Name: serum free production of three-dimensional human hepatospheres from pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Diese Studie wurde mit Auszeichnungen der UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1) und des Chief Scientist es Office (TCS/16/37) unterstützt.

1. Herstellung von Agarose Mikroplattenformen
HINWEIS: Die für diese Experimente verwendeten Medien müssen steril und bei Raumtemperatur (RT) für die Zellkultur sein.
<ol><li>
Bereiten Sie 2% Agarose-Formen vor.
	<ol>
<li>2 g Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in 100 ml sterilisiertes destilliertes Wasser auflösen. Vorsichtig in einer Mikrowelle mit Intervallschütteln erhitzen, um sich vollständig aufzulösen.</li>
		<li>520 L geschmolzene Agarose zu einer 256-Well-Form hinzufügen und erstarren lassen.</li>
		<li>Übertragen Sie jede Agarose-Mikroplatte in einen einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte.</li>
		<li>Fügen Sie 1,5 ml 1x 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) mit Ca2+/Mg2+ zu jedem Brunnen hinzu und entfernen Sie die Luftblasen aus den Mikrobrunnen, indem Sie mit einer P1000 Pipette-Spitze mehrmals sanft nach oben und unten pfeifen. Dies wird durchgeführt, um eine gleichmäßige Zellaussaat zu gewährleisten. HINWEIS: Agarose Mikroplatten können bis zu 6 Monate bei 4 °C in 1x DPBS gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Aussaat humaner pluripotenter Stammzellen in Agarose Microwell Platten
<ol><li>
Vorbereitung der Zellsuspension
	<ol>
<li>Aspirieren Sie das Medium aus einer undifferenzierten Kultur von hPSCs, wie zuvor beschrieben8. ANMERKUNG: hPSCs werden auf LN-521 in mTeSR1 kultiviert, wobei das Medium alle 24 h gewechselt wird, und regelmäßig durchgedrungen, sobald die Zellen 75% bis 85% der Konfluenz erreichen, wie zuvor beschrieben8.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen mit 5 ml RT 1x DPBS ohne Ca2+/Mg2+ und entfernen Sie den Puffer.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen 5 ml 1x Zelldissoziationsreagenz (Materialtabelle) hinzu und lassen Sie die Zelldissoziation durch Inkubation von Zellen bei 37 °C für 6-8 min zu. HINWEIS: Um die Reaktion zu stoppen, untersuchen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Die Zellen sollten teilweise von der Platte gelöst werden. Verlängern Sie die Inkubation um zusätzliche 1-2 min, wenn längere Zeit erforderlich ist.</li>
		<li>Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Zelldissoziationsreagenz entfernen und 5 ml frisches mTeSR1-Medium, ergänzt durch 10 M Rho-assoziierte Kinase (ROCK)-Hemmer Y27632, zu den Zellen hinzufügen. Trennen Sie Zellen, indem Sie mithilfe einer P1000-Pipettenspitze mehrmals nach oben und unten pfeifen.</li>
		<li>Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung Ausschluss. Anschließend bereiten Sie die Zellsuspension in der erforderlichen Konzentration vor.</li>
		<li>Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen. Zur 3D-Hepatosphärendifferenzierung, Samen 3,84 x 105 Zellen pro Agarose Mikroplatte, um Sphäroide mit 100-150 m Durchmesser zu erzeugen.</li>
		<li>Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein steriles 15 ml oder 50 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 x g für 5 min bei RT, um die Zellen zu pellet.</li>
		<li>Aspirieren und entsorgen Sie die Überstands- und Resuspendzellen in mTeSR1 medium plus 10 'M ROCK-Hemmer Y27632. Das Zellpellet im entsprechenden Mediumvolumen auf eine Endkonzentration von 2,1 x 106 Zellen/ml verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aussaat der Zellen an die vorbereiteten Agarose-Mikroplatten HINWEIS: Wenn Sie kühl gelagerte Agarose-Mikroplatten verwenden, legen Sie sie mindestens eine Stunde vor der Verwendung bei 37 °C in den Zellinkubator und saugen Sie die 1x DPBS vor der Zellaussaat aus dem Brunnen ab.<ol>
<li>Fügen Sie 190 l der Zellsuspension in den Agarose-Mikrowell ein.</li>
		<li>Nach der Aussaat die Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 2 h in den Zellinkubator zurück, damit sich die Zellen absetzen können.</li>
		<li>Nach 2 h 1 ml frisches und warmes mTeSR1-Medium hinzufügen, ergänzt mit 10 'M ROCK-Hemmer Y27632 zu jedem Brunnen.</li>
		<li>Geben Sie die Platten bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h in den Zellinkubator zurück und untersuchen Sie die Bildung von Kugeln am nächsten Tag, damit sich die Zellen anheften können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Unterscheidung von hPSCs zu 3D-Hepatosphären auf Agarose Microwells
