li>Hantash, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+premutation+carrier+frequency+in+patients+undergoing+routine+population-based+carrier+screening:+insights+into+the+prevalence+of+fragile+X+syndrome,+fragile+X-associated+tremor/ataxia+syndrome,+and+fragile+X-associated+primary+ovarian+insufficiency+in+the+United+States.">FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States.</a> Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).</li><li>Kraan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1-Related+Disorders.">FMR1-Related Disorders.</a> GeneReviews. , (2012).</li><li>Amos Wilson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+characterization+of+16+FMR1+reference+materials:+a+consortium+study.">Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).</li><li>Kwok, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+carriers+of+premutation-size+alleles+of+the+FMRI+gene--and+implications+for+the+population+genetics+of+the+fragile+X+syndrome.">Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).</li><li>Tassone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+CGG+allele+size+and+prevalence+ascertained+through+newborn+screening+in+the+United+States.">FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States.</a> Genome Medicine. 4, 100 (2012).</li><li>Dombrowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premutation+and+intermediate-size+FMR1+alleles+in+10572+males+from+the+general+population:+loss+of+an+AGG+interruption+is+a+late+event+in+the+generation+of+fragile+X+syndrome+alleles.">Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles.</a> Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).</li><li>Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+instability+of+fragile+X+alleles:+implications+for+offering+fragile+X+prenatal+diagnosis.">Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis.</a> Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).</li><li>Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+assays+for+the+fragile+X-related+disorders.">Recent advances in assays for the fragile X-related disorders.</a> Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).</li><li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS est la deuxième cause la plus fréquente de déficience intellectuelle après la trisomie 21, représentant près de la moitié du retard mental lié à l'X30, qui peut affecter environ 1 homme sur 4 000 et 1 femme sur 8 000. Plus important encore, près d'une femme sur 250 à 1 000 porte une prémutation, et cette fréquence est de 1 sur 250 à 1 600 chez les hommes26,31,32,<sup class="xr...

