Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Diese Forschung wurde durch Stipendien des NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), des Großen Forschungsplans der Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Grant-Nr. AB16380219), dem China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) und der Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Die ethische Zulassung wurde von der Joint Chinese University of Hong Kong–New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee erteilt (Referenznummer: 2013.055)
1. PCR-Verstärkung
<ol><li>Entfernen Sie vor dem Start PCR-Puffermischung, Probenverdünnungs- und DNA-Proben (sowohl Test- als auch Referenz-DNA) (siehe Materialtabelle)aus dem Gefrierschrank von -20 °C und halten Sie sie 20–30 min bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien und D...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS ist die zweithäufigste Ursache für geistige Beeinträchtigung nach Trisomie 21, die für fast die Hälfte der X-verknüpften mentalen Retardierung30, die etwa 1 von 4.000 Männern und 1 von 8.000 Frauen betreffen kann. Noch wichtiger ist, fast 1 von 250–1.000 Weibchen tragen eine Vormutation, und diese Häufigkeit ist 1 in 250–1.600 bei Männern26,31,32,33. Da ...

Fragiles X-Syndrom (FXS) und fragile X-assoziierte Erkrankungen, z. B. Tremor- und Ataxie-Syndrom (FX-TAS), und primäre Ovarialinsuffizienz (FX-POI) werden hauptsächlich durch Cytosin-Guanin-Guanin (CGG) Trinukleotid-Wiederholungsexpansion in der 5' unübersetzten (UTR) des fragilen X-Gens für geistige Retardierung-1 (FMR1) auf Xq27.31,2. Das FMR1-kodierte Protein (FMRP) ist ein polyribosom-assoziiertes RNA-bindendes Protein, das in der neuronalen Entwicklung und synaptischen Plastizität funktioniert, indem es alternative Spleiß-, Stabilitäts- und dendritische Transporte von mRNA oder modulierender Synthese reguliert. von partiellen postsynaptischen Proteinen3,4,5,6,7.
Die dynamische Variation mit einer CGG-Wiederholungsgröße von >200 wird als vollständige Mutation beschrieben, die die aberrante Hypermethylierung und die anschließende Transkriptionssilencing des FMR1-Promotors 8induziert. Das daraus resultierende Fehlen oder Fehlen des FMRP-Proteins stört die normale neuronale Entwicklung und verursacht FXS9, gekennzeichnet durch verschiedene klinische Symptome, einschließlich mittelschwerer bis schwerer geistiger Behinderung, Entwicklungsverzögerung, hyperaktives Verhalten, schlechte Kontakte und autistische Manifestationen10,11,12. Die Darstellung bei weiblichen FXS-Patienten ist in der Regel milder als bei Männern. Die CGG-Wiederholungsgröße von 55 bis 200 bzw. 45 bis 54 wird als Vormutation bzw. Zwischenstatus klassifiziert. Aufgrund des hohen Grades an Instabilität dehnt sich die CGG-Wiederholungsgröße in einem Vormutations- oder Zwischenallel vermutlich aus, wenn sie von den Eltern auf den Nachwuchs übertragen wird13,14. So sind Träger mit Prämutationsallelen aufgrund der wiederholten Expansion einem hohen Risiko ausgesetzt, Kinder mit FXS zu haben, und in einigen Fällen können Zwischenallele ihre Wiederholungsgröße über zwei Generationen auf den vollen Mutationsbereich ausdehnen15, 16. Darüber hinaus vermitteln Männchen mit Vormutation auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von FX-TAS17,18,19, während Prämutationsweibchen sowohl für FX-TAS als auch FX-POI20prädisponiertsind, 21,22. Kürzlich wurde berichtet, dass autistische Spektrumstörungen mit Entwicklungsverzögerung und Probleme im Sozialen Verhalten bei Kindern mit Vormutation FMR1-Alleles 23,24dargestellt werden.
