Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

本研究は、NSFC緊急管理プロジェクト(助成金第81741004号)、中国国家自然科学財団(助成第81860272号)、広西省科学技術財団の主要研究計画(助成)の助成金によって支援されました。グラント・ノーAB16380219、中国ポストドクター科学財団助成金(助成金第2018M630993)、広西自然科学財団(助成金第2018GXNSFAA281067)。

香港合同中国大学(参考文献:2013.055)
1. PCR増幅
<ol><li>開始前に、PCRバッファーミックス、サンプル希釈剤およびDNAサンプル(試験および参照DNAの両方)を-20°C冷凍庫から取り除き(材料の表を参照)、すべての試薬とDNAが完全に解凍されていることを確認するために室温で20〜30分間保管してください。渦と使用前に簡単にスピンダウン.</li>
	<li>分光光度計を用いて...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+fragile+X+CGG+repeat+in+females+with+premutation+or+intermediate+alleles.">Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles.</a> American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).</li><li>Fernandez-Carvajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+an+FMR1+grey-zone+allele+to+a+full+mutation+in+two+generations.">Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).</li><li>Terracciano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+to+full+mutation+of+a+FMR1+intermediate+allele+over+two+generations.">Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations.</a> European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).</li><li>Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+FXTAS.">Advances in understanding the molecular basis of FXTAS.</a> Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).</li><li>Juncos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+clinical+findings+in+the+fragile+X-associated+tremor+ataxia+syndrome+(FXTAS).">New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS).</a> Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).</li><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fragile+X+premutation+disorders:+expanding+the+psychiatric+perspective.">A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective.</a> Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).</li><li>Farzin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders+and+attention-deficit/hyperactivity+disorder+in+boys+with+the+fragile+X+premutation.">Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation.</a> Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).</li><li>Hantash, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+premutation+carrier+frequency+in+patients+undergoing+routine+population-based+carrier+screening:+insights+into+the+prevalence+of+fragile+X+syndrome,+fragile+X-associated+tremor/ataxia+syndrome,+and+fragile+X-associated+primary+ovarian+insufficiency+in+the+United+States.">FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States.</a> Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).</li><li>Kraan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1-Related+Disorders.">FMR1-Related Disorders.</a> GeneReviews. , (2012).</li><li>Amos Wilson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+characterization+of+16+FMR1+reference+materials:+a+consortium+study.">Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).</li><li>Kwok, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+carriers+of+premutation-size+alleles+of+the+FMRI+gene--and+implications+for+the+population+genetics+of+the+fragile+X+syndrome.">Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).</li><li>Tassone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+CGG+allele+size+and+prevalence+ascertained+through+newborn+screening+in+the+United+States.">FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States.</a> Genome Medicine. 4, 100 (2012).</li><li>Dombrowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premutation+and+intermediate-size+FMR1+alleles+in+10572+males+from+the+general+population:+loss+of+an+AGG+interruption+is+a+late+event+in+the+generation+of+fragile+X+syndrome+alleles.">Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles.</a> Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).</li><li>Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+instability+of+fragile+X+alleles:+implications+for+offering+fragile+X+prenatal+diagnosis.">Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis.</a> Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).</li><li>Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+assays+for+the+fragile+X-related+disorders.">Recent advances in assays for the fragile X-related disorders.</a> Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).</li><li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXSはトリソミー21に次いで2番目に多い知的障害の原因であり、X連結精神遅滞30の約半分を占めており、男性4,000人に1人、女性8,000人に1人に影響を及ぼす可能性がある。さらに重要なことは、250~1,000人の女性のほぼ1人が変異を持ち、この頻度は男性26、31、32、33の250-1,600の1である。</s...

