Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del NSFC Emergency Management Project (Grant no. N. di sovvenzione AB16380219), la China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant no. 2018M630993) e la Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

L'approvazione etica è stata concessa dalla Joint Chinese University of Hong Kong - Comitato etico per la ricerca clinica dei nuovi territori (numero di riferimento: 2013.055)
1. Amplificazione PCR
<ol><li>Prima di iniziare, rimuovere il mix di buffer PCR, i campioni didiluenti e i campioni di DNA (sia il test che il DNA di riferimento) (vedi la tabella dei materiali)dal congelatore -20 gradi centigradi e conservarli a temperatura ambiente per 20-30 min per assicurarsi che ...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS è la seconda causa più comune di compromissione intellettuale dopo la trisomia 21, che rappresenta quasi la metà del ritardo mentale X-linked30, che può colpire circa 1 su 4.000 maschi e 1 su 8.000 femmine. Ancora più importante, quasi 1 su 250-1.000 femmine portano una premutation, e questa frequenza è 1 in 250–1,600 nei maschi26,31,32,33. Poiché il rischio...

Sindrome di Fragile X (FXS) e fragili X disturbi associati, ad esempio, tremore e sindrome di atassia (FX-TAS), e insufficienza ovarica primaria (FX-POI) sono principalmente causati da citosina-guanina-guanina (CGG) espansione trinucleotide nel 5' non traducibile (UTR) del gene fragile X ritardo mentale-1 (FMR1) su Xq27.31,2. La proteina codificata FMR1 (FMRP) è una proteina legante all'RNA associata al poliriboso che funziona nello sviluppo neuronale e nella plasticità sinaptica regolando lo splicing alternativo, la stabilità e il trasporto dendritico di mRNA o modulando la sintesi di proteine postanitiche parziali3,4,5,6,7.
La variazione dinamica con una dimensione di ripetizione CGG di >200 è descritta come mutazione completa, che induce l'ipermetilazione aberrante e il successivo silenziamento trascrizionale del promotore FMR1 8. L'assenza o la mancanza della proteina FMRP interrompe il normale sviluppo neuronale e provoca FXS9, caratterizzato da vari sintomi clinici, tra cui disabilità intellettiva da moderata a grave, ritardo dello sviluppo, comportamenti iperattivi, contatti poveri e manifestazioni autistiche10,11,12. La presentazione in pazienti FXS femminili è generalmente più lieve di quella nei maschi. Le dimensioni di ripetizione CGG che vanno da 55 a 200 e da 45 a 54 sono classificate rispettivamente come premutation e status intermedio. A causa dell'elevato grado di premutabilità, la dimensione di ripetizione CGG in un allele intermedio si espande presumibilmente quando viene trasmessa dai genitori alla prole13,14. Così, i portatori con alleli di premutazione sono ad alto rischio di avere bambini affetti da FXS a causa dell'espansione di ripetizione, e in alcuni casi, gli alleli intermedi possono espandere la loro dimensione di ripetizione all'intera gamma di mutazioni su due generazioni15, 16. Inoltre, i maschi con premutazione trasmettono anche un aumento del rischio di sviluppare FX-TAS17ad esordiotardivo,18,19, mentre le donne premutation sono predisposte sia per FX-TAS che per FX-POI20, 21,22. Recentemente, è stato riferito che disturbi dello spettro autistico con ritardo dello sviluppo e problemi nei comportamenti sociali sono presentati nei bambini con arili FMR1 premutation23,24.
