Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Proyecto de Manejo de Emergencias de la NSFC (Grant No. 81741004), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi ( Concesión No. AB16380219), la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Concesión No. 2018M630993) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (Concesión No. 2018GXNSFAA281067).

La aprobación ética fue otorgada por el Comité de ética de la investigación clínica del clúster oriental de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (Número de referencia: 2013.055)
1. Amplificación de PCR
<ol><li>Antes de comenzar, retire la mezcla tampón de PCR, el diluyente de muestras y las muestras de ADN (tanto el ADN de prueba como el de referencia) (ver la Tabla de Materiales)del congelador de -20 oC y manténgalos a temperatura ambient...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS es la segunda causa más común de deterioro intelectual después de la trisomía 21, que representa casi la mitad del retraso mental ligado al X30, que puede afectar aproximadamente a 1 de cada 4.000 hombres y 1 de cada 8.000 mujeres. Más importante aún, casi 1 de cada 250–1.000 hembras lleva una premutación, y esta frecuencia es 1 en 250-1.600 en los machos26,31,32,...

Los trastornos asociados al síndrome De X frágil (FXS) y X frágil, por ejemplo, el síndrome de temblor y ataxia (FX-TAS), y la insuficiencia ovárica primaria (FX-POI) son causados principalmente por la expansión de repetición de trinucleótidos de citosina-guanina-guanina (CGG) en los 5' no traducidos (UTR) del gen de retardo mental X frágil-1 (FMR1) en Xq27.31,2. La proteína codificada FMR1 (FMRP) es una proteína de unión al ARN asociada al polisistores que funciona en el desarrollo neuronal y la plasticidad sináptica regulando el empalme alternativo, la estabilidad y el transporte dendrítico de ARNm o síntesis moduladora de proteínas postsinápticas parciales3,4,5,6,7.
La variación dinámica con un tamaño de repetición CGG de >200 se describe como mutación completa, que induce la hipermetilación aberrante y el posterior silenciamiento transcripcional del promotor FMR1 8. La ausencia o falta resultante de la proteína FMRP interrumpe el desarrollo neuronal normal y causa FXS9,caracterizado por varios síntomas clínicos, incluyendo discapacidad intelectual moderada a grave, retraso del desarrollo, comportamientos hiperactivos, contactos pobres y manifestaciones autistas10,11,12. La presentación en pacientes con FXS femeninos es generalmente más leve que la de los hombres. El tamaño de repetición de CGG que oscila entre 55 y 200 y 45 a 54 se clasifican como premutación y estado intermedio, respectivamente. Debido al alto grado de inestabilidad, el tamaño de repetición CGG en una premutación o alelo intermedio presumiblemente se expande cuando se transmite de los padres a la descendencia13,14. Por lo tanto, los portadores con alelos de premutación tienen un alto riesgo de tener niños afectados con FXS debido a la expansión repetida, y en algunos casos, los alelos intermedios pueden ampliar su tamaño de repetición a todo el rango de mutación durante dos generaciones15, 16. Además, los machos con premutación también transmiten un mayor riesgo de desarrollar FX-TAS17,18,19,mientras que las hembras de premutación están predispuestas tanto para FX-TAS como para FX-POI20, 21,22. Recientemente, se ha informado de que los trastornos del espectro autista con retraso del desarrollo y los problemas en las conductas sociales se presentan en niños con premutación FMR1 alelos23,24.
Para determinar el tamaño exacto de la repetición CGG es de gran importancia para la clasificación y predicción de los trastornos asociados al FXS y Xfrágiles 25,26. Históricamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica de la región de cGG con tamaño de fragmento más análisis de manchas del sur han sido el estándar de oro para el perfilmolecular de la repetición FMR1 CGG27. Sin embargo, la PCR específica tradicional es menos sensible a las premutaciones grandes con más de 100 a 130 repeticiones y es incapaz de amplificar mutaciones completas27,28. Además, la electroforesis capilar en un analizador genético tradicional para el tamaño repetido no detecta los productos de PCR FMR1 con más de 200 repeticiones De CGG. El análisis de la mancha meridional permite la diferenciación de una gama más amplia de tamaño de repetición, de números de repetición de mutaciones normales a completos, y se ha utilizado ampliamente para confirmar mutaciones completas (en varones) y diferenciar alos heterocigotos con una mutación completa de aparentemente alelos homocigotos con tamaños de repetición normales (en hembras). Sin embargo, la resolución para cuantificar las repeticiones es limitada. Más importante aún, esta estrategia de pruebas paso a paso requiere mucha mano de obra, requiere mucho tiempo y es ineficaz en cuanto a costos.
Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en PCR para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando el kit de PCR Frágil X. Los productos PCR son purificados y el tamaño de fragmentos se realiza en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y la interpretación posterior del número de repeticiones de CGG utilizando el software de análisis haciendo referencia a estándares con repeticiones conocidas basadas en el la longitud de los fragmentos de PCR es directamente proporcional al número de repeticiones de CGG. El sistema PCR incluye reactivos que facilitan la amplificación de la región de repetición de trinucleótidos altamente rica en GC. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar todas las gamas de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1. Este es un método rentable que puede encontrar una amplia aplicación en el diagnóstico molecular y el cribado de trastornos relacionados con FXS y X frágiles con menos tiempo de respuesta e inversión en equipos y, por lo tanto, puede ser utilizado en un espectro más amplio de clínica Laboratorios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

