Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Это исследование было поддержано грантами от NSFC Проект управления чрезвычайными ситуациями (Грант No 81741004), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81860272), Главный исследовательский план провинциального научно-технического фонда Гуанси ( Грант Но. AB16380219), Грант Фонда постдокторской науки (Грант No 2018М630993) и Гуанси-Фонд естественных наук (Грант No 2018GXNSFAA281067).

Этические утверждения были предоставлены Объединенным китайским университетом Гонконга и Новых территорий Восточного кластера клинических исследований комитета по этике (Справочный номер: 2013.055)
1. Усиление ПЦР
<ol><li>Перед началом, удалить ПЦР буферсмесь, образец разба?...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+fragile+X+CGG+repeat+in+females+with+premutation+or+intermediate+alleles.">Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles.</a> American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).</li><li>Fernandez-Carvajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+an+FMR1+grey-zone+allele+to+a+full+mutation+in+two+generations.">Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).</li><li>Terracciano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+to+full+mutation+of+a+FMR1+intermediate+allele+over+two+generations.">Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations.</a> European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).</li><li>Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+FXTAS.">Advances in understanding the molecular basis of FXTAS.</a> Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).</li><li>Juncos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+clinical+findings+in+the+fragile+X-associated+tremor+ataxia+syndrome+(FXTAS).">New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS).</a> Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).</li><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+premutations+in+familial+premature+ovarian+failure.">Fragile X premutations in familial premature ovarian failure.</a> Lancet. 346, 309-310 (1995).</li><li>Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+early+premature+ovarian+failure+in+two+sisters+compound+heterozygous+for+the+FMR1+premutation.">Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation.</a> European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).</li><li>Bourgeois, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fragile+X+premutation+disorders:+expanding+the+psychiatric+perspective.">A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective.</a> Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).</li><li>Farzin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders+and+attention-deficit/hyperactivity+disorder+in+boys+with+the+fragile+X+premutation.">Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation.</a> Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).</li><li>Hantash, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+premutation+carrier+frequency+in+patients+undergoing+routine+population-based+carrier+screening:+insights+into+the+prevalence+of+fragile+X+syndrome,+fragile+X-associated+tremor/ataxia+syndrome,+and+fragile+X-associated+primary+ovarian+insufficiency+in+the+United+States.">FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States.</a> Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).</li><li>Kraan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1-Related+Disorders.">FMR1-Related Disorders.</a> GeneReviews. , (2012).</li><li>Amos Wilson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+characterization+of+16+FMR1+reference+materials:+a+consortium+study.">Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).</li><li>Kwok, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+carriers+of+premutation-size+alleles+of+the+FMRI+gene--and+implications+for+the+population+genetics+of+the+fragile+X+syndrome.">Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).</li><li>Tassone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+CGG+allele+size+and+prevalence+ascertained+through+newborn+screening+in+the+United+States.">FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States.</a> Genome Medicine. 4, 100 (2012).</li><li>Dombrowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premutation+and+intermediate-size+FMR1+alleles+in+10572+males+from+the+general+population:+loss+of+an+AGG+interruption+is+a+late+event+in+the+generation+of+fragile+X+syndrome+alleles.">Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles.</a> Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).</li><li>Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+instability+of+fragile+X+alleles:+implications+for+offering+fragile+X+prenatal+diagnosis.">Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis.</a> Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).</li><li>Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+assays+for+the+fragile+X-related+disorders.">Recent advances in assays for the fragile X-related disorders.</a> Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).</li><li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS является второй наиболее распространенной причиной интеллектуальных нарушений после трисомии 21, на долю которой приходится почти половина X-связанных умственной отсталости30, которые могут затронуть примерно 1 в 4000 мужчин и 1 в 8000 женщин. Что еще более важно, почти 1 из 250-10...

Хрупкий X синдром (FXS) и Хрупкие X связанных расстройств, например, тремор и синдром атаксии (FX-TAS), и первичной недостаточности яичников (FX-POI) в основном вызваны цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить расширение в 5 'непереведенных области (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1(FMR1) гена на Xq27.31,2. FMR1 закодированный белок (FMRP) является полирибоом связанных РНК-связывающий белок, который функционирует в развитии нейронов и синаптической пластичности путем регулирования альтернативного сплайсинга, стабильности и дендритной транспортировки мРНК или модулирующий синтез частичных постсинаптических белков3,4,5,6,7.
