Name: serum free production of three-dimensional human hepatospheres from pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet med priser fra den britiske regenerative Medicine platform (MRC MR/L022974/1) og den ledende videnskabsmands kontor (TCS/16/37).

1. klargøring af Agopstået mikropladen forme
Bemærk: Medier, der anvendes til disse eksperimenter, skal være sterile og ved stuetemperatur (RT) for cellekultur.
<ol><li>
Forbered 2% agopstået forme.
	<ol>
<li>2 g lavsmeltnings temperaturer opløses i 100 mL steriliseret destilleret vand. Opvarm forsigtigt i en mikrobølgeovn med interval rystelser for at opløse fuldstændigt.</li>
		<li>Tilsæt 520 μL smeltet agopstået til en 256-brønd format skimmel og lad det størkne.</li>
		<li>Overfør hver agopstået mikroplade til en enkelt brønd af en 12-brønd plade.</li>
		<li>Tilsæt 1,5 mL 1x Dulbecco's fosfat-Buffered saltvand (DPBS) med ca2 +/mg2 + til hver brønd, og fjern luftboblerne fra mikrobrøndene ved forsigtigt at pipettere op og ned flere gange ved hjælp af en P1000-pipettespids. Dette udføres for at sikre ensartet celle såning. Bemærk: Agopstået mikroplader kan opbevares i op til 6 måneder ved 4 °C i 1x DPBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. såning af humane pluripotente stamceller i Agopstået Microwell-plader
<ol><li>
Klargøring af cellesuspension
	<ol>
<li>Aspirer mediet fra en udifferentieret kultur af hPSCs som tidligere beskrevet8. Bemærk: hpscs dyrkes på LN-521 i mTeSR1 med mediet ændret hver 24 h, og urerne regelmæssigt, når cellerne nå 75% til 85% af confluency som tidligere beskrevet8.</li>
		<li>Cellerne skylles med 5 mL RT 1x DPBS uden ca2 +/mg2 + , og bufferen fjernes.</li>
		<li>Tilsæt 5 mL 1x-celle dissociations reagens (tabel over materialer) til cellerne og Tillad celle dissociation ved at inkubere celler ved 37 °c i 6-8 min. Bemærk: For at stoppe reaktionen, undersøge celle løsrivelse under mikroskopet. Cellerne skal adskilles delvist fra pladen. Forlæng inkubationen for en ekstra 1-2 min., hvis længere tid er påkrævet.</li>
		<li>Stop reaktionen ved at fjerne celle dissociations reagenset og tilsæt 5 mL frisk mTeSR1 medium suppleret med 10 μM Rho-associeret kinase (ROCK) inhibitor Y27632 til cellerne. Dissociér celler ved pipettering op og ned flere gange ved hjælp af en P1000-pipettespids.</li>
		<li>Tæl de levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer og trypan og et blå farvning udelukkelse. Forbered derefter cellesuspensionen ved den ønskede koncentration.</li>
		<li>Beregn det samlede antal celler, der skal bruges. For 3D hepatosphere differentiering, frø 3,84 x 105 celler pr agopstået mikropladen til at generere sfæroider med 100-150 μm i diameter.</li>
		<li>Det ønskede antal celler overføres til et sterilt 15 mL eller 50 mL centrifugeglas, og røret centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved rt for at pille cellerne.</li>
		<li>Aspirér og kassér supernatanten og resuspender cellerne i mTeSR1 medium plus 10 μM ROCK inhibitor Y27632. Celle pellet fortyndes i et passende volumen medium til en endelig koncentration på 2,1 x 106 celler/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Såning af cellerne til de forberedte agopstået mikroplader Bemærk: hvis du bruger køleskab-opbevarede mikroplader, skal du anbringe dem i celle inkubator ved 37 °c i mindst en time før brug og aspirere 1X DPBS fra brønden før celle såning.<ol>
<li>Tilsæt 190 μL af cellesuspensionen til den agopstået microwell.</li>
		<li>Efter såning returneres pladerne til celle inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 2 h for at tillade cellerne at bosætte sig.</li>
		<li>Efter 2 timer tilsættes 1 mL frisk og varm mTeSR1 medium suppleret med 10 μM ROCK inhibitor Y27632 til hver brønd.</li>
		<li>Returner pladerne til celle inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h og undersøge dannelsen af kugler den næste dag for at tillade cellerne at vedhæfte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. differentiering af hPSCs til 3D-Hepatospheres på Agopstået mikrobrønde
<ol><li>Fremstilling af poly 2-hydroxyethyl methacrylat (Poly-HEMA) belagte brønde
	<ol>