Per determinare l'esatta dimensione di ripetizione CGG è di grande importanza per la classificazione e la previsione dei disturbi ASSOCIATI a X FXS e Fragile25,26. Storicamente, la reazione a catena di polimerasi (PCR) ripetuta CGG con il dimensionamento dei frammenti più l'analisi delle macchie meridionali è stato il gold standard per la profilazione molecolare della ripetizione FMR1 CGG27. Tuttavia, la PCR specifica tradizionale è meno sensibile alle grandi premutazioni con più di 100-130 ripetizioni ed è incapace di amplificare le mutazioni complete27,28. Inoltre, l'elettroforesi capillare su un analizzatore genetico tradizionale per il dimensionamento ripetuto non riesce a rilevare i prodotti PCR FMR1 con più di 200 ripetizioni CGG. L'analisi meridionale delle macchie consente la differenziazione di una gamma più ampia di dimensioni di ripetizione, dai numeri di ripetizione della mutazione normale a quella completa, ed è stata ampiamente utilizzata per confermare le mutazioni complete (nei maschi) e differenziare gli alleli eterozigoli con una mutazione completa alleli apparentemente omozici con dimensioni di ripetizione normali (nelle femmine). Tuttavia, la risoluzione per quantificare le ripetizioni è limitata. Ancora più importante, questa strategia di test passo-passo è laboriosa, dispendiosa in termini di tempo e inefficace in termini di costi.
Qui, presentiamo un metodo preciso e robusto basato su PCR per la quantificazione delle ripetizioni CGG di FMR1. Il primo passo di questo test è l'amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 utilizzando il kit FRAGILE X PCR. I prodotti PCR vengono purificati e il dimensionamento dei frammenti viene eseguito su uno strumento di elettroforesi capillare microfluidica, e la successiva interpretazione del numero di ripetizioni CGG utilizzando il software di analisi facendo riferimento a standard con ripetizioni note basate sul logica che la lunghezza del frammento PCR è direttamente proporzionale al numero di ripetizioni CGG. Il sistema PCR include reagenti che facilitano l'amplificazione della regione di ripetizione trinucleotide altamente ricca di GC. Questa prove basata su PCR è riproducibile e in grado di identificare tutte le gamme di ripetizioni CGG dei promotori FMR1. Si tratta di un metodo conveniente che può trovare un'ampia applicazione nella diagnosi molecolare e nello screening di disturbi FXS e X fragili con meno tempi di consegna e investimenti in attrezzature e, quindi, può essere utilizzato in un più ampio spettro di malattie cliniche Laboratori.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Sindrome X fragile (FXS) e disturbi associati sono causati dall'espansione della citosina-guanina-guanina (CGG) trinucleotide ripetere nella regione non tradotta 5' del promotore genico di ritardo mentale Fragile X-1(FMR1). Convenzionalmente, l'analisi del frammento di elettroforesi capillare su un analizzatore genetico viene utilizzata per il dimensionamento delle ripetizioni CGG di FMR1, ma è necessaria un'ulteriore analisi della macchia meridionale per la misurazione esatta quando il numero di ripetizione è superiore a 200. Qui, presentiamo un metodo accurato e robusto a catena di polimerasi (PCR) per la quantificazione delle ripetizioni CGG di FMR1. Il primo passo di questo test è l'amplificazione PCR delle sequenze ripetute nel 5'UTR del promotore FMR1 utilizzando un kit PCR X fragile, seguita dalla purificazione dei prodotti PCR e dal dimensionamento dei frammenti su uno strumento microfluidico di elettroforesi capillare, e successiva interpretazione del numero di ripetizioni CGG facendo riferimento a standard con ripetizioni note utilizzando il software di analisi. Questa prova basata su PCR è riproducibile e in grado di identificare l'intera gamma di ripetizioni CGG dei promotori FMR1, comprese quelle con un numero ripetuto di più di 200 (classificate come mutazione completa), da 55 a 200 (premutazione), da 46 a 54 (intermedio) e 10 a 45 (normale). Si tratta di un metodo conveniente che facilita la classificazione dei disturbi associati a FXS e Fragile X con robustezza e tempi di segnalazione rapidi.