Динамический вариант с CGG повторить размер йgt;200 описывается как полная мутация, которая вызывает аномальные гиперметилирования и последующего транскрипционного глушить FMR1 промоутер8. В результате отсутствие или отсутствие белка FMRP нарушает нормальное развитие нейронов и вызывает FXS9, характеризуется различными клиническими симптомами, в том числе умеренной до тяжелой умственной неполноценности, задержки развития, гиперактивного поведения, плохие контакты и аутичные проявления10,11,12. Презентация у женщин FXS пациентов, как правило, мягче, чем у мужчин. Размер повтора CGG в диапазоне от 55 до 200 и 45 до 54 классифицируются как премутационный и промежуточный статус, соответственно. Из-за высокой степени нестабильности, CGG повторить размер в премутации или промежуточный аллель предположительно расширяется при передаче от родителей к потомству13,14. Таким образом, носители с аллелями премутации подвергаются высокому риску иметь детей, пострадавших от FXS из-за повторного расширения, а в некоторых случаях, промежуточные аллели могут расширить их размер повторения до полного диапазона мутации в течение двух поколений15, 16. Кроме того, мужчины с премутацией также передать повышенный риск развития позднего начала FX-TAS17,18,19, в то время как премутации женщины предрасположены как fx-TAS и FX-POI20, 21,22. Недавно было сообщено, что расстройства аутистического спектра с задержкой развития и проблемы в социальном поведении представлены у детей с перестановкой FMR1 аллелей23,24.
Для определения точного cGG повторить размер имеет большое значение для классификации и прогнозирования FXS и хрупкие X-ассоциированных расстройств25,26. Исторически сложилось так, что CGG повторить регион-специфических полимеразы цепной реакции (PCR) с размером фрагмента плюс анализ южной подевой были золотым стандартом для молекулярного профилирования FMR1 CGG повторить27. Тем не менее, традиционные специфические ПЦР менее чувствительны к большим премутации с более чем 100 до 130 повторов и не способен к усилению полной мутации27,28. Кроме того, капиллярный электрофорез на традиционном генетическом анализаторе для повторного калибровки не обнаруживает продукты ПЦР FMR1 с более чем 200 cGG повторами. Анализ южной подётой поля позволяет дифференизировать более широкий диапазон повторяющихся размеров, от нормальных до полных мутаций повторяющихся чисел, и широко используется для подтверждения полных мутаций (у мужчин) и дифференциации гетерозиготных аллелей с полной мутацией от по-видимому гомозиготные аллели с нормальными размерами повтора (у женщин). Однако резолюция для количественной оценки повторов ограничена. Что еще более важно, эта пошаговая стратегия тестирования является трудоемкой, трудоемкой и неэффективной с точки зрения затрат.