El síndrome X frágil (FXS) y los trastornos asociados son causados por la expansión de la repetición de trinucleótido de citosina-guanina-guanina (CGG) en la región no traducida (UTR) de 5' del promotor del gen Frágil X de retardación mental-1 (FMR1). Convencionalmente, el análisis de fragmentos de electroforesis capilar en un analizador genético se utiliza para el dimensionamiento de las repeticiones CGG de FMR1,pero se requiere un análisis adicional de la mancha sureña para la medición exacta cuando el número de repetición es superior a 200. Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación por PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando un kit de PCR X Frágil, seguido de la purificación de los productos pcR y el tamaño de los fragmentos en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y interpretación posterior del número de repeticiones de CGG haciendo referencia a normas con repeticiones conocidas utilizando el software de análisis. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar toda la gama de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1, incluidos aquellos con un número repetido de más de 200 (clasificados como mutación completa), 55 a 200 (premutación), 46 a 54 (intermedio) y 10 a 45 (normal). Es un método rentable que facilita la clasificación de los trastornos asociados al FXS y X frágiles con robustez y tiempo de notificación rápido.

Los resultados de tamaño de la muestra de referencia femenina de premutación (NA20240, tamaños de repetición de 30 y 80) y la muestra de referencia femenina de mutación completa (NA20239, tamaños de repetición de 20 y 200) se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B,respectivamente. Normalmente, dos picos de marcador (marcador inferior 50 pares base [bp] y marcador superior 10.380 bp) se incluyen en el perfil de tamaño de fragmento. Por lo general, hay un...

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A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Un ensayo preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X de retraso mental-1 facilita el diagnóstico molecular y el cribado del síndrome de X frágil y las repeticiones X frágiles trastornos con menor tiempo de respuesta e inversión en equipos.

Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X mental retardado-1

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Este método rentable puede encontrar amplias aplicaciones en el diagnóstico molecular y la detección de FXS y trastornos relacionados con la X frágil. Es rápido en tiempo de entrega y menos inversión en equipos. Nuestro ensayo basado en PCR puede facilitar la clasificación del espectro completo del FXS y los trastornos asociados a X frágil, incluyendo la mutación intermedia, premutación y completa con robustez y tiempo de notificación rápido.El procedimiento será demostrado por Weng Chua de PerkinElmer Singapur. Comience eliminando la mezcla de tampón de PCR, el diluyente de muestra y las muestras de ADN del congelador celsius de 20 grados, y dejándolas a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para descongelarlas. Antes de usar los reactivos, el vórtice y girarlos brevemente hacia abajo.Mida la concentración de la muestra de ADN con un espectrofotómetro y, si es necesario, diluya a 25 nanogramos por microlitro con diluyente de muestra. Etiquete los pozos de una placa PCR para identificar muestras de ADN de referencia y probadas y calcular el número de reacciones necesarias para las muestras de prueba, referencia y control negativo. Prepare la mezcla maestra de PCR combinando 15 microlitros de mezcla de tampón PCR a 0,6 microlitros de diluyente de muestra y 0,4 microlitros de polimerasa para cada reacción.Haz un vórtice la mezcla y gílala hacia abajo. A continuación, dispensar 18 microlitros de la mezcla en cada pozo. A continuación, pipetee dos microlitros de cada ADN en el pozo apropiado.Mezcle los reactivos pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces, luego selle la placa. Coloque la placa en el termociclador y ejecute la PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Precaliente la coctelera a 65 grados Centígrados y añada 80 microlitros de 1X Tampón TE a cada producto PCR.Utilice una pipeta multicanal para transferir las muestras a una placa de limpieza de PCR y coloque la placa en la coctelera. Incubarlo a 65 grados centígrados mientras agita a 1200 RPM durante 10 minutos. Después de la incubación, enfríe la coctelera hasta 25 grados Celsius, ajuste el instrumento de vacío a 250 milibares y aspire la solución a través del filtro.Después de 15 minutos, los pozos no deben tener líquido restante. Apague la aspiradora y añada 50 microlitros de búfer 1X TE a cada pozo. Aspirar la solución durante 10 minutos utilizando los ajustes de vacío anteriores.Seque la parte inferior de la placa de filtro presionando firmemente en una pila de toallas de papel y luego agregue 20 microlitros de 1X TE tampón al centro inferior de cada pozo. Coloque la placa en la coctelera e incubar a 25 grados Centígrados mientras agita a 1200 RPM durante cinco minutos. Después de la incubación, transfiera al menos 15 microlitros del producto PCR purificado a una placa PCR fresca de 96 pocillos.Antes de comenzar, lleve el concentrado de tinte de ADN, la matriz de gel de ADN, el marcador de ADN, la escalera de ADN y las muestras de ADN purificado a temperatura ambiente. Configure la estación de cebado reemplazando la jeringa y ajustando la placa base, luego suelte la palanca del clip de la jeringa y deslícela a la posición superior. Inicie el software de dimensionamiento y prepare la mezcla de tinte de gel.Vórtice el concentrado de tinte durante 10 segundos, luego gírtelo hacia abajo. A continuación, añadir 25 microlitros del tinte a un vial de matriz de gel y vórtice la solución para mezclar. Transfiera la mezcla de tinte de gel a un filtro de centrifugado, colóquela en la centrífuga y gírquela durante 10 minutos a 1500 g.Cuando esté listo para cargar la mezcla de tinte de gel, inserte un nuevo chip de ADN en la estación de cebado y agregue nueve microlitros de la mezcla de tinte de gel en el pozo que está marcado con G.Cierre la estación de cebado y asegúrese de que el émbolo esté colocado en la marca de un mililitro. Presione el émbolo de la jeringa hacia abajo hasta que quede presionado por el clip. Espere exactamente 30 segundos y, a continuación, suelte el clip.Espere cinco segundos más y, a continuación, tire lentamente del émbolo de vuelta a la posición de un mililitro. Abra la estación de cebado y agregue nueve microlitros de mezcla de colorante de gel en los pozos marcados con G.Add cinco microlitros de marcador en el bien marcado con un símbolo de escalera y cada uno de los 12 pozos de muestra. Agregue un microlitro de la escalera al pozo con el símbolo de escalera y un microlitro del producto PCR o agua a los pozos de muestra.Vórtice el chip durante un minuto a 2400 RPM. Insértelo en el bioanalizador y ejecute el chip en cinco minutos. Una vez completada la ejecución, exporte los datos de pico como archivos de tabla csv.Una muestra femenina de premutación y una muestra femenina de mutación completa se utilizan como muestras de referencia. Un pico de marcador superior e inferior se incluyen en el perfil de tamaño del fragmento, y por lo general hay un pico complejo de imprimación en unos 95 pares base. Estas muestras de referencia se utilizan para construir una curva estándar de regresión.A continuación, la curva estándar de regresión lineal se utiliza para calcular tamaños de repetición de muestras desconocidas. Las muestras clínicas normales, intermedias, de premutación, de mutación completa y de mutación completa del mosaico se pueden clasificar correctamente con este método. En algunos casos, sólo se muestra un pico en los resultados de la electroforesis microfluídica, que es probable debido a la presencia de alelos homocigotos normales.Un tipo de resultado subóptimo es el sesgo de línea base, que puede ser ambiguo o poco interpretable, y se sospecha que es causado por un mal funcionamiento del instrumento. Al intentar este procedimiento, es importante asegurar la cantidad adecuada de ADN y calidad antes de iniciar el protocolo. La secuenciación del gen FMR1 se puede realizar para identificar el patrón de interrupción de AGG.Y la enzima de restricción sensible a la metilación o el ensayo de modificación de bisulfuro se pueden utilizar para monitorear el estado de metilación. Esta es una técnica rápida, robusta y rentable. Ayudará a otros investigadores a realizar un estudio basado en la población sobre el estado portador de FXS y trastornos asociados a X frágiles.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Investigación

Genética

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Cuantificación de la Pigmentación Abdominal en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...