Name: a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene
Uploaded: 2019-09-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

Bu araştırma NSFC Acil Durum Yönetimi Projesi (Hibe No. 81741004), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 81860272), Guangxi İl Bilim ve Teknoloji Vakfı Ana Araştırma Planı hibe tarafından desteklenmiştir ( Hibe No AB16380219), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Hibe (Grant No. 2018M630993) ve Guangxi Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi tarafından etik onay verildi―Yeni Bölgeler Doğu Küme Klinik Araştırma Etik Komitesi (Referans Numarası: 2013.055)
1. PCR amplifikasyon
<ol><li>Başlamadan önce, -20 °C'lik dondurucudan PCR tampon karışımını, numune dilüent ve DNA örneklerini (hem test hem de referans DNA) çıkarın ve tüm reaktiflerin ve DNA'nın tamamen çözülmesini sağlamak için 20-30 dakika oda sıcaklığında tutun. Vorteks ve kısaca kullanmad...

<ol>
	<li>Verkerk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+(FMR-1)+containing+a+CGG+repeat+coincident+with+a+breakpoint+cluster+region+exhibiting+length+variation+in+fragile+X+syndrome.">Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome.</a> Cell. 65, 905-914 (1991).</li><li>Fu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+CGG+repeat+at+the+fragile+X+site+results+in+genetic+instability:+resolution+of+the+Sherman+paradox.">Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox.</a> Cell. 67, 1047-1058 (1991).</li><li>Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+functions+for+FMRP+in+axon+growth+cone+motility+and+activity-dependent+regulation+of+filopodia+and+spine+synapses.">Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).</li><li>Didiot, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-quartet+containing+FMRP+binding+site+in+FMR1+mRNA+is+a+potent+exonic+splicing+enhancer.">The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer.</a> Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).</li><li>Bechara, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+fragile+X+mental+retardation+protein+in+translational+activation.">A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation.</a> PLoS Biology. 7, e16 (2009).</li><li>Ascano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+targets+distinct+mRNA+sequence+elements+to+regulate+protein+expression.">FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression.</a> Nature. 492, 382-386 (2012).</li><li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements.">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).</li><li>Oberle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+of+a+550-base+pair+DNA+segment+and+abnormal+methylation+in+fragile+X+syndrome.">Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome.</a> Science. 252, 1097-1102 (1991).</li><li>Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome+and+targeted+treatment+trials.">Fragile X syndrome and targeted treatment trials.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).</li><li>Hatton, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autistic+behavior+in+children+with+fragile+X+syndrome:+prevalence,+stability,+and+the+impact+of+FMRP.">Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).</li><li>Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+mental+retardation+with+the+fragile+X.+A+study+of+15+families.">X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families.</a> Human Genetics. 59, 281-289 (1981).</li><li>Backes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+and+behavioral+profile+of+fragile+X+boys:+correlations+to+molecular+data.">Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data.</a> American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+analysis+of+1112+prenatal+samples+from+1991+to+2010.">Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010.</a> Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).</li><li>Nolin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+fragile+X+CGG+repeat+in+females+with+premutation+or+intermediate+alleles.">Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles.</a> American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).</li><li>Fernandez-Carvajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+an+FMR1+grey-zone+allele+to+a+full+mutation+in+two+generations.">Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).</li><li>Terracciano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+to+full+mutation+of+a+FMR1+intermediate+allele+over+two+generations.">Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations.</a> European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).</li><li>Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+FXTAS.">Advances in understanding the molecular basis of FXTAS.</a> Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).</li><li>Juncos, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+clinical+findings+in+the+fragile+X-associated+tremor+ataxia+syndrome+(FXTAS).">New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS).</a> Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).</li><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intention+tremor,+parkinsonism,+and+generalized+brain+atrophy+in+male+carriers+of+fragile+X.">Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X.</a> Neurology. 57, 127-130 (2001).