<li>2 g poly-HEMA opløses i 100 mL 95% ethanol. Opløsningen omrøres natten over med en kogeplade ved 55 °C. Tilsæt 250 μL poly-HEMA opløsning pr. brønd af en 24-brønd plade og tør natten over ved 60 °C ved hjælp af en ovn.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af differentierings mediet
	<ol>
<li>Forbered en 1.000 x stamopløsning af menneskelig aktivitet ved at opløse menneskelig aktivitet et lyofiliseret protein i steril 0,2% bovint serumalbumin (BSA)/DPBS til en endelig koncentration på 100 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.</li>
		<li>Forbered en 1.000 x stamopløsning af Wnt3a ved at opløse muse Wnt3a lyofiliseret protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Brug på 1:200.</li>
		<li>Forbered en 1.000 x stamopløsning af menneskelig hepatocytter vækstfaktor (HGF) ved at opløse humant HGF lyofiliseret protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.</li>
		<li>Der forberedes en 1.000 x stamopløsning af oncostatin M (OSM) ved at opløse OSM i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 20 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.</li>
		<li>Forbered en 1000x stamopløsning af epitelial vækstfaktor (EGF) ved at opløse det lyofiliserede protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.</li>
		<li>Forbered en 1.000 x stamopløsning af grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) ved at opløse det lyofiliserede protein i sterile 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.</li>
		<li>Forbered en 1.000 x stamopløsning af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) ved at opløse det lyofiliserede protein i 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.</li>
		<li>Gør endoderm differentiering medium bestående af Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium suppleret med 2% B27 supplement (50x, uden insulin), og 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer: 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). Med mindre andet er angivet, skal der ved hver medium ændring suppleres med Wnt3a og Activity A i en endelig koncentration på henholdsvis 50 ng/mL og 100 ng/mL. Bemærk: Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for to uger.</li>
		<li>Gør hepatoblast differentierings medium bestående af knockout Dulbecco's modificerede Eagle medium (KO-DMEM) med 20% knockout serum udskiftning (KOSR) og suppleret med 0,5% af et alternativt supplement til L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% dimethylsulfoxid (DMSO) og 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved henholdsvis 100 IE/mL og 100 μg/mL). Filter under vakuum. Bemærk: Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for to uger.</li>
		<li>Gøre hepatocyt modning medium bestående af hepatocyt medium suppleret med 1% af en alternativ supplement til L-glutamin, 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinat natriumsalt (HCC), 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved 100 iu/ml og henholdsvis 100 μg/mL). For hver medium ændring, supplere den krævede volumen med OSM og HGF (endelige koncentrationer ved 20 ng/mL og 10 ng/mL, hhv.). Bemærk: Opbevar bestanden ved 4 °C, og brug den inden for to uger.</li>
		<li>Gør hepatocyt vedligeholdelses medium bestående af William's E medium suppleret med 10% knockout serum udskiftning, bestående af 1% af et alternativt supplement til L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). For hver medium ændring, supplere den nødvendige mængde med HGF, EGF, bFGF og VEGF (den endelige koncentration af hver vækstfaktor på 10 ng/mL). Bemærk: Opbevar bestanden ved 4 °C, og brug den inden for to uger.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrollere hepatosphere dannelse 24 h efter såning og initiere hepatocyt differentiering. Fjern forsigtigt mTeSR1 mediet og Udskift det med 1 mL frisk endoderm differentierings medium suppleret med 100 ng/mL Activity A og 50 ng/mL Wnt3a.</li>
	<li>Ændring suppleret endoderm priming medium hver 24 h i 3 dage for hESCs. Når du arbejder med hiPSCs, forlænge denne fase i yderligere 2 dage supplere medierne med Activity A (100ng/mL) alene.</li>
	<li>Efter definitive endoderm induktion, skifte til hepatoblast differentiering medium for hepatoblast specifikation for 5 dage udskiftning af mediet hver 2 dage og udføre den sidste ændring på den sidste dag i hepatoblast specifikation.</li>
	<li>Overfør hepatokugler til poly-HEMA coatede brønde.