I risultati di dimensionamento del campione di riferimento femminile di premutazione (NA20240, dimensioni di ripetizione di 30 e 80) e del campione di riferimento femminile di mutazione completa (NA20239, dimensioni ripetute di 20 e 200) sono illustrati rispettivamente nella Figura 1A e nella Figura 1B. In genere, due picchi marcatori (marcatore inferiore 50 coppie di base [bp] e marcatore superiore 10.380 bp) sono inclusi nel profilo dimensione del frammento. D...

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A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Un accurato e robusto saggio basato sulla reazione basato sulla reazione della catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni della trinucleotide della citosina-guanina-guanina nel gene del ritardo mentale Fragile X-1 facilita la diagnosi molecolare e lo screening della sindrome di Fragile X e della Fragile X-correlati con tempi di consegna più brevi e investimenti in attrezzature.

Un robusto teste basato sulla reazione alla catena di polimerasi per quantificare le ripetizioni di Trinucleotide della Citosina-guanina-guanina nel gene del retardation mentale Fragile X

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Questo metodo conveniente può trovare ampie applicazioni nella diagnosi molecolare e nello screening di FXS e disturbi fragili correlati all'X. È veloce nel tempo di consegna e meno investimenti in attrezzature. Il nostro test basato su PCR può facilitare la classificazione dell'intero spettro dei disturbi associati a FXS e Fragile X, tra cui intermedio, premutazione e mutazione completa con robustezza e tempi di segnalazione rapidi.La procedura sarà dimostrata da Weng Chua di PerkinElmer Singapore. Inizia rimuovendo la miscela tampone PCR, il diluente del campione e i campioni di DNA dal congelatore Celsius di 20 gradi e lasciandoli a temperatura ambiente per 20-30 minuti per scongelarli. Prima di usare i reagenti, vortice e farli girare brevemente verso il basso.Misurare la concentrazione del campione di DNA con uno spettrofotometro e, se necessario, diluirla a 25 nanogrammi per microlitro con diluente del campione. Etichettare i pozzi di una piastra PCR per identificare campioni di DNA di riferimento e testati e calcolare il numero di reazioni necessarie per i campioni di test, riferimento e controllo negativo. Preparare il mix master PCR combinando 15 microlitri di miscela tampone PCR a 0,6 microlitri di diluente campione e 0,4 microlitri di polimerasi per ogni reazione.Vortice il mix e spin it down. Quindi erogare 18 microlitri della miscela in ogni pozzo. Quindi pipettare due microlitri di ogni DNA nel pozzo appropriato.Mescolare i reagenti tubazioni su e giù cinque volte, quindi sigillare la piastra. Posizionare la piastra nel termociclo e far funzionare la PCR in base alle indicazioni del manoscritto. Preriscaldare lo shaker dell'incubatore a 65 gradi Celsius e aggiungere 80 microlitri di tampone 1X TE a ciascun prodotto PCR.Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire i campioni su una piastra di pulizia PCR e mettere la piastra nello shaker. Incubarlo a 65 gradi Celsius mentre trema a 1200 giri/min per 10 minuti. Dopo l'incubazione, raffreddare lo shaker dell'incubatore fino a 25 gradi Celsius, impostare lo strumento a vuoto su 250 millibar e aspirare la soluzione attraverso il filtro.Dopo 15 minuti, i pozzi non dovrebbero avere più liquido. Spegnere il vuoto e aggiungere 50 microlitri di tampone 1X TE a ciascun pozzo. Aspirare la soluzione per 10 minuti utilizzando le impostazioni di vuoto precedenti.Asciugare la parte inferiore della piastra filtrante premendola saldamente su una pila di tovaglioli di carta e quindi aggiungere 20 microlitri di tampone 1X TE al centro inferiore di ogni pozzo. Posizionare la piastra nello shaker e incubare a 25 gradi Celsius mentre si trema a 1200 giri/min per cinque minuti. Dopo l'incubazione, trasferire almeno 15 microlitri del prodotto PCR purificato su una piastra PCR fresca da 96 po'.Prima di iniziare, porta il concentrato di colorante del DNA, la matrice del gel di DNA, il marcatore del DNA, la scala del DNA e i campioni di DNA purificati a temperatura ambiente. Impostare la stazione di adescamento sostituendo la siringa e