<ol><li>Herstellung von Poly 2-Hydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) beschichteten Brunnen
	<ol>
<li>2 g Poly-HEMA in 100 ml 95% Ethanol auflösen. Die Lösung über Nacht mit einer Kochplatte bei 55 °C umrühren. Fügen Sie 250 l Poly-HEMA-Lösung pro Bohrung einer 24-Well-Platte hinzu und trocknen Sie sie über Nacht bei 60 °C mit einem Ofen.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des Differenzierungsmediums
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung von humanem Aktivin A vor, indem Sie humanes Aktivin Ein lyophilisiertes Protein in sterilem 0,2% Rinderserumalbumin (BSA)/DPBS auf eine Endkonzentration von 100 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung von Wnt3a vor, indem Sie die Maus Wnt3a lyophilisiertes Protein in sterilem 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung um 1:200.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des humanen Hepatozytenwachstumsfaktors (HGF) vor, indem Sie das humane HGF-lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1.000-fache Lagerlösung von Oncostatin M (OSM) vor, indem Sie OSM in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 20 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1000-fache Stammlösung des epithelialen Wachstumsfaktors (EGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in sterilen 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1.000-fache Stammlösung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) vor, indem Sie das lyophilisierte Protein in 0,2% BSA/DPBS auf eine Endkonzentration von 10 g/ml auflösen. Bei -20 °C in kleinen Aliquots lagern. Verwendung bei 1:1.000.</li>
		<li>Endoderm Differenzierungsmedium bestehend aus Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Basalmedium ergänzt mit 2% B27 Ergänzung (50x, ohne Insulin) und 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen: 100 I.E./ml und 100 g/ml, bzw.). Sofern nicht angegeben, wird bei jeder mittleren Veränderung das erforderliche Volumen mit Wnt3a und Aktivin A bei einer Endkonzentration von 50 ng/ml bzw. 100 ng/ml ergänzt. HINWEIS: Bei 4 °C lagern und innerhalb von zwei Wochen verwenden.</li>
		<li>Herstellung eines Hepatoblast-Differenzierungsmediums bestehend aus dem modifizierten Eagle-Medium (KO-DMEM) von Knockout Dulbecco mit 20% Knockout-Serumersatz (KOSR) und ergänzt durch 0,5% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol, 1% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml bzw. 100 g/ml). Filter unter Vakuum. HINWEIS: Bei 4 °C lagern und innerhalb von zwei Wochen verwenden.</li>
		<li>Herstellung von Hepatozytenreifungsmedium bestehend aus Hepatozytenmedium, ergänzt durch 1% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 10 M Hydrocortison 21-Hemisuccinat-Natriumsalz (HCC), 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml und 100 g/ml). Für jede mittlere Veränderung das benötigte Volumen mit OSM und HGF (Endkonzentrationen bei 20 ng/ml bzw. 10 ng/ml) ergänzen. HINWEIS: Lagern Sie den Lagerbestand bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von zwei Wochen.</li>
		<li>Hepatozyten-Wartungsmedium, bestehend aus Williams E-Medium, ergänzt durch 10% Knockout-Serum-Ersatz, bestehend aus 1% einer alternativen Ergänzung zu L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml und 100 g/ml, bzw.). Für jede mittlere Veränderung das erforderliche Volumen mit HGF, EGF, bFGF und VEGF (Endkonzentration jedes Wachstumsfaktors bei 10 ng/ml) ergänzen. HINWEIS: Lagern Sie den Lagerbestand bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb von zwei Wochen.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen Sie die Hepatosphärenbildung 24 h nach der Aussaat und initiieren Sie die Hepatozytendifferenzierung. Entfernen Sie das mTeSR1 Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches Endoderm-Differenzierungsmedium, ergänzt durch 100 ng/ml Activin A und 50 ng/ml Wnt3a.</li>
	<li>Änderung ergänzt Endoderm Grundierung Medium alle 24 h für 3 Tage für hESCs. Bei der Arbeit mit hiPSCs, verlängern Sie diese Phase um weitere 2 Tage und ergänzen Sie die Medien allein mit Aktivin A (100ng/ml).</li>
	<li>Nach der endgültigen Endoderm-Induktion, wechseln Sie auf Hepatoblast Differenzierungsmedium für Hepatoblast Spezifikation für 5 Tage ersetzen das Medium alle 2 Tage und führen Sie die letzte Änderung am letzten Tag der Hepatoblast Spezifikation.</li>
	<li>Übertragen Sie Hepatosphären in die poly-HEMA beschichteten Brunnen.