	<ol>
<li>Vask cellerne en gang med hepatocyt modning medium uden kosttilskud efter fjernelse KSR/DMSO medium og tilsæt 1 ml hepatocyt modning medium suppleret med 10 ng/ml hgf og 20 ng/ml OSM.</li>
		<li>Brug en P1000-pipette til at løfte hepatosfærerne fra den agopstået mikroplade ved at pipettere op og ned i opløsningen flere gange.</li>
		<li>Overfør mediet indeholdende hepatosfærerne til en poly-HEMA belagt godt.</li>
		<li>Vask agopstået mikropladen ved hjælp af 1 mL hepatocyt modning medium suppleret med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM og overføre mediet til poly-HEMA belagt godt.</li>
		<li>Gentag trin 3.6.4 så mange gange som muligt for at overføre alle hepatosfærerne fra den agopstået mikroplade. Bemærk: Det er vigtigt omhyggeligt at pipettere op og ned i opløsningen, der indeholder hepatoksfærerne, for at undgå at beskadige dem.</li>
	</ol></li>
	<li>Aspirér forsigtigt overskydende medium uden at fjerne hepatospheres ved hjælp af en P100 pipette, indtil ~ 1 mL medium indeholdende hepatosfærerne forbliver i Poly-HEMA belagt godt.</li>
	<li>Skift mediet hver 48 h i 12 dage.</li>
	<li>På dag 20, når du arbejder med hESCs eller dag 22, hvis du arbejder med hipscs, skal du skifte medium til hepatocyt Maintenance medium.
	<ol>
<li>Fjern hepatocyt modning medium og vaske celler en gang med hepatocyt vedligeholdelse medium uden kosttilskud. Tilsæt 1 mL hepatocyt vedligeholdelses medium suppleret med 10 ng/mL HGF, EGF, FGF og VEGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Skift medium for frisk hepatocyt vedligeholdelse medium hver 48 h.</li>
</ol>4. funktionel analyse af langsigtede kulturperler 3D Hepatospheres
<ol><li>Skift til hepatocyt modning medium suppleret med 10 μM HCC, L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis) og 10 ng/mL HGF 48 h forud for udførelse af funktionelle analyse.</li>
	<li>
Analysér hepatocyt metaboliske funktion ved hjælp af cytochrom (CYP) P450 assays.
	<ol>
<li>Udskift medium med 1 mL frisk hepatocyt modnings medium suppleret med 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-benzyl ether (luciferin-PFBE) substrat til påvisning af CYP3A basal aktivitet eller 100 μM luciferin-methylether (luciferin-ME) substrat til påvisning af CYP1A2 basal aktivitet (antal replikater = 3). Brug vævskultur medier som en negativ kontrol. Bemærk: For at undgå Cross-reaktivitet, anbefales det ikke at bruge de samme brønde, der indeholder 3D hepatospheres at teste forskellige CYP P450 aktiviteter, men at udføre dem i individuelle brønde.</li>
		<li>Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 ° C.</li>
		<li>Supernatanterne opsamles ved hjælp af en P100-pipettespids, og analysen udføres som angivet i producentens anvisninger.</li>
		<li>Måle de relative niveauer af basal aktivitet og normalisere til per mg protein som bestemt af bicinchonininsyre assay (BCA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test serumprotein produktion ved hjælp af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA).
	<ol>
<li>Udskift medium med 1 mL frisk hepatocyt modnings medium suppleret med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM (antal replikater = 3). Brug vævskultur medier som en negativ kontrol.</li>
		<li>Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 ° C.</li>
		<li>Opsaml supernatanten ved hjælp af en P100 pipettespids, og mål de relative niveauer af serumprotein produktion som pr. producentens anvisninger.</li>
		<li>Normalisere til per mg protein som bestemt af BCA assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immunocytokemi
<ol><li>
Tilberedning af paraffin sektioner indeholdende hepatospheres.