Um die genaue CGG-Wiederholungsgröße zu bestimmen, ist von großer Bedeutung für die Klassifizierung und Vorhersage der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen25,26. Historisch gesehen war die CGG-Repeat-regionsspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Fragmentgrößen- und Südfleckanalyse der Goldstandard für die molekulare Profilierung der FMR1 CGG-Wiederholung27. Herkömmliche spezifische PCR ist jedoch weniger empfindlich gegenüber großen Vormutationen mit mehr als 100 bis 130 Wiederholungen und ist nicht in der Lage, vollständige Mutationen zu verstärken27,28. Darüber hinaus kann die Kapillarelektrophorese auf einem herkömmlichen genetischen Analysator für die Wiederholte Dimensionierung FMR1-PCR-Produkte mit mehr als 200 CGG-Wiederholungen nicht erkennen. Die Southern Blot-Analyse ermöglicht die Differenzierung eines größeren Spektrums von Wiederholungsgrößen, von normalen bis zu vollständigen Mutations-Wiederholungszahlen, und wurde häufig zur Bestätigung vollständiger Mutationen (bei Männern) und zur Differenzierung heterozygoter Allele mit einer vollständigen Mutation von scheinbar homozygote Allele mit normalen Wiederholungsgrößen (bei Weibchen). Die Auflösung für die Quantifizierung der Wiederholungen ist jedoch begrenzt. Noch wichtiger ist, dass diese Schritt-für-Schritt-Teststrategie arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kostenlos ist.
Hier stellen wir eine genaue und robuste PCR-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen im 5'UTR des FMR1-Promotors mit fragilem X PCR-Kit. Die PCR-Produkte werden gereinigt und die Fragmentgröße wird auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument durchgeführt, und die anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen mit hilfe der Analysesoftware erfolgt, indem Aufschluss über Standards mit bekannten Wiederholungen auf der Grundlage der Begründung, dass die PCR-Fragmentlänge direkt proportional zur Anzahl der CGG-Wiederholungen ist. Das PCR-System enthält Reagenzien, die die Amplifikation des hochGC-reichen Trinukleotid-Repeat-Bereichs erleichtern. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, alle Bereiche von CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotern zu identifizieren. Dies ist eine kostengünstige Methode, die eine breite Anwendung in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Störungen mit weniger Umlaufzeit und Investitionen in Ausrüstung finden kann und somit in einem breiteren Spektrum von klinischen Labors.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Fragiles X-Syndrom (FXS) und damit verbundene Störungen werden durch die Ausdehnung des Cytosin-Guanin-Guanin-Guin-Tricleid-Repeats (CGG) in der5' unübersetzten Region (UTR) des fragilen X-Genpromotors verursacht. Konventionell wird die Kapillarelektrophoresefragmentanalyse auf einem genetischen Analysator für die Dimensionierung der CGG-Wiederholungen von FMR1verwendet, aber für die genaue Messung, wenn die Wiederholungszahl höher als 200 ist, ist eine zusätzliche Südfleckanalyse erforderlich. Hier stellen wir eine genaue und robuste Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen in der 5'UTR des FMR1-Promotors mit einem Fragile X PCR-Kit, gefolgt von der Reinigung der PCR-Produkte und der Fragmentierung auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument, und anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen durch Verweise auf Standards mit bekannten Wiederholungen mithilfe der Analysesoftware. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, die gesamte Bandbreite der CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotoren zu identifizieren, einschließlich derjenigen mit einer Wiederholungszahl von mehr als 200 (klassifiziert als vollständige Mutation), 55 bis 200 (Vormutation), 46 bis 54 (Zwischen- und 10 bis 45 (normal). Es ist eine kostengünstige Methode, die die Klassifizierung der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtert.