	<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit Hepatozyten reifung Medium ohne Ergänzungen nach dem Entfernen KSR / DMSO Medium und fügen Sie 1 ml Hepatozyten reifung Medium ergänzt mit 10 ng/ mL HGF und 20 ng/mL OSM.</li>
		<li>Heben Sie mit einer P1000 Pipette die Hepatosphären von der Agarose-Mikroplatte an, indem Sie die Lösung mehrmals auf und ab pfeifen.</li>
		<li>Übertragen Sie das Medium, das die Hepatosphären enthält, auf einen poly-HEMA-beschichteten Brunnen.</li>
		<li>Waschen Sie die Agarose-Mikroplatte mit 1 ml Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 ng/ml HGF und 20 ng/ml OSM, und übertragen Sie das Medium auf das poly-HEMA beschichtete Gut.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.6.4 so oft wie möglich, um alle Hepatosphären von der Agarose-Mikroplatte zu übertragen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Lösung, die die Hepatosphären enthält, sorgfältig nach oben und unten zu pipette, um zu vermeiden, dass sie beschädigt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Sorgsam überschüssiges Medium ansaugen, ohne Hepatosphären zu entfernen, indem man eine P100-Pipette verwendet, bis 1 ml Medium, das die Hepatosphären enthält, gut in der Poly-HEMA beschichtet bleibt.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium alle 48 stunden für 12 Tage.</li>
	<li>Wechseln Sie an Tag 20 bei der Arbeit mit hESCs oder tag 22 bei Arbeiten mit hiPSCs das Medium auf Hepatozyten-Wartungsmedium.
	<ol>
<li>Entfernen Hepatozyten Reifung Medium und waschen Zellen einmal mit Hepatozyten-Wartungsmedium ohne die Ergänzungen. Fügen Sie 1 ml Hepatozyten-Wartungsmedium mit 10 ng/ml HGF, EGF, FGF und VEGF ergänzt.</li>
	</ol></li>
	<li>Ändern Sie das Medium für frische Hepatozyten-Wartungsmedium alle 48 h.</li>
</ol>4. Funktionelle Analyse von langzeitgecultureten 3D-Hepatosphären
<ol><li>Wechseln Sie auf Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 M HCC, L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 I.E./ml bzw. 100 g/ml) und 10 ng/ml HGF 48 h vor der Durchführung einer funktionellen Analyse.</li>
	<li>
Analysieren Sie die metabolische Funktion von Hepatozyten mit Cytochrom (CYP) P450-Assays.