	<ol>
<li>Vask hepatosfærerne tre gange med 1x DPBS.</li>
		<li>Fastgør hepatosfærerne med iskold methanol i 30 min.</li>
		<li>Vask tre gange med 1x DPBS.</li>
		<li>Integrer hepatosfærerne i 300 μL af en hærdet opløsning på 2% agopstået opløst i H2O ved hjælp af en tom brønd af en 24-brønd plade som en skimmel og lad den størkne i 30 min.</li>
		<li>Integrer den agopstået indeholdende hepatospheres i paraffin.</li>
		<li>Afsnittet paraffin blokken indeholdende faste hepatokugler i 4 μm tykke sektioner ved hjælp af en mikrotom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De-voksning og rehydrering af sektionerne. Bemærk: brug friske løsninger, når det er muligt. Brug ikke opløsninger, der har været på farvnings truget i mere end en uge.<ol>
<li>Placer sektioner i et slide rack.</li>
		<li>Nedsænk glide stativet med sektioner i en farvnings skinne, der indeholder 300 mL xylen i 5 min.</li>
		<li>Gentag trin 5.2.2.</li>
		<li>Nedsænk i absolut ethanol for 20 s.</li>
		<li>Nedsænk i 95% ethanol for 20 s.</li>
		<li>Nedsænk i 90% ethanol for 20 s.</li>
		<li>Nedsænk i 80% ethanol for 20 s.</li>
		<li>Nedsænk i 70% ethanol for 20 s.</li>
		<li>Rehydrere sektionerne med vand i 5 min. Bemærk: Vedligehold diasene i samme slide rack, og flyt dem fra en farvnings skinne til den næste. Den anvendte mængde (generelt ~ 300 mL) afhænger af størrelsen af farvnings truget.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigen udtagning af paraffin sektioner indeholdende hepatospheres.
	<ol>
<li>Varme de-voksede og rehydrerede sektioner i 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 bufferopløsning til 15 min i en mikrobølgeovn ved 800 W.</li>
		<li>Afkøl prøverne ved at fordybe dem i vand fra hanen i 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immun.
	<ol>
<li>Incubate glider med en blokerende opløsning fremstillet af PBS med 0,1% Polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA i 1 time ved RT.</li>
		<li>Udskift blokerende opløsning med det relevante primære antistof fortyndet i PBS/T/1% BSA og Inkuber ved 4 °C med blid agitation natten over.</li>
		<li>Vask cellerne med PBS/T i 5 min. og Gentag tre gange.</li>
		<li>Inkubatér med det relevante sekundære antistof fortyndet i PBS/T/1% BSA og Inkuber i mørket ved RT i 1 time med blid agitation. Bemærk: De optimerede primære og sekundære antistoffer er opført i tabel over materialer.</li>
		<li>Vask cellerne med PBS/T i 5 min. og Gentag tre gange.</li>
		<li>Tilsæt 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til cellerne i henhold til producentens anvisninger, og Placer forsigtigt en glas dækseddel for at reducere luftbobler. Opbevar faste celler ved 4 °C i mørke. Observere farvning under et mikroskop med passende filter og fluorescerende lampe. Bemærk: Opbevar plader ved 4 °c i mørke indtil billeddannelse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Differentiation+of+Hepatocytes+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+Exhibiting+Markers+Recapitulating+Liver+Development+In+vivo.">Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo.</a> STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Hannan, N. R., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatocyte+like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Functional+Human+Hepatic+Endoderm+from+Human+iPS+cells.">Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells.</a> Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Generation+of+Human+Hepatocyte-like+Cells+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+Production+of+Hepatocyte+Like+Cells+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Innate+Immunity+Improves+Hepatitis+C+Virus+Infection+and+Replication+in+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes.">Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).</li><li>Lyall, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+human+hepatocyte-like+cells.">Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Lucendo-Villarin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+foetal+exposure+to+maternal+smoking+using+hepatoblasts+from+pluripotent+stem+cells.">Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells.</a> Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+networks+and+transcription+factor+motifs+defining+the+differentiation+of+stem+cells+into+hepatocyte-like+cells.">Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells.</a> Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).</li><li>Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+hepatocytes:+using+materials+to+define+cellular+differentiation+and+tissue+engineering.">Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).</li><li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development.">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Gieseck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLoS ONE. 9 (1), (2014).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+hepatospheres+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+and+Reproducible+Production+of+Liver+Buds+Entirely+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li></ol>

David C. Hay er medstifter af og aktionær i Stemnovate Ltd og HigherSteaks Ltd. Resten af forfatterne bekræfter, at de ikke har nogen interessekonflikter i det emne eller materiale, der diskuteres i denne artikel.