</li><li>Conway, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ovarian+failure+and+FMR1+gene+mutations:+an+update.">Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update.</a> Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).</li><li>Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+premutations+in+familial+premature+ovarian+failure.">Fragile X premutations in familial premature ovarian failure.</a> Lancet. 346, 309-310 (1995).</li><li>Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+early+premature+ovarian+failure+in+two+sisters+compound+heterozygous+for+the+FMR1+premutation.">Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation.</a> European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).</li><li>Bourgeois, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fragile+X+premutation+disorders:+expanding+the+psychiatric+perspective.">A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective.</a> Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).</li><li>Farzin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders+and+attention-deficit/hyperactivity+disorder+in+boys+with+the+fragile+X+premutation.">Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation.</a> Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).</li><li>Hantash, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+premutation+carrier+frequency+in+patients+undergoing+routine+population-based+carrier+screening:+insights+into+the+prevalence+of+fragile+X+syndrome,+fragile+X-associated+tremor/ataxia+syndrome,+and+fragile+X-associated+primary+ovarian+insufficiency+in+the+United+States.">FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States.</a> Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).</li><li>Kraan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+allele+size+distribution+in+35,000+males+and+females:+a+comparison+of+developmental+delay+and+general+population+cohorts.">FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts.</a> Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).</li><li>Saul, R. A., Tarleton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1-Related+Disorders.">FMR1-Related Disorders.</a> GeneReviews. , (2012).</li><li>Amos Wilson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+characterization+of+16+FMR1+reference+materials:+a+consortium+study.">Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).</li><li>Kwok, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+robust+PCR-based+assay+for+quantifying+fragile+X+CGG+repeats.">Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats.</a> Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).</li><li>Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+carriers+of+premutation-size+alleles+of+the+FMRI+gene--and+implications+for+the+population+genetics+of+the+fragile+X+syndrome.">Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome.</a> American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).</li><li>Tassone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+CGG+allele+size+and+prevalence+ascertained+through+newborn+screening+in+the+United+States.">FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States.</a> Genome Medicine. 4, 100 (2012).</li><li>Dombrowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premutation+and+intermediate-size+FMR1+alleles+in+10572+males+from+the+general+population:+loss+of+an+AGG+interruption+is+a+late+event+in+the+generation+of+fragile+X+syndrome+alleles.">Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles.</a> Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).</li><li>Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+instability+of+fragile+X+alleles:+implications+for+offering+fragile+X+prenatal+diagnosis.">Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis.</a> Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).</li><li>Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+assays+for+the+fragile+X-related+disorders.">Recent advances in assays for the fragile X-related disorders.</a> Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).</li><li>Seltzer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+CGG+expansions+of+the+FMR1+gene+in+a+US+population-based+sample.">Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample.</a> American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).</li><li>Hayward, B. E., Usdin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+determining+repeat+number,+methylation+status,+and+AGG+interruptions+in+the+Fragile+X-related+disorders.">Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).</li><li>Orrico, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+full+mutation+and+normal-sized+allele+of+the+FMR1+gene:+a+new+case.">Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case.</a> American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).</li><li>Schmucker, B., Seidel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism+for+a+full+mutation+and+a+normal+size+allele+in+two+fragile+X+males.">Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males.</a> American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).</li></ol>

FXS trizomi sonra entelektüel bozukluğun ikinci en sık nedenidir 21, X bağlı zeka geriliği yaklaşık yarısı için muhasebe30, yaklaşık 1 etkileyebilir 4,000 erkek ve 1 8.000 kadın. Daha da önemlisi, yaklaşık 1 250-1.000 kadın bir premutasyon taşımak, ve bu frekans 1 250-1.600 erkeklerde26,31,32,33. CGG'nin premutasyon alelleri yavrulara iletildiğinde t...