Die Größenergebnisse der weiblichen Referenzprobe vor der Vormutation (NA20240, Wiederholungsgrößen von 30 und 80) und der vollständigen weiblichen Mutationsreferenzprobe (NA20239, Wiederholungsgrößen von 20 bzw. 200) sind in Abbildung 1A bzw. Abbildung 1Bdargestellt. In der Regel sind zwei Markerspitzen (untere Marker 50 Basenpaare [bp] und obere Marker 10.380 bp) im Fragmentgrößenprofil enthalten. Es gibt in der Regel eine Primer komplexe Spitze mit e...

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A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Ein genauer und robuster, auf Polymerasekettenreaktion basierender Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile X-Gen für geistige Retardierung-1 erleichtert die molekulare Diagnose und das Screening des Fragile X-Syndroms und des fragilen X-bezogenen Störungen mit kürzerer Umschaltzeit und Investitionen in Ausrüstung.

Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Diese kostengünstige Methode kann breite Anwendungen in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Erkrankungen finden. Es ist schnell in der Durchlaufzeit und weniger Investitionen in Ausrüstung. Unser PCR-basierter Assay kann die Klassifizierung des gesamten Spektrums der FXS- und Fragile X-assoziierten Störungen, einschließlich Zwischen-, Vormutations- und Vollmutation, mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtern.Das Verfahren wird von Weng Chua von PerkinElmer Singapur demonstriert. Beginnen Sie mit dem Entfernen des PCR-Puffermixes, der Probenverdünnung und dna-Proben aus dem 20-Grad-Gefrierschrank und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, um aufzutauen. Vor der Verwendung der Reagenzien Wirbel und kurz drehen Sie sie nach unten.Messen Sie die DNA-Probenkonzentration mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie bei Bedarf mit Probenverdünnung auf 25 Nanogramm pro Mikroliter. Beschriften Sie die Bohrungen einer PCR-Platte, um Referenz- und getestete DNA-Proben zu identifizieren und die Anzahl der Reaktionen zu berechnen, die für die Test-, Referenz- und Negativkontrollproben erforderlich sind. Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor, indem Sie 15 Mikroliter PCR-Puffermischung auf 0,6 Mikroliter Probenverdünnungsmittel und 0,4 Mikroliter Polymerase für jede Reaktion kombinieren.Wirbeln Sie die Mischung und drehen Sie es nach unten. Dann 18 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen geben. Dann Pipette zwei Mikroliter jeder DNA in den entsprechenden Brunnen.Mischen Sie die Reagenzien, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen, dann versiegeln Sie die Platte. Legen Sie die Platte in den Thermocycler und führen Sie die PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen aus. Den Inkubator-Shaker auf 65 Grad Celsius vorheizen und jedem PCR-Produkt 80 Mikroliter 1X TE Puffer hinzufügen.Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Proben auf eine PCR-Reinigungsplatte zu übertragen und legen Sie die Platte in den Shaker. Inkubieren Sie es bei 65 Grad Celsius, während es bei 1200 RPM für 10 Minuten schüttelt. Nach der Inkubation den Inkubator-Shaker auf 25 Grad Celsius abkühlen, das Vakuumgerät auf 250 Millibar stellen und die Lösung durch den Filter ansaugen.Nach 15 Minuten sollten die Brunnen keine Flüssigkeit mehr haben. Schalten Sie das Vakuum aus und fügen Sie jedem Bohrwert 50 Mikroliter 1X TE-Puffer hinzu. Aspirieren Sie die Lösung für 10 Minuten mit den vorherigen Vakuumeinstellungen.Trocknen Sie den Boden der Filterplatte, indem Sie sie fest auf einen Stapel Papiertücher drücken und fügen Sie dann 20 Mikroliter 1X TE Puffer in die untere Mitte jedes Brunnens. Legen Sie die Platte in den Shaker und brüten bei 25 Grad Celsius beim Schütteln bei 1200 