Udviklingen af definerede og Xeno-fri systemer til at producere humane hepatspheres i 3D er nødvendig for både in vitro og in vivo bestræbelser. På nuværende tidspunkt de fleste hepatocyt differentiering tilgange fra humane pluripotente stamceller udføres i to dimensionelle tilhængere kulturer. Disse miljøer mangler mange af de miljømæssige signaler involveret i væv Genesis og homøostase, som omfatter; Heterotypiske celle interaktioner, matrix produktion og Remodeling, hvilket resulterer i dårlig oversættelse til in vivo biologi18,19.
Som et resultat, forskning har fokuseret på alternative tilgange til at generere hepatospheres fra pluripotente stamceller. En række 3D-undersøgelser har fremmet marken, men de er afhængige af animalske produkter20,22,24 for at yde støtte og/eller kræve anvendelse af humant væv21,22 hvilket komplicerer teknologi opskalering og kompromitterer eksperimentel reproducerbarhed og anvendelse.
Den procedure, der er beskrevet i vores artikel (figur 1), er defineret, effektiv, meget reproducerbar og omkostningseffektiv, hvilket gør det muligt at fremstille funktionelle lever kugler, som forbliver funktionelle over et år in vitro og giver kritisk lever støtte i vivo14. Vigtigere, denne platform giver brugeren mulighed for at kontrollere størrelsen af 3D leveren kugler, begrænse dannelsen af tætte nekrotiske Centre og tab af phenotype.
Overførslen af 3D-hepatosfærerne til poly-HEMA-belagte plader udgør et kritisk skridt i denne protokol. Det er vigtigt at pipetten forsigtigt på dette trin i proceduren for at undgå at beskadige kuglen. Desuden skal medieændringer udføres omhyggeligt for at undgå forskydnings stress og forvrængning af kugle strukturen.
I disse undersøgelser, 3D hepatospheres vist en organiseret struktur (figur 2 og figur 3), cytochrom P450 funktion (figur 4) og udskilles lever proteiner, herunder albumin og alpha-fetoprotein (figur 5). Denne procedure er blevet udført med succes i fire pluripotente stamceller linjer med sammenlignelige resultater. Når man ser fremad, kan denne teknologi anvendes som en platform til at udvikle yderligere epitel og mesenchymal væv med komplekse arkitekturer.

Menneskelige pluripotente stamcellernes evne til at forny sig selv, samtidig med at pluristyrken bevares, giver mulighed for at producere humane celletyper og væv efter behov. hpscs er blevet effektivt differentieret i hepatocyte-lignende celler (hlcs) ved hjælp af to-dimensionelle (2D) overholder kultur systemer1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Disse systemer er blevet anvendt til succesmodel monogen sygdom, virus livscyklus, Drug induceret leverskade (DILI), føtal udsættelse for toksiner og ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men disse modeller besidder nogle ulemper, som begrænser deres rutine brug. Disse omfatter føtal markør udtryk, ustabil fænotype og dårlig vævs arkitektur16,17,18,19, som også kunne begrænse ekstrapolation til organfunktion in vivo.
For at overvinde disse begrænsninger, tre-dimensionelle (3D) differentiering platforme er blevet udviklet til at efterligne in vivo væv arkitektur. Selv om disse tilgange gør det muligt, er afhængige af brugen af animalske afledte produkter og matricer til at drive vævs Genesis20,21,22, begrænse opskalering og udbredt anvendelse.
Her har vi detaljerede procedurer for at generere store mængder af 3D-hepatokugler fra hPSCs ved hjælp af definerede materialer og celle selvsamling. Især væv genereret af vores procedure forbliver funktionel i mere end et år i cellekultur og er i stand til at understøtte leverfunktion in vivo23.