Le syndrome de L'X fragile (FXS) et les troubles associés à l'X fragile, par exemple, le syndrome des tremblements et de l'ataxie (FX-TAS) et l'insuffisance ovarienne primaire (FX-POI) sont principalement causés par l'expansion du trinuccléotide cytosine-guanine-guanine (CGG) dans le 5' non traduit région (UTR) du fragile X mental retardation-1 (FMR1) gène sur Xq27.31,2. La protéine codée FMR1 (FMRP) est une protéine liant l'ARN associée au polyribosome qui fonctionne dans le développement neuronal et la plasticité synaptique en régulant l'épissage alternatif, la stabilité, et le transport dendritique de l'ARNm ou la synthèse modulatrice des protéines postsynaptiques partielles3,4,5,6,7.
La variation dynamique avec une taille de répétition CGG de 'gt;200 est décrite comme mutation complète, qui induit l'hyperméthylation aberrante et le silençage transcriptionnel suivant du promoteur FMR1 8. L'absence ou l'absence résultante de la protéine FMRP perturbe le développement neuronal normal et cause FXS9, caractérisé par divers symptômes cliniques, y compris une déficience intellectuelle modérée à sévère, retard de développement, comportements hyperactifs, contacts pauvres et manifestations autistiques10,11,12. La présentation dans les patients féminins de FXS est généralement plus douce que cela chez les mâles. La taille de répétition de CGG s'étendant de 55 à 200 et 45 à 54 sont classifiées comme prémutation et statut intermédiaire, respectivement. En raison du degré élevé d'instabilité, la taille de répétition de CGG dans un allèle de prémutation ou intermédiaire se développe vraisemblablement une fois transmise des parents à la progéniture13,14. Ainsi, les porteurs avec des allèles de prémutation sont à haut risque d'avoir des enfants affectés avec FXS en raison de l'expansion répétée, et dans certains cas, les allèles intermédiaires peuvent augmenter leur taille de répétition à la gamme complète de mutation sur deux générations15, 16. En outre, les mâles avec la prémutation transmettent également le risque accru de développer le FX-TAS de tard-de-démarrage17,18,19, tandis que les femelles de prémutation sont prédisposées pour FX-TAS et FX-POI20, 21,22. Récemment, il a été rapporté que les désordres de spectre autistique avec le retard développemental et les problèmes dans les comportements sociaux sont présentés chez les enfants avec des alleles fMR1 de prémutation23,24.
Pour déterminer la taille exacte de répétition de CGG est d'une grande importance pour la classification et la prévision des désordres FXS et X-associés fragiles25,26. Historiquement, la réaction en chaîne de polymérase (PCR) spécifique à la région de CGG avec le dimensionnement de fragment plus l'analyse méridionale de tache ont été l'étalon-or pour le profilage moléculaire de la répétition de FMR1 CGG27. Cependant, pcR spécifique traditionnel est moins sensible aux grandes prémutations avec plus de 100 à 130 répétitions et est incapable d'amplifier les mutations complètes27,28. En outre, l'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique traditionnel pour le dimensionnement répété ne détecte pas les produits FMR1 PCR avec plus de 200 répétitions CGG. L'analyse de tache méridionale permet la différenciation d'une plus large gamme de taille de répétition, des nombres normaux aux nombres complets de répétition de mutation, et a été employée couramment pour confirmer des mutations complètes (chez les mâles) et différencier des allèles hétérozygotes avec une mutation complète de apparemment homozygous alleles avec des tailles normales de répétition (chez les femelles). Cependant, la résolution pour quantifier les répétitions est limitée. Plus important encore, cette stratégie de test étape par étape est laborieuse, longue et inefficace sur le plan des coûts.
Ici, nous présentons une méthode précise et robuste basée sur PCR pour quantifier les répétitions CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétées dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide du kit Fragile X PCR. Les produits PCR sont purifiés et le dimensionnement des fragments est effectué sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions CGG à l'aide du logiciel d'analyse en faisant référence à des normes avec des répétitions connues basées sur le justification que la longueur du fragment de PCR est directement proportionnelle au nombre de répétitions CGG. Le système PCR comprend des réactifs qui facilitent l'amplification de la région de répétition du trinucleotide très riche en GC. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toutes les gammes de répétitions CGG des promoteurs FMR1. Il s'agit d'une méthode rentable qui peut trouver une large application dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des maladies et des troubles liés à l'X fragile avec moins de temps de contournement et d'investissement dans l'équipement et, par conséquent, peut être utilisé dans un plus large éventail de cliniques Laboratoires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Le syndrome de X fragile (FXS) et les désordres associés sont provoqués par l'expansion du cytosine-guanine-guanine (CGG) répétition de trinucleotide dans la région non traduite de 5' (UTR) du retardement mental fragile x-1 (FMR1) promoteur de gène. Traditionnellement, l'analyse de fragment d'électrophoresis capillaire sur un analyseur génétique est utilisée pour le dimensionnement des répétitions CGG de FMR1, mais une analyse supplémentaire de tache méridionale est nécessaire pour la mesure exacte lorsque le nombre de répétition est supérieur à 200. Ici, nous présentons une méthode précise et robuste de réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour quantifier les répétitions de CGG de FMR1. La première étape de ce test est l'amplification PCR des séquences répétitifs dans le 5'UTR du promoteur FMR1 à l'aide d'un kit Fragile X PCR, suivie de la purification des produits PCR et du dimensionnement par fragment sur un instrument d'électrophorèse capillaire microfluidique, et l'interprétation ultérieure du nombre de répétitions cGG en faisant référence à des normes avec des répétitions connues à l'aide du logiciel d'analyse. Cet analyse à base de PCR est reproductible et capable d'identifier toute la gamme des répétitions CGG des promoteurs FMR1, y compris ceux avec un nombre répété de plus de 200 (classés comme mutation complète), 55 à 200 (prémutation), 46 à 54 (intermédiaire), et 10 à 45 (normal). Il s'agit d'une méthode rentable qui facilite la classification des troubles associés au FXS et à l'X fragile avec robustesse et temps de déclaration rapide.