	<ol>
<li>Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml frisches Hepatozyten-Reifungsmedium, ergänzt durch 50 -M-Luciferin-6'-Pentafluor-Benzyl-Ether (Luciferin-PFBE)-Substrat zum Nachweis der CYP3A-Basalaktivität oder 100 -M-Luciferin-Methylether(Luciferin-ME)-Substrat zum Nachweis von CYP1A2 Basalaktivität (Anzahl der Replikationen = 3). Verwenden Sie Gewebekulturmedien als Negativkontrolle. HINWEIS: Um Kreuzreaktivität zu vermeiden, wird empfohlen, nicht die gleichen Brunnen mit 3D-Hepatosphären zu verwenden, um verschiedene CYP P450-Aktivitäten zu testen, sondern sie in einzelnen Brunnen durchzuführen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie die Überräube mit einer P100 Pipettenspitze und führen Sie den Test gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.</li>
		<li>Messen Sie die relative Basalaktivität und normalisieren Sie sich auf pro mg-Protein, wie durch den Bicinchoninsäure-Assay (BCA) bestimmt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Testen Sie die Serumproteinproduktion mit enzymgebundenem Immunsorbent Assay (ELISA).
	<ol>
<li>Ersetzen Sie Medium durch 1 ml frischehe Hepatozytenreifungsmedium, ergänzt durch 10 ng/ml HGF und 20 ng/ml OSM (Anzahl der Replikationen = 3). Verwenden Sie Gewebekulturmedien als Negativkontrolle.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie den Überstand mit einer P100 Pipettenspitze und messen Sie die relativen Mengen der Serumproteinproduktion gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Normalisieren Sie auf pro mg-Protein, wie durch den BCA-Assay bestimmt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunzytochemie
<ol><li>
Herstellung von Paraffinabschnitten, die Hepatosphären enthalten.
	<ol>
<li>Waschen Sie die Hepatosphären dreimal mit 1x DPBS.</li>
		<li>Fixieren Sie die Hepatosphären mit eiskaltem Methanol für 30 min.</li>
		<li>Waschen Sie dreimal mit 1x DPBS.</li>
		<li>Die Hepatosphären in 300 l einer gehärteten Lösung von 2% Agarose, die inH2O gelöst ist, mit einem leeren Brunnen einer 24-Well-Platte als Form einbetten und 30 min verfestigen lassen.</li>
		<li>Einbetten sie die Agarose mit Hepatosphären in Paraffin.</li>
		<li>Abschnitt des Paraffinblocks mit festen Hepatosphären in 4 m dicken Abschnitten mit einem Mikrotome.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De-Waxing und Rehydratation der Abschnitte. HINWEIS: Verwenden Sie neue Lösungen, wann immer es möglich ist. Verwenden Sie keine Lösungen, die länger als eine Woche auf dem Färberrog waren.<ol>
<li>Platzieren Sie Abschnitte in einem Schiebeträger.</li>
		<li>Eintauchen Sie das Schielengestell mit Abschnitten in einen Färbetrog mit 300 ml Xylol für 5 min.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 5.2.2.</li>
		<li>Tauchen Sie in absolutes Ethanol für 20 s ein.</li>
		<li>Tauchen Sie in 95% Ethanol für 20 s ein.</li>
		<li>Tauchen Sie in 90% Ethanol für 20 s ein.</li>
		<li>Tauchen Sie in 80% Ethanol für 20 s ein.</li>
		<li>Tauchen Sie in 70% Ethanol für 20 s ein.</li>
		<li>Rehydrieren Sie die Abschnitte mit Wasser für 5 min. HINWEIS: Bewahren Sie die Dias im selben Schiebeträger auf und verschieben Sie sie von einem Färberrog zum nächsten. Das verwendete Volumen (in der Regel 300 ml) hängt von der Größe des Färbetrogs ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigen-Retrieval von Paraffinabschnitten, die Hepatosphären enthalten.
	<ol>
<li>Entwachste und rehydrierte Abschnitte in 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 Pufferlösung für 15 min in einer Mikrowelle bei 800 W erhitzen.</li>
		<li>Abkühlen von Proben, indem Sie sie 5 min in Leitungswasser eintauchen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining.