Sammenfattende giver vores definerede differentierings metode mulighed for at fremprovokere stabile humane hepatotoksfærer fra både humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Vi mener, at den beskrevne procedure repræsenterer et betydeligt gennembrud i produktionen af 3D-hepatospheres til grundlæggende og anvendt videnskabelig forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="993">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cell Culture and functional assays</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>10766834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A2058&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Activin A&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Basic Fibrobaslt Growth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Epithelial Gropwth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Oncostatin M&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521&#160;</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Vascular Growth Factor</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-mold spheroids&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P3932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant mouse Wnt3a&#160;</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Equipment</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Microwave</td>
			<td style="width:183px;">Bosch</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microtome</td>
			<td style="width:183px;">Leika</td>
			<td style="width:196px;">RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Antibodies</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A6684&#160;</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">CYP3A4</td>
			<td style="width:183px;">University of Dundee</td>
			<td style="width:196px;">University of Dundee</td>
			<td style="width:236px;">1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">IgG</td>
			<td style="width:183px;">DAKO</td>
			<td style="width:196px;">X0943</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Vimentin</td>
			<td style="width:183px;">DAKO</td>
			<td style="width:196px;">M0725</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (sheep)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serum free production of three-dimensional human hepatospheres from pluripotent stem cells

Udviklingen af vedvarende kilder til levervævet er nødvendig for at forbedre celle-baserede modellering, og udvikle humant væv til transplantation. Humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs) repræsenterer lovende kilder til menneskelige lever kugler. Vi har udviklet en serum fri og defineret metode til cellulær differentiering til at generere tredimensionelle menneskelige lever kugler dannet af humane pluripotente stamceller. En potentiel begrænsning af teknologien er produktionen af tætte kugler med dødt materiale indeni. For at omgå dette har vi ansat agopstået strips med mikrobrønde-teknologi på definerede celle tætheder til at kontrollere størrelsen af 3D-sfærerne, hvilket forhindrer generering af apoptotiske og/eller nekrotiske kerner.  Især de sfærer genereret af vores tilgang viser leverfunktion og stabil fænotype, der repræsenterer en værdifuld ressource for grundlæggende og anvendt videnskabelig forskning. Vi mener, at vores tilgang kunne bruges som en platform teknologi til at udvikle yderligere væv til at modellere og behandle sygdomme hos mennesker og i fremtiden kan tillade generering af humant væv med komplekse væv arkitektur.

Tredimensionale aggregater fra embryonale stamcelle linje (H9) eller den inducerede pluripotente stamcelle linje (P106) blev differentieret i forhold til hepatocyt Lineage ved hjælp af vores definerede procedure (figur 1). Pluripotente stamceller blev først primet mod definitive endoderm før hepatoblast-specifikationen. Efter dette, hepatoblaster blev modnet i 3D hepatspheres, som kunne opretholdes i kulturen i op til et år23.
For at studere strukturen i 3D-kugler blev 30 daggamle hESC-eller iPSC-afledte kugler fastgjort, skåret og plettet for at påvise tilstedeværelsen af proteiner udtrykt i hepatocytter og mesenchymale celler. Hepatocyt nuklear faktor 4 Alpha (HNF4α) og mesenchymal markør vimentin blev anvendt, afslører tilstedeværelsen af et ydre lag bestående af hepatocyt som celler omkring en kerne af mesenchymal celler (figur 2). Vi fulgte disse eksperimenter analysere ekspression af proteiner udtrykt i hepatocytter: albumin, CYP3A og E-cadherin. Immunofarvning afslørede, at ekspression af disse proteiner var begrænset til det yderste lag af sfærer (figur 3).
Funktionelle analyser af hepatosfærerne blev udført i dag 30 kulturer. CYP1A2 og CYP3A er vigtige enzymer inden for funktionelle hepatocytter. Deres aktivitet blev vurderet ved hjælp af etablerede assays. H9-afledte hepatokugler udviste CYP3A-aktivitet på 220.375 ± 74514 RLU/mL/mg protein og CYP1A2 aktivitet på 732.440 ± 33.330 RLU/mL/mg protein (figur 4A). CYP3A-aktiviteten i P106-afledte hepatokugler var 132117 ± 43.391 RLU/mL/mg protein, og CYP1A2-aktiviteten var 409.907 ± 121.723 RLU/mL/mg protein (figur 4B). Sammenlignet med to partier af humane primære hepatocytter, 3D lever kugler vises respektable niveauer af CYP aktivitet10.