脆弱X症候群(FXS)および脆弱X関連疾患、例えば、振戦および運動失調症候群(FX-TAS)、および原発性卵巣不全(FX-POI)は、主にシトシン・グアニン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返し拡張によって引き起こされる5'Xq27.31,2の脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子の領域(UTR)。FMR1エンコードタンパク質(FMRP)は、mRNAの代替スプライシング、安定性、樹状輸送を調節または合成を調節することにより、神経発達およびシナプス可塑性に機能するポリリボソーム関連RNA結合タンパク質である。部分的な後転来タンパク質の3、4、5、6、7.
>200のCGG繰り返しサイズを有する動的変動は、FMR1プロモーター8の異常な過メチル化およびその後の転写サイレンシングを誘発する完全な突然変異として記述される。FMRPタンパク質の欠如または欠乏は、正常な神経発達を破壊し、FXS9を引き起こし、中等度から重度の知的障害、発達遅延、過活動行動を含む様々な臨床症状によって特徴付け、貧しい接触と自閉症の症状10,11,12.女性FXS患者のプレゼンテーションは、一般的に男性のそれよりも穏やかです.55 から 200、45 から 54 までの CGG 繰り返しサイズは、それぞれ前変異および中間ステータスとして分類されます。不安定度が高いため、CGGは、親から子孫13、14に伝染すると、おそらく変異または中間対立遺伝子のサイズを繰り返す。したがって、変異アレエレを有するキャリアは、繰り返し拡大のためにFXSの影響を受ける子供を持つ危険性が高く、場合によっては、中間ア列は、2世代15の完全な突然変異範囲にその繰り返しサイズを拡大することができます。 16.さらに、変異を有する男性はまた、遅発性FX-TAS17、18、19を発症するリスクの増加を伝え、一方、変異女性はFX-TASとFX-POI20の両方に対して素因がある。 21、22。近年、発達遅延や社会行動の問題を伴う自閉症スペクトラム障害が、FMR1アエレメント23,24の変異を有する小児において提示されていると報告されている。
正確なCGG繰り返しサイズを決定することは、FXSおよび脆弱X関連障害25,26の分類および予測に大きな意義がある。歴史的に、フラグメントサイジングとサザンブロット解析を伴うCGGリピート領域特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、FMR1 CGGリピート27の分子プロファイリングのゴールドスタンダードとなっています。しかし、従来の特定のPCRは、100から130以上の繰り返しを有する大きな変異に対して感受性が低く、完全な突然変異27、28を増幅することができない。さらに、繰り返しサイジングのための従来の遺伝子アナライザ上の毛細管電気泳動は、200以上のCGG繰り返しを持つFMR1 PCR製品を検出するのに失敗します。サザンブロット解析は、正常から完全な突然変異繰り返し数まで、より広い範囲の繰り返しサイズの区別を可能にし、(男性で)完全な突然変異を確認し、完全な突然変異を持つヘテロ接合性アエレを区別するために広く使用されてきました。明らかに通常の繰り返しサイズを持つホモ接合性のアエレ(雌)。ただし、繰り返しを定量化する解像度は限られています。さらに重要なのは、この段階的なテスト戦略は、労働集約的で時間がかかり、コストがかからないことにあることです。
ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なPCRベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱X PCRキットを使用してFMR1プロモーターの5'UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅です。PCR製品は精製され、断片サイジングはマイクロ流体毛細血管電気泳動器具上で行われ、その後のCGG反復回数の解釈は、既知の繰り返しに基づく基準を参照して分析ソフトウェアを使用して行う。PCR フラグメントの長さは、CGG の繰り返し回数に直接比例するという根拠。PCRシステムには、高度にGCリッチなトリヌクレオチド反復領域の増幅を促進する試薬が含まれる。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、FMR1プロモーターのCGG繰り返しのすべての範囲を識別することができる。これは、FXSおよび脆弱X関連障害の分子診断およびスクリーニングに幅広い応用を見出すことができる費用対効果の高い方法であり、機器への投資の時間と投資を少なくし、より広い範囲の臨床で利用することができる研究 所。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