Les résultats de dimensionnement de l'échantillon de référence féminin de prémutation (NA20240, tailles de répétition de 30 et 80) et de l'échantillon de référence féminin de mutation complète (NA20239, tailles de répétition de 20 et 200) sont indiqués dans la figure 1A et la figure 1B,respectivement. En règle générale, deux pics de marqueurs (marqueur inférieur 50 paires de base [bp] et marqueur supérieur 10 380 pb) sont inclus dans le prof...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Un test précis et robuste basé sur la réaction en chaîne de polymérase pour quantifier les répétitions de trinucleotide cytosine-guanine-guanine dans le gène fragile x de retardmental-1 facilite le diagnostic moléculaire et le criblage du syndrome de LX fragile et du X fragile-connexe avec un délai d'attente plus court et des investissements dans l'équipement.

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Cette méthode rentable peut trouver de larges applications dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des troubles liés au S FXS et à l’X fragile. Il est rapide dans le délai d’exécution et moins d’investissement dans l’équipement. Notre analyse basée sur pcr peut faciliter la classification de l’éventail complet des désordres FXS et fragiles X-associés, y compris intermédiaire, prémutation, et mutation complète avec la robustesse et le temps rapide de rapport.La procédure sera démontrée par Weng Chua de PerkinElmer Singapour. Commencez par enlever le mélange tampon PCR, échantillon de diluant et échantillons d’ADN du congélateur de 20 degrés Celsius, et les laisser à température ambiante pendant 20 à 30 minutes pour décongeler. Avant d’utiliser les reagents, vortex et les faire tourner brièvement vers le bas.Mesurez la concentration de l’échantillon d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et, au besoin, diluez-le à 25 nanogrammes par microlitre avec un échantillon diluant. Étiquetez les puits d’une plaque PCR pour identifier les échantillons d’ADN de référence et testés et calculer le nombre de réactions nécessaires pour l’essai, la référence et les échantillons de contrôle négatifs. Préparez le mélange principal pcr en combinant 15 microlitres de mélange tampon PCR à 0,6 microlitres de diluant échantillon et 0,4 microlitres de polymétéase pour chaque réaction.Vortex le mélange et le faire tourner vers le bas. Ensuite, distribuez 18 microlitres du mélange dans chaque puits. Puis pipette deux microlitres de chaque ADN dans le puits approprié.Mélanger les réachemits en faisant monter et descendre cinq fois, puis sceller la plaque. Placez la plaque dans le thermocycleur et exécutez le PCR selon les instructions manuscrites. Préchauffer le shaker de l’incubateur à 65 degrés Celsius et ajouter 80 microlitres de tampon 1X TE à chaque produit PCR.Utilisez une pipette multicanal pour transférer les échantillons dans une plaque de nettoyage PCR et mettre la plaque dans le shaker. Incubez-le à 65 degrés Celsius tout en secouant à 1200 RPM pendant 10 minutes. Après l’incubation, refroidir le shaker de l’incubateur jusqu’à 25 degrés Celsius, régler l’instrument sous vide à 250 millibar et aspirer la solution à travers le filtre.Après 15 minutes, les puits ne devraient pas avoir de liquide restant. Éteignez le vide et ajoutez 50 microlitres de tampon 1X TE à chaque puits. Aspirez la solution pendant 10 minutes en utilisant les paramètres de vide précédents.Séchez le fond de la plaque de filtre en appuyant fermement sur une pile de serviettes en papier, puis ajoutez 20 microlitres de tampon 1X TE au centre inférieur de chaque puits. Placez la plaque dans le shaker et incubez à 25 degrés Celsius tout en secouant à 1200 RPM pendant cinq minutes. Après l’incubation, transférer au moins 15 microlitres du produit PCR purifié dans une plaque PCR fraîche de 96 puits.Avant de commencer, apportez le concentré de colorant d’ADN, la matrice de gel d’ADN, le marqueur d’ADN, l’échelle d’ADN, et les échantillons purifiés d’ADN à la température ambiante. Installez la station d’amorçage