RPM für fünf Minuten. Nach der Inkubation mindestens 15 Mikroliter des gereinigten PCR-Produkts auf eine frische 96-Well-PCR-Platte übertragen.Bringen Sie vor dem Start das DNA-Farbstoffkonzentrat, die DNA-Gelmatrix, den DNA-Marker, die DNA-Leiter und gereinigte DNA-Proben auf Raumtemperatur. Richten Sie die Grundierstation ein, indem Sie die Spritze ersetzen und die Grundplatte anpassen, dann den Hebel des Spritzenclips loslassen und in die obere Position schieben. Starten Sie die Größensoftware und bereiten Sie den Gelfarbstoff-Mix vor.Wirbeln Sie das Farbstoffkonzentrat für 10 Sekunden, dann drehen Sie es nach unten. Dann fügen Sie 25 Mikroliter des Farbstoffs zu einem Gel Matrix Fläschzeichen und Wirbel die Lösung zu mischen. Übertragen Sie die Gelfarbstoffmischung in einen Spinfilter, legen Sie sie in die Zentrifuge und drehen Sie sie 10 Minuten bei 1500 mal g.Wenn Sie bereit sind, den Gelfarbstoff-Mix zu laden, legen Sie einen neuen DNA-Chip in die Grundierstation ein und fügen Sie neun Mikroliter des Gelfarbstoff-Mixes in den Mitbohrer G.Close the priming station ein und stellen Sie sicher, dass der Kolben an der Ein-Milliliter-Marke positioniert ist. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er durch den Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 Sekunden, und lassen Sie dann den Clip los.Warten Sie noch fünf Sekunden, und ziehen Sie den Kolben langsam wieder in die Ein-Milliliter-Position. Öffnen Sie die Grundierstation und fügen Sie neun Mikroliter Gelfarbstoff mischung in die mit G.Add five mikroliters Marker markierten Brunnen in den Brunnen mit einem Leitersymbol und jeder der 12 Probenbrunnen. Fügen Sie einen Mikroliter der Leiter mit dem Leitersymbol und einen Mikroliter des PCR-Produkts oder Wasser in die Probenbrunnen.Wirbel n. Chr. für eine Minute bei 2400 RPM. Legen Sie es in den Bioanalyzer und führen Sie den Chip innerhalb von fünf Minuten. Wenn die Ausführung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Spitzendaten als csv-Tabellendateien.Als Referenzproben werden eine weibliche Prämutationsprobe und eine vollständige Mutationsprobe verwendet. Ein oberer und niedrigerer Marker-Peak sind im Fragmentgrößenprofil enthalten, und es gibt in der Regel einen Primer-Komplex-Peak bei etwa 95 Base-Paaren. Diese Referenzbeispiele werden verwendet, um eine Regressionsstandardkurve zu erstellen.Die lineare Regressionsstandardkurve wird dann verwendet, um Wiederholungsgrößen unbekannter Stichproben zu berechnen. Klinische Normal-, Zwischen-, Prämutations-, Vollmutations- und Mosaik-Vollmutationsproben können mit dieser Methode korrekt klassifiziert werden. In einigen Fällen wird nur ein Peak in den ergebnissen der mikrofluidischen Elektrophorese angezeigt, was wahrscheinlich auf das Vorhandensein normaler homozygoter Allele zurückzuführen ist.Eine Art von suboptimalem Ergebnis ist die Basisverzerrung, die mehrdeutig oder nicht interpretierbar sein kann und im Verdacht steht, durch Fehlfunktionen des Instruments verursacht zu werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, eine angemessene Menge an DNA und Qualität zu gewährleisten, bevor Sie das Protokoll starten. Die FMR1-Gensequenzierung kann durchgeführt werden, um das AGG-Unterbrechungsmuster zu identifizieren.Und methylierungsempfindliches Restriktionsenzym oder Bisulfidmodifikationstest kann zur Überwachung des Methylierungsstatus verwendet werden. Dies ist eine schnelle, robuste und kostengünstige Technik. Es wird andere Forscher bei der Durchführung einer bevölkerungsbasierten Studie über den Trägerstatus von FXS und fragilen X-assoziierten Störungen unterstützen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Forschung

Genetik

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...