脆弱X症候群(FXS)および関連疾患は、脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子プロモーターの5'非翻訳領域(UTR)におけるシトシン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返しの拡大によって引き起こされる。従来、遺伝子解析装置上の毛細血管電気泳動断片分析は、FMR1のCGG繰り返しのサイジングに使用されるが、繰り返し数が200を超える場合の正確な測定には追加のサザンブロット分析が必要である。ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱なX PCRキットを用いたFMR1プロモーターの5'UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅であり、続いてマイクロ流体キャピラリー電気泳動器具上のPCR製品およびフラグメントサイジングの精製、分析ソフトウェアを使用して既知の繰り返しを参照して、CGG繰り返しの数の後続の解釈。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、200以上の繰り返し数(完全突然変異として分類)、55から200(変異)、46から54(中間)、および10を含むFMR1プロモーターのCGG繰り返しの全範囲を識別することができる45(通常)。これは、堅牢性と迅速な報告時間を持つFXSおよび脆弱なX関連障害の分類を容易にする費用対効果の高い方法です。

変異雌参照試料(NA20240、リピートサイズ30及び80)及び全変異雌参照試料(NA20239、20及び200の繰り返しサイズ)のサイジング結果をそれぞれ図1Aおよび図1Bに示す。典型的には、フラグメントサイズプロファイルには、2つのマーカーピーク(下位マーカー50塩基対[bp]および上位マーカー10,380bp)が含まれる。通常、約 95 bp のサイズのプライマー複合体ピーク...

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A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

脆弱X精神遅滞-1遺伝子で繰り返されるシトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを定量化するための正確で堅牢なポリメラーゼ連鎖反応ベースのアッセイは、脆弱X症候群および脆弱X関連の分子診断およびスクリーニングを容易にするより短いターンアラウンド時間と機器への投資を伴う障害。

シトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを脆弱なX精神遅滞-1遺伝子で繰り返す堅牢なポリメラーゼ連鎖反応性アッセイ

