Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do projeto de gerenciamento de emergência da NSFC (Grant no. 81741004), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81860272), o principal plano de pesquisa da Fundação provincial de ciência e tecnologia de Guangxi ( Grant no. AB16380219), o Grant da Fundação da ciência de pós-doutorado de China (Grant no. 2018M630993), e a Fundação da ciência natural de Guangxi (Grant no. 2018GXNSFAA281067).

A aprovação ética foi concedida pela Universidade conjunta chinesa de Hong Kong ― Comitê de ética em pesquisa clínica do grupo de novos territórios do leste (número de referência: 2013, 55)
1. amplificação do PCR
<ol><li>Antes de começar, remova a mistura do tampão do PCR, amostras do diluente e do ADN da amostra (teste e ADN da referência) (veja a tabela dos materiais) do congelador de-20 ° c e mantenha-os na temperatura ambiente por 20-30 minutos para cert...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. 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O FXS é a segunda causa mais comum de comprometimento intelectual após a trisminha 21, representando quase metade do retardo mental ligado ao X30, que pode afetar aproximadamente 1 em 4.000 machos e 1 em 8.000 fêmeas. Mais importante, quase 1 em 250 – 1000 fêmeas carregam uma pré-mutação, e esta freqüência é 1 em 250 – 1600 nos machos26,31,32,33. Desde que ...

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas frágeis de X, por exemplo, a síndrome do tremor e da ataxia (FX-TAS), e a insuficiência ovariana preliminar (FX-POI) são causadas principalmente pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) nos 5 ' não traduzidos região (UTR) do gene frágil X retardo mental-1 (FMR1) no xq 27,31,2. A proteína FMR1 codificada (FMRP) é uma proteína de ligação de RNA associada a poliribosome que funciona no desenvolvimento neuronal e na plasticidade sináptica, regulando a emenda alternativa, estabilidade e transporte dendrítico de mRNA ou síntese moduladora de proteínas pós-sinápticas parciais3,4,5,6,7.
A variação dinâmica com um tamanho da repetição de CGG de > 200 é descrita como a mutação cheia, que induz o hipermetilação aberrante e o silenciamento transcricional subseqüente do promotor FMR1 8. A ausência ou falta resultante da proteína FMRP interrompe o desenvolvimento neuronal normal e provoca o FXS9, caracterizado por vários sintomas clínicos, incluindo incapacidade intelectual moderada a grave, atraso no desenvolvimento, comportamentos hiperativos, contatos pobres e manifestações autísticas10,11,12. A apresentação em pacientes fêmeas de FXS é geralmente mais suave do que aquela nos machos. O tamanho da repetição de CGG que varia de 55 a 200 e de 45 a 54 é classific como a pré-mutação e o status intermediário, respectivamente. Devido ao alto grau de instabilidade, o tamanho da repetição de CGG em uma pré-mutação ou alelo intermediário presumivelmente se expande quando transmitido dos pais para a descendência13,14. Assim, os portadores com alelos da pré-mutação estão no risco elevado de ter as crianças afetadas com o FXS por causa da expansão da repetição, e em alguns casos, os alelos intermediários podem expandir seu tamanho da repetição à escala cheia da mutação sobre duas gerações15, a 16. Além disso, os machos com pré-mutação também transmitem um risco aumentado de desenvolvimento de FX-tas de início tardio17,18,19, enquantoasfêmeas depré-mutação são predispostas para FX-tas e FX-POI20, 21,22. Recentemente, tem sido relatado que distúrbios do espectro autístico com atraso no desenvolvimento e problemas em comportamentos sociais são apresentados em crianças com pré-mutação FMR1 alelos23,24.
Para determinar o tamanho exato da repetição de CGG é de grande importância para classificação e predição do FXS e de desordens X-associadas frágeis25,26. Historicamente, a reação em cadeia da polimerase específica da região de repetição CGG (PCR) com dimensionamento de fragmento mais a análise do Southern blot tem sido o padrão-ouro para o perfil molecular da repetição de FMR1 CGG27. Entretanto, o PCR específico tradicional é menos sensível às grandes pré-mutações com mais de 100 a 130 repetições e é incapaz de amplificar mutações cheias27,28. Além disso, a electroforese capilar em um analisador genético tradicional para o dimensionamento da repetição não detecta produtos de FMR1 PCR com mais de 200 repetições de CGG. A análise do Sul do borrão permite a diferenciação de uma escala mais larga do tamanho da repetição, de normal aos números inteiros da repetição da mutação, e foi amplamente utilizada confirmando mutações cheias (nos machos) e diferenciando alelos heterozygous com uma mutação cheia de alelos aparentemente homozygous com tamanhos normais da repetição (nas fêmeas). No entanto, a resolução para quantificar as repetições é limitada. Mais importante, esta estratégia de teste passo a passo é trabalhosa, demorada, e custo-ineficaz.
Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da PCR-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando o jogo frágil do PCR de X. Os produtos do PCR são purified e o dimensionamento do fragmento é executado em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e na interpretação subseqüente do número de repetições de CGG usando o software da análise referenciando padrões com repetições conhecidas baseadas no racional que o comprimento do fragmento do PCR é diretamente proporcional ao número de repetições de CGG. O sistema do PCR inclui os reagentes que facilitam a amplificação da região altamente GC-rica da repetição do trinucleotide. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar todas as escalas de repetições de CGG de FMR1 promotores. Este é um método rentável que pode encontrar a aplicação larga no diagnóstico molecular e na seleção do FXS e de desordens X-relacionadas frágeis com menos tempo do turn-around e o investimento no equipamento e assim, pode ser utilizado em um espectro mais largo de clínico Laboratórios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