Kırılgan X sendromu (FXS) ve Kırılgan X ilişkili bozukluklar, örneğin, titreme ve ataksi sendromu (FX-TAS) ve primer yumurtalık yetmezliği (FX-POI) esas olarak 5' çevrilmemiş trinükleotid tekrar genişleme sitozin-guanin-guanin (CGG) neden olur Xq27.31,2'deKırılgan X mental retardasyon-1(FMR1)geninin bölge (UTR) FMR1 kodlanmış protein (FMRP), mRNA veya modüle sentezin inkbiyotasyon, stabilite ve dendritik taşınmasını düzenleyerek nöronal gelişim ve sinaptik plastisitede işlev veren poliribozom ile ilişkili RNA-bağlayıcı bir proteindir. kısmi postsinaptik proteinlerin3,4,5,6,7.
>200 CGG tekrar boyutu ile dinamik varyasyon tam mutasyon olarak tanımlanır, hangi anormal hipermetilasyon ve FMR1 organizatörü sonraki transkripsiyonel susturma neden olur8. Ortaya çıkan fmrp protein yokluğu veya eksikliği normal nöronal gelişimi bozar veFXSneden 9 , çeşitli klinik belirtiler ile karakterize, şiddetli zihinsel özürlülük orta dahil olmak üzere, gelişimsel gecikme, hiperaktif davranışlar, kötü temas ve otistik belirtileri10,11,12. Kadın FXS hastalarında sunum genellikle erkeklerde olduğundan daha hafiftir. 55-200 ve 45-54 arasında değişen CGG tekrar boyutu sırasıyla premutasyon ve ara durum olarak sınıflandırılır. İstikrarsızlık yüksek derecede nedeniyle, bir premutasyon veya ara alel CGG tekrar boyutu muhtemelenyavru13,14iletildiğinde genişletir . Bu nedenle, premutasyon alelleri olan taşıyıcılar tekrar genişleme nedeniyle FXS etkilenen çocuk sahibi olma riski yüksektir, ve bazı durumlarda, ara aleller iki nesil boyunca tam mutasyon aralığına tekrar boyutunu genişletebilirsiniz15, 16. yıl. Ayrıca, premutasyon ile erkekler de geç başlangıçlı FX-TAS17,18,19gelişme riski iletmek, premutasyon kadın hem FX-TAS ve FX-POI için yatkın iken20, 21,22. Son zamanlarda, bu gelişimsel gecikme ve sosyal davranışlarda sorunlar ile otistik spektrum bozuklukları premutasyon FMR1 alelleri23olan çocuklarda sunulmaktadır bildirilmiştir,24.
Tam CGG tekrar boyutunu belirlemek için sınıflandırma ve FXS ve Kırılgan X ilişkili bozuklukların tahmini için büyük öneme sahiptir25,26. Tarihsel olarak, CGG tekrar bölgeye özgü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) parça boyutlandırma artı Güney leke analizi ile FMR1 CGG tekrar27moleküler profilleme için altın standart olmuştur. Ancak, geleneksel spesifik PCR 100-130'dan fazla tekrarile büyük premütasyonlara karşı daha az duyarlıdır ve tam mutasyonları yükseltmekten acizdir27,28. Ayrıca, tekrar boyutlandırma için geleneksel bir genetik analizör üzerinde kılcal elektroforez fazla 200 CGG tekrarları ile FMR1 PCR ürünleri tespit etmek için başarısız olur. Güney leke analizi, normalden tam mutasyon tekrar sayılarına kadar daha geniş bir tekrar boyutu aralığının farklılaşmasını sağlar ve tam mutasyonu doğrulamak için (erkeklerde) ve heterozigot alelleri tam mutasyonile ayırt etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. normal tekrar boyutları ile görünüşte homozigot aleller (kadınlarda). Ancak, yinelemeleri ölçmek için çözünürlük sınırlıdır. Daha da önemlisi, bu adım adım test stratejisi emek yoğun, zaman alıcı ve maliyet-etkisiz.