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

この費用対効果の高い方法は、FXSおよび脆弱X関連疾患の分子診断およびスクリーニングにおける幅広い用途を見つけることができます。それはターンアラウンドタイムで速く、機器への投資が少ないです。当社のPCRベースのアッセイは、中級、プレミューテーション、および堅牢性と迅速な報告時間を含むFXSおよび脆弱X関連障害の完全スペクトルの分類を容易にします。この手順は、パーキンエルマーシンガポールのウェンチュアによって実証されます。まず、PCR バッファー ミックス、サンプル希釈剤、および DNA サンプルを 20°C の冷凍庫から取り出し、室温で 20 ~ 30 分間放置して解凍します。試薬を使用する前に、渦を短く回転させます。分光光度計でDNAサンプル濃度を測定し、必要に応じて、サンプル希釈液で1マイクロリットル当たり25ナノグラムに希釈します。PCR プレートのウェルにラベルを付けて、参照およびテスト済みの DNA サンプルを特定し、テスト、参照、および陰性コントロール サンプルに必要な反応数を計算します。PCR バッファーミックス 15 マイクロリットルを 0.6 マイクロリットルのサンプル希釈液と 0.4 マイクロリットルのポリメラーゼを各反応に組み合わせて、PCR マスターミックスを準備します。ミックスを渦し、それを回転させます。その後、各ウェルに混合物の18マイクロリットルを分配します。次に、各DNAの2マイクロリットルを適切なウェルにピペットします。試薬を上下に5回ピペットして混ぜ、プレートを密封します。プレートをサーモサイクラーに入れ、原稿の指示に従ってPCRを実行します。インキュベーター シェーカーを摂氏 65 度に予熱し、各 PCR 製品に 80 マイクロリットルの 1X TE バッファーを加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルをPCRクリーンアッププレートに移し、プレートをシェーカーに入れます。1200 RPMで10分間振りながら、摂氏65度でインキュベートします。インキュベート後、インキュベーターシェーカーを摂氏25度まで冷やし、真空計器を250ミリバールに設定し、フィルターを通して溶液を吸引します。15分後、井戸には液体が残っていないはずです。真空をオフにし、各ウェルに1X TEバッファの50マイクロリットルを追加します。以前の真空設定を使用して10分間溶液を吸引します。フィルタープレートの底部をペーパータオルの積み重ねにしっかりと押し付けて乾燥させ、各ウェルの底中央に20マイクロリットルの1X TEバッファーを加えます。プレートをシェーカーに入れ、1200 RPMで5分間振りながら摂氏25度でインキュベートします。インキュベーション後、精製PCR産物の少なくとも15マイクロリットルを新鮮な96ウェルPCRプレートに移します。始める前に、DNA色素濃縮物、DNAゲルマトリックス、DNAマーカー、DNAラダー、精製DNAサンプルを室温に戻します。シリンジを交換してベースプレートを調整してプライミングステーションを設置し、シリンジクリップのレバーを離して上の位置にスライドさせます。サイジングソフトウェアを起動し、ゲル染料ミックスを準備します。染料が10秒間濃縮され、それを回転させます。次に、25マイクロリットルの色素をゲルマトリックスバイアルに加え、溶液をボルテックスして混合する。ゲル染料ミックスをスピンフィルターに移し、遠心分離機に入れ、1500回gで10分間回転させます。ゲル染料ミックスをロードする準備ができたら、プライミングステーションに新しいDNAチップを挿入し、9マイクロリットルのゲル染料ミックスをG.Closeプライミングステーションでマークされたウェルに追加し、プランジャーが1ミリリットルのマークに配置されていることを確認します。クリップが押し続くまで、シリンジプランジャーを押し下げます。正確に 30 秒待ってから、クリップを放します。さらに5秒間待ってから、プランジャーを1ミリリットルの位置にゆっくりと引き戻します。プライミングステーションを開き、9マイクロリットルのゲル染料をG.でマークされた井戸に追加し、5マイクロリットルのマーカーをラダーシンボルと12のサンプルウェルのそれぞれに追加します。ラダーシンボルを使用して、1マイクロリットルのラダーを、サンプルウェルにPCR製品または水を1マイクロリットル加えます。2400 RPMで1分間、チップをボルテックスします。それをバイオアナライザに挿入し、5分以内にチップを実行します。実行が完了したら、ピークデータを csv テーブルファイルとしてエクスポートします。プリミューテーション雌試料および完全変異雌試料を参照サンプルとして使用する。フラグメントサイズプロファイルには上下のマーカーピークが含まれており、通常は約95塩基対でプライマー複合ピークがあります。これらの参照サンプルは、回帰標準曲線の構築に使用されます。次に、線形回帰標準曲線を使用して、未知のサンプルの繰り返しサイズを計算します。臨床正常、中間、前突然変異、完全突然変異、およびモザイク完全突然変異サンプルは、この方法で正しく分類することができる。場合によっては、マイクロ流体電気泳動の結果には1つのピークしか表示されませんが、これは正常なホモ接合対立の存在による可能性が高いです。最適でない結果の 1 つのタイプは、ベースライン バイアスであり、あいまいまたは解釈不能であり、機器の誤動作が原因と考えられます。この手順を試みる際には、プロトコルを開始する前に、適切な量のDNAと品質を確保することが重要です。FMR1遺伝子シーケンシングは、AGG中断パターンを同定するために行うことができる。メチル化感受性制限酵素またはバイスルフィド修飾アッセイは、メチル化状態を監視するために使用できる。これは、高速で堅牢でコスト効率の高い手法です。これは、FXSおよび脆弱X関連疾患のキャリア状態に関する人口ベースの研究を行う際に他の研究者を支援します。

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

腹部色素沈着の定量化<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...