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Dias mit Blockierlösung aus PBS mit 0,1% Polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA für 1 h bei RT.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Blockierlösung durch den entsprechenden Primärantikörper, der in PBS/T/1% BSA verdünnt ist, und inkubieren Sie bei 4 °C mit sanfter Rührung über Nacht.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen mit PBS/T für 5 min und wiederholen Sie es dreimal.</li>
		<li>Mit dem entsprechenden sekundären Antikörper in PBS/T/1% BSA inkubieren und im Dunkeln bei RT 1 h mit sanfter Rührung inkubieren. HINWEIS: Die optimierten primären und sekundären Antikörper sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen mit PBS/T für 5 min und wiederholen Sie es dreimal.</li>
		<li>Fügen Sie 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zu den Zellen nach den Anweisungen des Herstellers hinzu und legen Sie einen Glasdeckel vorsichtig, um Luftblasen zu reduzieren. Fixzellen bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren. Beobachten Sie die Färbung unter dem Mikroskop mit entsprechender Filter- und Leuchtstofflampe. HINWEIS: Platten bei 4 °C im Dunkeln bis zur Bildgebung aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+hepatospheres+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+and+Reproducible+Production+of+Liver+Buds+Entirely+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li></ol>

David C. Hay ist Mitbegründer und Aktionär von Stemnovate Ltd und HigherSteaks Ltd. Die übrigen Autoren bescheinigen, dass sie keine Interessenkonflikte in den in diesem Artikel behandelten Themen oder Materialien haben.

Die Entwicklung definierter und xenofreier Systeme zur Herstellung menschlicher Hepatosphären in 3D ist sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Bemühungen erforderlich. Derzeit werden die meisten Hepatozytendifferenzierungsansätze aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in zweidimensional entämmten anhaftenden Kulturen durchgeführt. In diesen Umgebungen fehlen viele der Umwelthinweise, die an der Gewebegenese und Homöostase beteiligt sind. heterotypische Zellinteraktionen, Matrixproduktion und Remodellierung, was zu einer schlechten Übersetzung in die in vivo Biologie18,19führt.
Infolgedessen konzentrierte sich die Forschung auf alternative Ansätze zur Erzeugung von Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen. Eine Reihe von 3D-Studien haben das Feld vorangebracht, aber diese sind auf tierische Produkte angewiesen20,22,24, um Unterstützung zu bieten und/oder erfordern die Verwendung von menschlichem Gewebe21,22, was erschwert technologie scale-up und gefährdet experimentelle Reproduzierbarkeit und Anwendung.
Das in unserem Artikel beschriebene Verfahren (Abbildung 1) ist definiert, effizient, hochreproduzierbar und kostengünstig, was die Produktion funktioneller Leberkugeln ermöglicht, die über ein Jahr in vitro funktionsfähig bleiben und kritische Leberunterstützung bei vivo14. Wichtig ist, dass diese Plattform dem Benutzer ermöglicht, die Größe der 3D-Leberkugeln zu kontrollieren, wodurch die Bildung dichter nekrotischer Zentren und der Verlust des Phänotyps begrenzt werden.
Die Übertragung der 3D-Hepatosphären auf die poly-HEMA-beschichteten Platten stellt einen entscheidenden Schritt in diesem Protokoll dar. Es ist wichtig, Pipette in diesem Stadium des Verfahrens sanft zu pipette, um zu vermeiden, die Kugel zu beschädigen. Darüber hinaus müssen Medienänderungen sorgfältig durchgeführt werden, um Scherspannung und Verzerrung der Kugelstruktur zu vermeiden.
In diesen Studien zeigten 3D-Hepatosphären eine organisierte Struktur (Abbildung 2 und Abbildung 3), Cytochrom-P450-Funktion ( Abbildung4) und sezernierte Leberproteine, einschließlich Albumin und Alpha-Fetoprotein (Abbildung 5). Dieses Verfahren wurde erfolgreich in vier pluripotenten Stammzellenlinien mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt. Mit Blick auf die Zukunft könnte diese Technologie als Plattform zur Weiterentwicklung von endodermalen und mesenchymalen Geweben mit komplexen Architekturen eingesetzt werden.