Burada, FMR1CGG tekrarları nicelleştirme için doğru ve sağlam PCR tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Fragile X PCR kitini kullanarak FMR1 organizatörün 5'UTR'deki tekrar dizilerinin PCR yükseltilmesidir. PCR ürünleri saflaştırılır ve parça boyutlandırma bir mikroakışkan kapiller elektroforez aleti üzerinde gerçekleştirilir ve analiz yazılımı kullanılarak CGG tekrarlarının sayısının daha sonra yorumlanması, PCR parça uzunluğunun CGG tekrarlarının sayısıyla doğru orantılı olduğu gerekçesi. PCR sistemi, gc açısından zengin trinükleotid tekrar bölgesinin amplifikasyonunu kolaylaştıran reaktifler içerir. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve FMR1 organizatörleri CGG tekrarları tüm aralıkları tespit yeteneğine sahiptir. Bu daha az dönüş süresi ve ekipman yatırım ile FXS ve Kırılgan X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve tarama geniş uygulama bulabilirsiniz ve böylece, klinik daha geniş bir yelpazede kullanılabilir maliyet-etkin bir yöntemdir Laboratuvar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td>For Fragment sizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA chips</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 kit: Syringe</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-4401</td>
			<td>Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cubee Mini-centrifuge</td>
			<td>GeneReach</td>
			<td>aqbd-i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX2004718</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6122050</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>XX1004705</td>
			<td>Filter plate vacuum Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>3101-0010</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase PCR Buffer mix</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) 
			FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FragilEase Polymerase</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FraXsoft analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>743100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reference DNA sample</td>
			<td>Coriell</td>
			<td>NA20240 &#38; NA20239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 96-well Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td>This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti&#8482; 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriNEST Incubator/Shaker instrument</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1296-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977015</td>
			<td>For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0256 (Model G560E)</td>
			<td>Conventional vortex mixer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust polymerase chain reaction-based assay for quantifying cytosine-guanine-guanine trinucleotide repeats in fragile x mental retardation-1 gene

Kırılgan X sendromu (FXS) ve ilişkili bozukluklar, Fragile X mental retardation-1(FMR1)gen organizatörünün 5' çevrilmemiş bölgesinde (UTR) sitozin-guanin-guanin (CGG) trinükleotid tekrarının genişlemesinden kaynaklanır. Geleneksel olarak, genetik bir analizör üzerinde kapiller elektroforez parça analizi FMR1CGG tekrarları boyutlandırma için kullanılır , ancak tekrar sayısı 200 daha yüksek olduğunda tam ölçüm için ek Güney leke analizi gereklidir. Burada, FMR1CGG tekrarlarının sayısallaştırılması için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı bir yöntem salıyoruz. Bu testin ilk adımı, Kırılgan X PCR kiti kullanılarak FMR1 organizatörü5'UTR'deki tekrar dizilerinin PCR amplifikasyonudur, ardından PCR ürünlerinin saflaştırılması ve mikroakışkan kapiller elektroforez aletinde parça boyutlandırması ve analiz yazılımı kullanarak bilinen tekrarlar ile standartlaratıfta bulunarak CGG tekrarları sayısının sonraki yorumu. Bu PCR tabanlı test tekrarlanabilir ve 200'den fazla (tam mutasyon olarak sınıflandırılır), 55-200 (premutasyon olarak sınıflandırılır), 46-54 (orta) ve 10'dan fazla tekrar numarası na sahip olanlar da dahil olmak üzere FMR1 organizatörlerinin CGG tekrarlarının tüm yelpazesini tanımlayabilme yeteneğine sahiptir ve 10 45 (normal). FXS ve Fragile X ile ilişkili bozuklukların sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile sınıflandırılmasını kolaylaştıran uygun maliyetli bir yöntemdir.