Analyse af syntesen og sekretionen af albumin og alpha-fetoprotein (AFP) afslørede, at H9-afledte hepatospheres udskilt 683,9 ± 84 og 159 ± 20 ng/mL/24 t/mg protein af albumin og alpha-fetoprotein henholdsvis (figur 5A). Der henviser til, at P106-afledte hepatosfærer udskilt 497 ± 41 og 756 ± 24 ng/mL/24 t/mg protein af albumin og alfa-fetoprotein (figur 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> Figur 1 : Trinvis differentiering procedure til at generere 3D hepatospheres fra hESCs. Blå parenteser repræsenterer dage med differentiering for hiPSCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> Figur 2 : Strukturel reorganisering af 3D-hepatospheres. Repræsentative billeder af ekspression af hepatocyt nuklear faktor 4 Alpha (HNF4α-Green) og vimentin (rød) i (A) H9-afledte 3D hepatospheres og (B) P106-afledte 3D hepatspheres og deres tilsvarende immunglobulin G (IgG) Kontroller . Skala søjler repræsenterer 60 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> Figur 3 : Evaluering af lever markør udtryk i 3D hepatospheres. Repræsentative billeder af ekspression af hepatocyt markører-albumin, CYP3A, E-cadherin og deres tilsvarende IgG-Kontroller i (A) H9-og (B) P106-afledte 3D-hepatospheres. Skala stænger = 60 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> Figur 4 : Cytochrom P450 funktion i 3D hepatospheres. Måling af cytochrom P450 1A2 og 3A aktivitet i (A) H9-afledte 3D hepatospheres og (B) P106-afledte 3D hepatspheres. Dataene repræsenterer middelværdien af tre biologiske replikater, og fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (SD). Aktivitet er angivet som relative lysenheder (RLU) pr. mL pr. mg protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> Figur 5 : Analyse af hepatosphere protein sekretion. Udskillelsen af albumin og alpha-fetoprotein (AFP) blev analyseret i (A) H9-afledte 3D hepatospheres og (B) P106-afledte 3D hepatspheres. Dataene er repræsentative for tre biologiske replikater, og fejl stængerne repræsenterer SD. udskilt protein er citeret som nanogram protein pr. mL pr. 24 timer pr. mg protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

Denne protokol beskriver en tilgang til fremstilling af hepatokugler fra humane pluripotente stamceller ved hjælp af et defineret kultur system og celle selvsamling. Denne protokol er reproducerbar i en række cellelinjer, omkostningseffektiv og giver mulighed for produktion af stabile humane hepatospheres til biomedicinsk anvendelse.

Serum fri produktion af tredimensionale humane Hepatokugler fra pluripotente stamceller

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Denne methogenetics store mængde af 3D hepatosfærer af menneskelige pluripotente stamceller ved hjælp af fine materialer og celler i samling. Det vigtigste fremskridt i denne teknik er, at det giver mulighed for at kontrollere størrelsen af 3D-lever kugler, begrænse dannelsen af nekrotiske centre og tab af fænotype. Demonstration af proceduren med mig vil være Yu Wang, en post-doktorgrad i vores laboratorium.Forbered dig på at præsentere agarose forme ved at opløse to gram lavsmeltende temperatur agarose i 100 milliliter steriliseret destilleret vand. Blandingen opvarmes forsigtigt i mikrobølgeovnen med intervalrystelse for at opløse agarosen helt. Tilføj 520 mikroliter af den smeltede agarose til en 256 velformat skimmel og gøre det muligt at størkne.Derefter overføres hver agarose mikroplade til en enkelt brønd af en 12-brønd plade. Tilsæt 1,5 milliliter DPBS med calcium og magnesium til hver brønd og pipette op og ned for at fjerne bobler. For at forberede cellesuspensionen skal du starte med at aspirere mediet fra en udifferentieret kultur af humane pluripotente stamceller eller HPSCs.Skyl cellerne ved at tilføje fem milliliter rumtemperatur DPBS, calcium eller magnesium fri og derefter fjerne bufferen. Der tilsættes fem milliliter reagens af cellerne og inkuberes ved 37 grader Celsius i seks til otte minutter. Overhold celleudredtningen under et mikroskop, og udvid inkubationen i yderligere et eller to minutter, hvis det er nødvendigt.Stop reaktionen ved at fjerne celle dissociation reagens og tilføje fem milliliter frisk MT tjene et medium suppleret med 10 mikromolar rock hæmmer, Y27632. Pipette op og ned flere gange for at adskille celler. Tæl de levedygtige celler med hæmocytometeret, og trypan blå farvning for at beregne det samlede antal nødvendige celler.Overfør det ønskede antal celler til et sterilt 15 eller 50 milliliter centrifugerør og centrifuge ved 200 gange G i fem minutter for at pelletere cellerne. Kassér