regolando la piastra di base, quindi rilasciare la leva della clip della siringa e farla scorrere nella posizione superiore. Avviare il software di dimensionamento e preparare il mix di coloranti in gel.Vortice il concentrato di colorante per 10 secondi, quindi girare verso il basso. Quindi, aggiungere 25 microlitri del colorante a una fiala a matrice di gel e vortice la soluzione da mescolare. Trasferire la miscela di coloranti in gel su un filtro di rotazione, posizionarla nella centrifuga e ruotarla per 10 minuti a 1500 volte g.Quando si è pronti a caricare la miscela di coloranti in gel, inserire un nuovo chip DI DNA nella stazione di adescamento e aggiungere nove microlitri della miscela di coloranti in gel nel pozzo contrassegnato con G.Chiudere la stazione di adescamento e assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato a un segno di millilitro. Premere lo stantuffo della siringa verso il basso fino a quando non viene trattenuto dalla clip. Attendere esattamente 30 secondi, quindi rilasciare la clip.Attendere altri cinque secondi, quindi tirare lentamente lo stantuffo nella posizione di un millilitro. Aprire la stazione di adescamento e aggiungere nove microlitri di miscela di coloranti in gel nei pozzi contrassegnati con G.Aggiungere cinque microlitri di marcatore nel pozzo contrassegnato con un simbolo di scala e ciascuno dei 12 pozzi campione. Aggiungere un microlitro della scala al pozzo con il simbolo della scala e un microlitro del prodotto PCR o dell'acqua ai pozzi campione.Vortice il chip per un minuto a 2400 giri/min. Inseriscilo nel bioanalizzatore ed esegui il chip entro cinque minuti. Al termine dell'esecuzione, esportare i dati di picco come file di tabella CSV.Un campione femminile di premutazione e un campione femminile a mutazione completa vengono utilizzati come campioni di riferimento. Un picco marcatore superiore e inferiore sono inclusi nel profilo delle dimensioni del frammento, e di solito c'è un picco complesso di primer a circa 95 coppie di basi. Questi esempi di riferimento vengono utilizzati per costruire una curva standard di regressione.La curva standard di regressione lineare viene quindi utilizzata per calcolare le dimensioni ripetute di campioni sconosciuti. I campioni clinici normali, intermedi, di premutazione, mutazione completa e mosaico di mutazione completa possono essere classificati correttamente con questo metodo. In alcuni casi, solo un picco viene visualizzato nei risultati dell'elettroforesi microfluidica, che è probabilmente dovuta alla presenza di normali alleli omozigoti.Un tipo di risultato non ottimale è la distorsione di base, che può essere ambigua o non interpretabile, ed è sospettata di essere causata da malfunzionamento dello strumento. Quando si tenta questa procedura, è importante garantire una quantità appropriata di DNA e qualità prima di iniziare il protocollo. Il sequenziamento genico FMR1 può essere eseguito per identificare il modello di interruzione AGG.E l'enzima di restrizione sensibile alla metilazione o il saggio di modifica del bisolfito possono essere usati per monitorare lo stato di metilazione. Questa è una tecnica veloce, robusta ed economica. Aiuterà altri ricercatori a condurre uno studio basato sulla popolazione sullo stato portante di FXS e disturbi fragili associati all'X.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Migliorata la Polymerase Chain Reaction-restrizione frammento lunghezza polimorfismo genotipizzazione di Pufferfish Tossico per cromatografia liquida / spettrometria di massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Ricerca

Genetica

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

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Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

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Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

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Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificazione di eventi di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali del Mouse mediante Southern Blotting e reazione a catena della polimerasi

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Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...