en remplaçant la seringue et en ajustant la plaque de base, puis relâchez le levier du clip de seringue et faites-le glisser vers la position supérieure. Démarrez le logiciel de dimensionnement et préparez le mélange de colorant gel.Vortex le concentré de colorant pendant 10 secondes, puis tournez-le vers le bas. Ensuite, ajoutez 25 microlitres du colorant à un flacon matriciel de gel et vortex la solution à mélanger. Transférer le mélange de colorant gel sur un filtre à spin, le placer dans la centrifugeuse, et le faire tourner pendant 10 minutes à 1500 fois g.Lorsque vous êtes prêt à charger le mélange de colorant gel, insérez une nouvelle puce d’ADN dans la station d’amorçage et ajoutez neuf microlitres du mélange de colorant gel dans le puits qui est marqué de G.Fermez la station d’amorçage et assurez-vous que le piston est positionné à la marque d’un millilitre. Appuyez sur le piston seringue vers le bas jusqu’à ce qu’il soit tenu par le clip. Attendez exactement 30 secondes, puis relâchez le clip.Attendez encore cinq secondes, puis tirez lentement le piston vers la position d’un millilitre. Ouvrez la station d’amorçage et ajoutez neuf microlitres de mélange de colorant gel dans les puits marqués de G.Ajoutez cinq microlitres de marqueur dans le puits marqué d’un symbole d’échelle et chacun des 12 puits d’échantillon. Ajouter un microlitre de l’échelle au puits avec le symbole de l’échelle et un microlitre du produit PCR ou de l’eau aux puits de l’échantillon.Vortex la puce pendant une minute à 2400 RPM. Insérez-le dans le bioanalyseur et exécutez la puce dans les cinq minutes. Lorsque l’exécuter est terminé, exportez les données de pointe sous forme de fichiers de table csv.Un échantillon femelle de prémutation et un échantillon femelle à mutation complète sont utilisés comme échantillons de référence. Un pic marqueur supérieur et inférieur est inclus dans le profil de taille du fragment, et il y a habituellement un pic complexe d’amorce à environ 95 paires de base. Ces échantillons de référence sont utilisés pour construire une courbe standard de régression.La courbe standard de régression linéaire est ensuite utilisée pour calculer la taille répétée d’échantillons inconnus. Les échantillons normaux cliniques, intermédiaires, de prémutation, de mutation complète, et de mutation complète de mosaïque peuvent être correctement classifiés avec cette méthode. Dans certains cas, un seul pic est affiché dans les résultats de l’électrophoresis microfluidique, ce qui est probablement dû à la présence d’allèles homozygotes normaux.Un type de résultat sous-optimal est le biais de base, qui peut être ambigu ou non interprète, et est soupçonné d’être causé par un mauvais fonctionnement de l’instrument. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’assurer une quantité appropriée d’ADN et de qualité avant de commencer le protocole. Le séquençage du gène FMR1 peut être effectué pour identifier le modèle d’interruption AGG.Et l’enzyme de restriction méthylation-sensible ou l’essai de modification de bisulfide peut être employé pour surveiller l’état de méthylation. Il s’agit d’une technique rapide, robuste et rentable. Il aidera d’autres chercheurs à mener une étude basée sur la population sur l’état porteur de FXS et de troubles fragiles associés à l’X.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Amélioration de la Polymerase Chain Reaction restriction Fragment Length Polymorphism génotypage de Pufferfish Toxique par chromatographie liquide / spectrométrie de masse

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Recherche

Génétique

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifier la pigmentation abdominale dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR induite par la réorganisation de la Structure de la chromatine boucle

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Gène candidat essais dans des études de cohortes cliniques avec génotypage multiplexé et spectrométrie de masse

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...