supernatanten og re-suspendere cellerne i MT tjene et medium med 10 mikromolar rock hæmmer for en endelig koncentration på 2,1 millioner celler pr milliliter. Dernæst gemme cellerne ved at tilføje 190 mikroliter af forberedt celle suspension per agarose mikro godt og inkubere agarose mikroplader ved 37 grader Celsius i fem procent kuldioxid i to timer.Efter inkubationen tilsættes en milliliter frisk, varm, T-server et medium med stenhæmmer til hver brønd. Læg pladerne tilbage til inkubatoren og lad dem være der i 24 timer. På den næste dag, undersøge sfæren af dannelsen.Forbered poly-to hydroxyethyl methacrylat eller poly-hema belagt brønde ved at opløse to gram poly-hema i 100 milliliter 95% ethanol og omrøring opløsningen natten over på en 55 grader Celsius varmeplade. På den næste dag, tilsæt 250 mikroliter af opløsningen til hver brønd af en 24-brønd plade og tør pladen natten over i en 60 grader Celsius ovn. Indlede hepatocyte differentiering ved omhyggeligt at fjerne MT tjene et medium fra de tidligere seedede celler og erstatte det med en milliliter frisk endoderm differentiering medium.For menneskelige embryonale stamceller, genopfriske medium hver 24 timer i tre dage. Det er vigtigt at indlede hepatocyt differentiering 24 timer efter såning for at undgå spontan celle differentiering. Efter endelig endoderm induktion, skifte mediet til hepatoblast differentiering medium i fem dage.Udskift mediet hver anden dag, og udstøm den sidste ændring på den sidste dag i hepatoblastspecifikationen. For at overføre hepatosfærerne til de forberedte poly-hema belagte brønde, vaske cellerne med hepatocyt modning medium og derefter tilføje en milliliter af mediet suppleret med 10 nanogram pr milliliter HGF og 20 nanogram pr milliliter OSM. Pipette opløsningen op og ned flere gange for at løfte hepatosfærerne fra agarose mikropladen og overføre dem til en poly-hema belagt godt.Vask agarose mikropladen med en milliliter af den supplerede hepatocyt modning medium og overføre mediet til poly-hema belagt godt. Ved hjælp af en P-100 pipette, omhyggeligt aspirere overskydende medium uden at fjerne hepatosfærer, indtil der er omkring en milliliter medium tilbage i brønden. Opdater mediet hver 48 timer i 12 dage.Hvis der arbejdes med embryonale stamceller, skal du skifte mediet til hepatocyt vedligeholdelsesmediet på dag 20 ved at fjerne modningsmediet, vaske cellerne med vedligeholdelsesmedium og derefter tilføje en milliliter suppleret vedligeholdelsesmedium. Derefter skal du opdatere mediet hver 48. Øjeblikkelige ændringer skal udføres omhyggeligt for at undgå alvorlig stress og forvrængning af denne sfæriske struktur.Farvning for hepatocyte i mesenkymale markører svælger, at hepatosfærer dannet ved hjælp af denne teknik er sammensat af hepatocyte-lignende celler omkring en kerne af mesenkymale celler. Andre proteiner typisk udtrykt i hepatocytter findes også på det ydre lag af kuglerne. Funktionel analyse af cytokrom P450 enzymer eller CYP i 30 dage hepatosfæren kulturer viste, at 3D kugler viser respektable niveauer af CYP aktivitet sammenlignet med menneskelige primære hepatocytter.Desuden kan det påvises, at hepatosfærerne udskiller leverproteiner som Albumin og alfa-fetoprotein. Det vigtigste at huske for denne protokol er forsigtigt pipette op og ned opløsningen indeholder 3D hepatosfærer, når du overfører dem til poly-hema belagt plade. Dette hjælper med at undgå at beskadige dem.Når mestrer, denne metode tillader generering af 3D-lever kugler, der forbliver funktionelle over et år in-vitro med flere applikationer i decease modellering og narkotika screening. Fremadrettet kunne denne teknologi anvendes som en platform til at udvikle yderligere entodermale og mesenkymale væv med komplekse arkitekturer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation af Integration-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller Brug Hair-afledte Keratinocytter

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering af induceret pluripotente stamceller fra humane perifere T-celler Brug af Sendai Virus i Feeder-fri Betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen af ​​pluripotente stamceller fra mus fostervand Celler Ved hjælp af en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation af Integration-fri induceret pluripotente stamceller fra humane perifere mononucleære blodceller Brug episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Integrationsfri afledning af humane inducerede pluripotente stamceller ved anvendelse af Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...