Die Fähigkeit menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs), sich selbst zu erneuern, während die Pluripotenz erhalten bleibt, bietet die Möglichkeit, menschliche Zelltypen und Gewebe auf Anfrage zu produzieren. hPSCs wurden effizient in hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) mit zweidimensionalen (2D) haftenden Kultursystemen1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Diese Systeme wurden verwendet, um monogene Krankheiten, Virus-Lebenszyklus, medikamentöse Leberschäden (DILI), fetale Exposition gegenüber Toxinen und nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen (NAFLD) erfolgreich zu modellieren11,12,13 ,14,15. Diese Modelle haben jedoch einige Nachteile, die ihre Routinenutzung einschränken. Dazu gehören fetale Markerexpression, instabiler Phänotyp und schlechte Gewebearchitektur16,17,18,19, die auch die Extrapolation auf die Organfunktion in vivo begrenzen könnte.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Differenzierungsplattformen entwickelt, um in vivo Gewebearchitektur nachzuahmen. Obwohl diese Ansätze dies ermöglichen, stützen sie sich auf die Verwendung von tierischen Produkten und Matrizen, um die Gewebegenese20,21,22zu fördern, was das Scale-up und die weit verbreitete Anwendung begrenzt.
Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung großer Mengen von 3D-Hepatosphären aus hPSCs unter Verwendung definierter Materialien und Zellselbstmontage. Insbesondere bleibt das durch unser Verfahren erzeugte Gewebe für mehr als ein Jahr in der Zellkultur funktionsfähig und ist in der Lage, die Leberfunktion in vivo23zu unterstützen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser definierter Differenzierungsansatz die Erzeugung stabiler menschlicher Hepatosphären sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) ermöglicht. Wir glauben, dass das beschriebene Verfahren einen bedeutenden Durchbruch bei der Erzeugung von 3D-Hepatosphären für die Grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung darstellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="993">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cell Culture and functional assays</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>10766834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A2058&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Activin A&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Basic Fibrobaslt Growth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Epithelial Gropwth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Oncostatin M&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521&#160;</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Vascular Growth Factor</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-mold spheroids&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P3932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant mouse Wnt3a&#160;</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Equipment</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Microwave</td>
			<td style="width:183px;">Bosch</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microtome</td>
			<td style="width:183px;">Leika</td>
			<td style="width:196px;">RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Antibodies</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A6684&#160;</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">CYP3A4</td>
			<td style="width:183px;">University of Dundee</td>
			<td style="width:196px;">University of Dundee</td>
			<td style="width:236px;">1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">IgG</td>
			<td style="width:183px;">DAKO</td>
			<td style="width:196px;">X0943</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Vimentin</td>
			<td style="width:183px;">DAKO</td>
			<td style="width:196px;">M0725</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (sheep)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serum free production of three-dimensional human hepatospheres from pluripotent stem cells

Die Entwicklung erneuerbarer Quellen von Lebergewebe ist erforderlich, um die zellbasierte Modellierung zu verbessern und menschliches Gewebe für die Transplantation zu entwickeln. Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) stellen vielversprechende Quellen menschlicher Lebersphären dar. Wir haben eine serumfreie und definierte Methode der zellulären Differenzierung entwickelt, um dreidimensionale menschliche Lebersphären zu erzeugen, die aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gebildet werden. Eine mögliche Einschränkung der Technologie ist die Herstellung dichter Kugeln mit totem Material im Inneren. Um dies zu umgehen, haben wir Agarose-Mikrowell-Technologie in definierten Zelldichten eingesetzt, um die Größe der 3D-Kugeln zu kontrollieren und die Erzeugung von apoptotischen und/oder nekrotischen Kernen zu verhindern.  Insbesondere zeigen die durch unseren Ansatz erzeugten Sphären die Leberfunktion und den stabilen Phänotyp, der eine wertvolle Ressource für die grundlagen- und angewandte wissenschaftliche Forschung darstellt. Wir glauben, dass unser Ansatz als Plattformtechnologie zur Entwicklung weiterer Gewebe zur Modellierung und Behandlung menschlicher Krankheiten genutzt werden könnte und in Zukunft die Erzeugung von menschlichem Gewebe mit komplexer Gewebearchitektur ermöglichen könnte.

Dreidimensionale Aggregate aus der embryonalen Stammzelllinie (H9) oder der induzierten pluripotenten Stammzelllinie (P106) wurden nachunserem definierten Verfahren (Abbildung 1) zur Hepatozytenlinie differenziert. Pluripotente Stammzellen wurden vor der Hepatoblast-Spezifikation zunächst auf endgültiges Endoderm umgesiebt. Danach wurden Hepatoblasten zu 3D-Hepatosphären gereift, die in der Kultur für bis zu einem Jahr23erhalten werden konnten.