A síndrome de X frágil (FXS) e as desordens associadas são causadas pela expansão da repetição do trinucleotide da citosina-guanina-guanina (CGG) na região 5 ' Untranslated (UTR) do promotor do gene do retardo mental X-1 (FMR1) frágil. Convencionalmente, a análise capilar do fragmento da electroforese em um analisador genético é usada para o dimensionamento das repetições de CGG de FMR1, mas a análise adicional do Sul do Borrão é exigida para a medida exata quando o número da repetição é mais elevado do que 200. Aqui, nós apresentamos um método exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseado para a quantificação das repetições de CGG de FMR1. A primeira etapa deste teste é a amplificação do PCR das seqüências da repetição no 5 ' UTR do promotor FMR1 usando um jogo frágil do PCR de X, seguido pela purificação dos produtos do PCR e do fragmento que cola em um instrumento capilar microfluídicos da electroforese, e interpretação subseqüente do número de repetições CGG referenciando padrões com repetições conhecidas usando o software de análise. Este ensaio PCR-baseado é reprodutível e capaz de identificar a série completa de repetições de CGG de FMR1 promotores, incluindo aqueles com um número da repetição de mais de 200 (classific como a mutação cheia), 55 a 200 (premutação), 46 a 54 (intermediário), e 10 a 45 (normal). É um método rentável que facilita a classificação do FXS e de desordens X-associadas frágeis com robustez e tempo de relatório rápido.

Os resultados de dimensionamento da amostra de referência feminina de pré-mutação (NA20240, tamanhos de repetição de 30 e 80) e a amostra de referência feminina de mutação completa (NA20239, tamanhos de repetição de 20 e 200) são mostrados na Figura 1a e na Figura 1b, respectivamente. Normalmente, dois picos de marcador (menor marcador 50 pares de base [BP] e marcador superior 10.380 BP) são incluídos no perfil de tamanho do fragmento. Há geralmen...

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A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Um ensaio exato e robusto da reacção em cadeia do polymerase para quantificar repetições do trinucleotide da citosina-guanina-guanina no frágil X retardo mental-1 gene facilita o diagnóstico molecular e a seleção da síndrome frágil de X e do X-relacionado frágil distúrbios com tempo de virada mais curto e investimento em equipamentos.

Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Este método econômico pode encontrar amplas aplicações no diagnóstico molecular e triagem de fxs e distúrbios frágeis relacionados ao X. É rápido em tempo de reviravolta e menos investimento em equipamentos. Nosso ensaio baseado em PCR pode facilitar a classificação de espectro completo dos transtornos associados ao FXS e frágeis x, incluindo intermediário, premutação e mutação completa com robustez e tempo de relatório rápido.O procedimento será demonstrado por Weng Chua da PerkinElmer Singapura. Comece removendo a mistura de tampão PCR, diluente de amostra e amostras de DNA do congelador Celsius de 20 graus, e deixando-as em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para descongelar. Antes de usar os reagentes, vórtice e rapidamente gire-os para baixo.Meça a concentração da amostra de DNA com um espectotômetro e, se necessário, dilua-a a 25 nanogramas por microlitera com diluente amostral. Rotule os poços de uma placa PCR para identificar amostras de DNA de referência e testadas e calcular o número de reações necessárias para as amostras de teste, referência e controle negativo. Prepare o mix mestre pcr combinando 15 microliters de mistura tampão PCR a 0,6 microliters de diluentes de amostra e 0,4 microliters de polimerase para cada reação.Vórtice a mistura e girar para baixo. Em seguida, distribua 18 microliters da mistura em cada poço. Em seguida, pipeta dois microliters de cada DNA no poço apropriado.Misture os reagentes por pipetting para cima e para baixo cinco vezes, em seguida, selar a placa. Coloque a placa no termociclador e execute o PCR de acordo com as instruções do manuscrito. Pré-aqueça o agitador da incubadora a 65 graus Celsius e adicione 80 microliters de tampão 1X TE a cada produto PCR.Use uma pipeta multicanal para transferir as amostras para uma placa de limpeza PCR e coloque a placa no agitador. Incuba-o a 65 graus Celsius enquanto treme a 1200 RPM por 10 minutos. Após a incubação, esfrie o agitador da incubadora até 25 graus Celsius, defina o instrumento de vácuo em 250 milibares e aspire a solução através do filtro.Após 15 minutos, os poços não devem ter líquido restante. Desligue o vácuo e adicione 50 microliters de tampão 1X TE a cada poço. Aspire a solução por 10 minutos usando as configurações de vácuo anteriores.Seque a parte inferior da placa do filtro pressionando-a firmemente sobre uma pilha de toalhas de papel e, em seguida, adicione 20 microliters de tampão 1X TE ao centro inferior de cada poço. Coloque a placa no shaker e incubar a 25 graus Celsius enquanto treme a 1200 RPM por cinco minutos. Após a incubação, transfira pelo menos 15 microliters do produto PCR purificado para uma placa PCR fresca de 96 poços.Antes de começar, traga o concentrado de corante de DNA, matriz de gel de DNA, marcador de DNA, escada de DNA e amostras de DNA purificadas à temperatura ambiente. Configure a estação de escoramento substituindo a seringa e ajustando a placa base, em seguida, solte a alavanca do clipe da seringa e deslize-a para a posição superior. Inicie o software de dimensionamento e prepare a mistura de corante de gel.Vórtice o concentrado de corante por 10 segundos, em seguida, gire-o para baixo. Em seguida, adicione 25 microliters do corante a um frasco de matriz de gel e vórtice a solução a misturar. Transfira a mistura de corante de gel para um filtro de giro, coloque-a na centrífuga e gire-a por 10 minutos a 1500 vezes g.Quando estiver pronto para carregar a mistura de corante de gel, insira um novo chip de DNA na estação de escoramento e adicione nove microliters da mistura de corante de gel no poço que está marcado com G.Feche a estação de escoramento e certifique-se de que o êmbolo esteja posicionado na marca de um mililitro. Pressione o êmbolo da seringa para baixo até que seja segurado pelo clipe. Aguarde exatamente 30 segundos e solte o clipe.Espere mais cinco segundos e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo de volta para a posição de um mililitro. Abra a estação de escoramento e adicione nove microliters de corante de gel nos poços marcados com G.Adicione cinco microliters de marcador no poço marcado com um símbolo de escada e cada um dos 12 poços de amostra. Adicione um microliter da escada ao poço com o símbolo da escada e um microliter do produto PCR ou água aos poços de amostra.Vórtice o chip por um minuto a 2400 RPM. Insira-o no bioanalzer e execute o chip dentro de cinco minutos. Quando a execução estiver concluída, exporte os dados de pico como arquivos de tabela csv.Uma amostra feminina de pré-mutação e uma amostra feminina de mutação completa são usadas como amostras de referência. Um pico de marcador superior e inferior está incluído no perfil de tamanho do fragmento, e geralmente há um pico complexo de primer em cerca de 95 pares de base. Estas amostras de referência são usadas para construir uma curva padrão de regressão.A curva padrão de regressão linear é então usada para calcular tamanhos repetidos de amostras desconhecidas. Amostras clínicas normais, intermediárias, de pré-mutação, de mutação completa e de mutação completa de mosaico podem ser corretamente classificadas com este método. Em alguns casos, apenas um pico é exibido nos resultados de eletroforese microfluida, o que é provavelmente devido à presença de alelos homozigos normais.Um tipo de resultado subótimo é o viés de linha de base, que pode ser ambíguo ou desinterpretável, e é suspeito de ser causado por mau funcionamento do instrumento. Ao tentar este procedimento, é importante garantir a quantidade adequada de DNA e qualidade antes de iniciar o protocolo. O sequenciamento genético FMR1 pode ser realizado para identificar o padrão de interrupção AGG.E a enzima de restrição sensível à metilação ou o ensaio de modificação de bisulfeto podem ser usados para monitorar o estado de metilação. Esta é uma técnica rápida, robusta e econômica. Ajudará outros pesquisadores na realização de um estudo de base populacional sobre o status portador de TRANSTORNOS ASSOCIADOS ao FXS e Frágeis X.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Genética

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantificando pigmentação abdominal em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...