Mutasyon öncesi kadın referans örneğinin boyutlandırma sonuçları (NA20240, 30 ve 80 tekrar boyutları) ve tam mutasyon kadın referans örneği (NA20239, 20 ve 200 tekrar boyutları) sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'degösterilmiştir. Tipik olarak, parça boyutu profilinde iki işaretçi tepe noktası (alt marker 50 baz çifti [bp] ve üst marker 10.380 bp) yer almaktadır. Genellikle yaklaşık 95 bp boyutu ile bir astar karmaşık zirve vardır. Refe...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene at JoVE.c

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Fragile X mental retardasyon-1 genindeki sitozin-guanin-guanin trinükleotid tekrarlarının ölçülmesi için doğru ve sağlam polimeraz zincir reaksiyonu esaslı bir test, Kırılgan X sendromu ve Fragile X ile ilişkili moleküler tanı ve taramayı kolaylaştırır daha kısa dönüş süresi ve ekipman yatırımı ile bozukluklar.

Kırılgan X Mental Retardasyon-1 Genininde Sitozin-guanin-guanin Trinükleotid Tekrarlarının Ölçülmesi için Sağlam Polimeraz Zincir Reaksiyonu Esaslı Bir Test

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

Bu uygun maliyetli yöntem, FXS ve Fragile X ile ilgili bozuklukların moleküler tanı ve taramasında geniş uygulamalar bulabilir. Bu dönüş süresi hızlı ve ekipman daha az yatırım. PCR tabanlı testimiz, sağlamlık ve hızlı raporlama süresi ile orta, ön mutasyon ve tam mutasyon da dahil olmak üzere FXS ve Fragile X ile ilişkili bozuklukların tam spektrumunun sınıflandırını kolaylaştırabilir.Prosedür PerkinElmer Singapur Weng Chua tarafından gösterilecek. PCR arabellek karışımını, numune dilüentve DNA örneklerini 20 derecelik santigrat dondurucudan çıkararak ve çözülmek için 20 ila 30 dakika oda sıcaklığında bırakarak başlayın. Reaktifleri kullanmadan önce girdap ve kısaca aşağı çevirin.DNA numune konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün ve gerekirse numune seyreltici ile mikrolitre başına 25 nanograma seyreltin. Referans ı belirlemek ve DNA örneklerini test etmek ve test, referans ve negatif kontrol örnekleri için gerekli reaksiyon sayısını hesaplamak için bir PCR plakasının kuyularını etiketleyin. Her reaksiyon için 15 mikrolitre PCR tampon karışımını 0,6 mikrolitre numune dilüent ve 0,4 mikrolitre polimeraz ile birleştirerek PCR ana karışımıhazırlayın.Karışımı girdap ve aşağı çevir. Sonra her kuyuya karışımın 18 mikrolitre sini dağıtın. Sonra pipet uygun kuyuya her DNA iki mikrolitre.Reaktifleri beş kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın, sonra plakayı kapatın. Plakayı termocycler'a yerleştirin ve PCR'yi el yazması talimatlara göre çalıştırın. Kuvöz çalkalayıcıyı 65 santigrat dereceye önceden ısıtın ve her PCR ürününe 80 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin.Örnekleri PCR temizleme plakasına aktarmak ve plakayı çalkalayıcıya koymak için çok kanallı bir pipet kullanın. 