Здесь мы представляем точный и надежный метод на основе ПЦР для количественной оценки CGG повторов FMR1. Первым шагом этого теста является pcR усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект. Продукты ПЦР очищаются, а размер фрагментов выполняется на микрофлюидном инструменте электрофорасиса капилляров, а последующая интерпретация количества CGG повторяется с помощью программного обеспечения анализа, ссылаясь на стандарты с известными повторами, основанными на обоснование того, что длина фрагмента ПЦР прямо пропорциональна количеству повторов CGG. Система ПЦР включает в себя реагенты, которые облегчают усиление высоко богатой ГК области тринуклеотида. Этот ПЦР-ассес воспроизводим и способен идентифицировать все диапазоны CGG повторов промоутеров FMR1. Это экономически эффективный метод, который может найти широкое применение в молекулярной диагностики и скрининга FXS и хрупких X связанных расстройств с меньшим оборотом вокруг времени и инвестиций в оборудование и, таким образом, могут быть использованы в более широком спектре клинических Лаборатории.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Хрупкий X синдром (FXS) и связанные с ним расстройства вызваны расширением цитозин-гуанин-гуанин (CGG) тринуклеотид повторить в 5' непереведенных региона (UTR) хрупкой X умственной отсталости-1 (FMR1) гена промоутер. Условно, анализ фрагмента капиллярного электрофореза на генетическом анализе используется для калибровки CGG повторяет FMR1, но дополнительный анализ южной поточности требуется для точного измерения, когда число повторений выше 200. Здесь мы представляем точный и надежный полимеразной цепной реакции (PCR) на основе метода количественной оценки CGG повторяет FMR1. Первым шагом этого теста является пЧР усиление повторяющихся последовательностей в 5'UTR промоутера FMR1 с использованием хрупких X PCR комплект, а затем очистка продуктов ПЦР и размер фрагментов на микрофлюидных капиллярных электрофореза инструмент, и последующее толкование числа cGG повторяется по ссылкам стандартов с известными повторами с использованием программного обеспечения анализа. Этот анализ на основе ПЦР воспроизводим и способен определить весь спектр CGG повторов промоутеров FMR1, в том числе с повторным числом более 200 (классифицируется как полная мутация), от 55 до 200 (премутация), от 46 до 54 (промежуточные), и от 10 до 45 (нормально). Это экономически эффективный метод, который облегчает классификацию FXS и хрупких X-связанных расстройств с надежностью и быстрым временем отчетности.

Результаты размеров женской эталонной выборки (NA20240, повторные размеры 30 и 80) и полная женская эталонная выборка мутации (NA20239, повторные размеры 20 и 200) показаны на рисунке 1A и Рисунке 1B, соответственно. Как правило, в профиль размера фрагмента включены два...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Точный и надежный полимеразы цепной реакции на основе анализ для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяется в хрупкий X умственной отсталости-1 ген облегчает молекулярную диагностику и скрининг хрупкий X синдром и хрупкие X-связанных расстройства с более коротким временем оборота и инвестициями в оборудование.

Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Этот экономически эффективный метод может найти широкое применение в молекулярной диагностике и скрининге FXS и хрупких X-связанных расстройств. Это быстрое время оборота и меньше инвестиций в оборудование. Наш анализ на основе ПЦР может облегчить классификацию полного спектра FXS и хрупких X-ассоциированных расстройств, включая промежуточные, предмутационные и полные мутации с надежностью и быстрым временем отчетности.Процедуру продемонстрирует Венг Чуа из PerkinElmer Singapore. Начните с удаления буферной смеси ПЦР, разбомбовки образцов и образцов ДНК из морозильной камеры 20 градусов по Цельсию и оставляя их при комнатной температуре от 20 до 30 минут до оттепели. Перед использованием реагентов, вихрь и кратко спина их вниз.Измерьте концентрацию образца ДНК с помощью спектрофотометра и при необходимости разбавьте его до 25 нанограмм на микролитер с разбавлением образца. Наклейте этикетку колодцев пластины ПЦР для выявления эталонных и проверенных образцов ДНК и расчета количества реакций, необходимых для анализа, ссылки и отрицательных контрольных образцов. Подготовьте мастер-микс ПЦР, объединив 15 микролитров буферной смеси ПЦР с 0,6 микролитров разбомбивания образца и 0,4 микролитров полимеразы для каждой реакции.Vortex смесь и спина его вниз. Затем вылейте 18 микролитров смеси в каждую колодец. Затем пипетка два микролитров каждой ДНК в соответствующий колодец.