1200 RPM'de 10 dakika sallayarak 65 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuluçka makinesini 25 santigrat dereceye kadar soğutun, vakum aletini 250 milibar'a ayarlayın ve çözeltiyi filtreden aspire edin.15 dakika sonra, kuyularda sıvı kalmamalıdır. Vakum kapatın ve her kuyuya 50 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin. Önceki vakum ayarlarını kullanarak çözümü 10 dakika aspire edin.Filtre plakasının alt kısmını kağıt havlu yığınına sıkıca bastırarak kurulayın ve her kuyunun alt merkezine 20 mikrolitre 1X TE tampon ekleyin. Beş dakika boyunca 1200 RPM sallayarak 25 santigrat derece de shaker ve kuluçka plaka yerleştirin. Kuluçkadan sonra, saflaştırılmış PCR ürününün en az 15 mikrolitresini yeni bir 96 iyi PCR plakasına aktarın.Başlamadan önce, DNA boya sıyrık, DNA jel matrisi, DNA marker, DNA merdiveni ve saflaştırılmış DNA örneklerini oda sıcaklığına getirin. Şırıngayı değiştirerek ve taban plakasını ayarlayarak astar istasyonunu ayarlayın, ardından şırınga klibinin kolu serbest bırakın ve üst konuma kaydırın. Boyutlandırma yazılımı başlatın ve jel boya karışımı hazırlamak.Girdap boya konsantresi 10 saniye, sonra aşağı spin. Sonra, bir jel matris şişe ve girdap çözeltisi karıştırmak için boya 25 mikrolitre ekleyin. Jel boya karışımını bir spin filtresine aktarın, santrifüje yerleştirin ve 1500 kez g'de 10 dakika döndürün.Jel boya karışımını yüklemeye hazır olduğunuzda, astar istasyonuna yeni bir DNA çipi yerleştirin ve G.Close astar istasyonunu işaretleyen kuyuya jel boya karışımının dokuz mikrolitresini ekleyin ve pistonun bir mililitrelik işarete yerleştirildiğinden emin olun. Şırınga pistonuna klip tarafından tutulana kadar bastırın. Tam olarak 30 saniye bekleyin ve ardından klibi bırakın.Beş saniye daha bekleyin ve sonra yavaşça bir mililitre konumuna geri piston çekin. Astar istasyonu açın ve bir merdiven sembolü ve her 12 örnek kuyuile işaretlenmiş içine işaretleyici beş mikrolitre G.Add işaretli işaretli içine jel boya karışımı dokuz mikrolitre ekleyin. Merdiven sembolü ve numune kuyularına BIR mikrolitre PCR ürünü veya su ile birlikte bir mikrolitre merdiven ekleyin.2400 RPM'de bir dakikalığına çipi gir. Biyoanalizöre yerleştirin ve çipi beş dakika içinde çalıştırın. Çalıştırma tamamlandığında, en yüksek verileri csv tablo dosyaları olarak dışa aktarın.Referans örnek olarak bir premutasyon kadın örneği ve tam mutasyon kadın örneği kullanılır. Bir üst ve alt marker tepe parçası boyutu profiline dahildir ve genellikle yaklaşık 95 baz çiftleri bir astar karmaşık tepe vardır. Bu referans örnekleri bir regresyon standart eğrisi oluşturmak için kullanılır.Doğrusal regresyon standart eğrisi daha sonra bilinmeyen örneklerin tekrar boyutlarını hesaplamak için kullanılır. Klinik normal, ara, premütasyon öncesi, tam mutasyon ve mozaik tam mutasyon örnekleri bu yöntemle doğru olarak sınıflandırılabilir. Bazı durumlarda, normal homozigot alellerin varlığınedeniyle mikroakışkan elektroforez sonuçlarında sadece bir tepe gösterilir.Bir tür suboptimal sonuç, belirsiz veya yorumlanamayan temel önyargıdır ve alet arızalarından kaynaklandığından şüphelenilir. Bu yordamı denerken, protokolü başlatmadan önce uygun miktarda DNA ve kalite sağlamak önemlidir. AGG kesinti modelini tanımlamak için FMR1 gen dizilemesi yapılabilir.Ve metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi veya bisülfit modifikasyon talimi metilasyon durumunu izlemek için kullanılabilir. Bu hızlı, sağlam ve uygun maliyetli bir tekniktir. Bu FXS ve Kırılgan X ilişkili bozuklukların taşıyıcı durumu üzerinde nüfus tabanlı bir çalışma yürüten diğer araştırmacılar alacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...