Смешайте реагенты, трубя вверх и вниз пять раз, а затем запечатать пластину. Поместите пластину в термоциклер и запустите ПЦР в соответствии с рукописными указаниями. Разогреть инкубатор шейкер до 65 градусов по Цельсию и добавить 80 микролитров 1X TE буфера для каждого продукта ПЦР.Используйте многоканальный пипетку для передачи образцов на пластину очистки ПЦР и положите пластину в шейкер. Инкубировать его при 65 градусах по Цельсию при встряхивании при 1200 об/мин в течение 10 минут. После инкубации охладите шейкер инкубатора до 25 градусов по Цельсию, установите вакуумный инструмент до 250 миллибар и оспирировать раствор через фильтр.Через 15 минут скважины не должны иметь жидкости. Выключите вакуум и добавьте 50 микролитров буфера 1X TE к каждой колодец. Аспирировать раствор в течение 10 минут с помощью предыдущих параметров вакуума.Высушите нижнюю часть фильтровальной пластины, нажимая ее твердо на стопку бумажных полотенец, а затем добавьте 20 микролитров буфера 1X TE в нижний центр каждой хорошо. Поместите тарелку в шейкер и инкубировать при 25 градусах по Цельсию при встряхивании при 1200 об/мин в течение пяти минут. После инкубации перенесите не менее 15 микролитров очищенного ПЦР-продукта на свежую 96 хорошо ПЦР пластину.Перед началом довезение концентрата красителя ДНК, матрицы геля ДНК, маркера ДНК, лестницы ДНК и очищенных образцов ДНК до комнатной температуры. Настройка грунтовки станции путем замены шприца и регулировки базовой пластины, а затем освободить рычаг шприц клип и сдвиньте его в верхнее положение. Запустите программное обеспечение размеров и подготовить смесь красителя геля.Vortex красителя концентрата в течение 10 секунд, а затем спина его вниз. Затем добавьте 25 микролитров красителя в гель матричный флакон и вихрь раствор для смешивания. Перенесите смесь гелеобразного красителя в спиновой фильтр, поместите его в центрифугу и закрутите в течение 10 минут при 1500 г.Когда готовы загрузить гель красителя смесь, вставьте новый чип ДНК в грунтовке станции и добавить девять микролитров смеси красителя геля в колодец, который отмечен G.Close грунтовки станции и убедитесь, что поршень расположен на один миллилитр знака. Нажмите шприц поршень вниз, пока он не проводится клип. Подождите ровно 30 секунд, а затем отпустите клип.Подождите еще пять секунд, а затем медленно потяните поршень обратно в одно миллилитрное положение. Откройте грунтовку станции и добавить девять микролитров смеси гелего красителя в скважины отмечены G.Add пять микролитров маркера в хорошо отмечены символом лестницы и каждый из 12 образцов скважин. Добавьте один микролитр лестницы к колодце с символом лестницы и один микролитр продукта ПЦР или воды в пробные скважины.Vortex чип в течение одной минуты при 2400 об/мин. Вставьте его в биоанализ и запустите чип в течение пяти минут. Когда запуск будет завершен, экспорт пиковых данных в качестве файлов таблицы csv.В качестве эталонных образцов используются предмутационный женский образец и полная мутация женского образца. Верхний и нижний пик маркера включены в профиль размера фрагмента, и, как правило, грунтовка сложный пик около 95 базовых пар. Эти эталонные образцы используются для построения стандартной кривой регрессии.Стандартная кривая линейной регрессии затем используется для расчета повторных размеров неизвестных образцов. Клинические нормальные, промежуточные, премутационные, полные мутации и мозаичные полные образцы мутаций можно правильно классифицировать с помощью этого метода. В некоторых случаях только один пик отображается в результатах микрофлюидного электрофореза, что, вероятно, связано с наличием нормальных гомозиготных аллелей.Одним из видов неоптимальных результатов является базовая предвзятость, которая может быть неоднозначной или неинтерпретуальной и, как подозревается, вызвана неисправностью прибора. При попытке этой процедуры, важно обеспечить соответствующее количество ДНК и качества перед запуском протокола. Секвенирование гена FMR1 может быть выполнено для определения шаблона прерывания AGG.Для мониторинга состояния метилирования можно использовать фермент ограничения метилирования или анализ модификации бисульфида. Это быстрый, надежный и экономически эффективный метод. Это поможет другим исследователям в проведении населения на основе исследования о статусе носителя FXS и хрупких X-связанных расстройств.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Количественное определение пигментации брюшной полости в<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Кандидат Джин тестирование в клинической когортных исследований с мультиплексной генотипирования и масс-спектрометрии

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Манипуляции функции гена в мексиканской Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...