Um die Struktur von 3D-Kugeln zu untersuchen, wurden 30 Tage alte hESC- oder iPSC-abgeleitete Kugeln fixiert, geschnitten und gebeizt, um das Vorhandensein von Proteinen zu erkennen, die in Hepatozyten und mesenchymalen Zellen exprimiert werden. Hepatozyten-Kernfaktor 4 alpha (HNF4) und das mesenchymale Marker-Vimentin wurden eingesetzt, was das Vorhandensein einer äußeren Schicht offenbart, die aus Hepatozyten-ähnlichen Zellen besteht, die einen Kern mesenchymaler Zellen umgeben (Abbildung 2). Wir folgten diesen Experimenten und analysierten die Expression von Proteinen, die in Hepatozyten exprimiert werden: Albumin, CYP3A und E-Cadherin. Immunostaining ergab, dass die Expression dieser Proteine auf die äußere Schicht der Kugeln beschränkt war (Abbildung 3).
Funktionelle Analysen der Hepatosphären wurden in Tag-30-Kulturen durchgeführt. CYP1A2 und CYP3A sind wichtige Enzyme in funktionellen Hepatozyten. Ihre Tätigkeit wurde anhand etablierter Assays bewertet. H9-abgeleitete Hepatosphären wiesen eine CYP3A-Aktivität von 220.375 x 74514 RLU/mL/mg-Protein und CYP1A2-Aktivität von 732.440 x 33.330 RLU/mL/mg-Protein auf (Abbildung 4A). Die CYP3A-Aktivität in P106-abgeleiteten Hepatosphären betrug 132117 x 43.391 RLU/mL/mg-Protein und die CYP1A2-Aktivität betrug 409.907 x 121.723 RLU/mL/mg-Protein (Abbildung 4B). Im Vergleich zu zwei Chargen menschlicher Primärhepatozyten zeigten 3D-Leberkugeln respektable CYP-Aktivitätswerte10.
Die Analyse der Synthese und Sekretion von Albumin und Alpha-Fetoprotein (AFP) ergab, dass H9-abgeleitete Hepatosphären 683,9 x 84 und 159 x 20 ng/mL/24 h/mg-Protein von Albumin bzw. Alpha-Fetoprotein sezernierten (Abbildung 5A). Während P106-abgeleitete Hepatosphären 497 x 41 und 756 x 24 ng/mL/24 h/mg-Protein von Albumin bzw. Alpha-Fetoprotein sezernierten (Abbildung5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> Abbildung 1 : SchrittweiseDifferenzierungsverfahren zur Erzeugung von 3D-Hepatosphären aus hESCs. Blaue Klammern stellen Tage der Differenzierung für hiPSCs dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> Abbildung 2 : Strukturelle Reorganisation von 3D-Hepatosphären. Repräsentative Bilder der Expression des Hepatozyten-Kernfaktors 4 alpha (HNF4- - grün) und vimentin (rot) in (A) H9-abgeleiteten 3D-Hepatosphären und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären und den entsprechenden Immunglobulin-G-Kontrollen (IgG) . Skalenbalken stellen 60 m dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> Abbildung 3 : Bewertung des lebermarkerischen Ausdrucks in 3D-Hepatosphären. Repräsentative Bilder des Ausdrucks von Hepatozytenmarkern - Albumin, CYP3A, E-Cadherin und deren entsprechenden IgG-Steuerungen in (A) H9- und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären. Skalenbalken = 60 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> Abbildung 4 : Cytochrom P450 Funktion in 3D-Hepatosphären. Messung der Cytochrom-P450-1A2- und 3A-Aktivität in (A) H9-abgeleiteten 3D-Hepatosphären und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären. Die Daten stellen den Mittelwert von drei biologischen Replikationen dar, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Die Aktivität wird als relative Lichteinheiten (RLU) pro ml pro mg Protein angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> Abbildung 5 : Analyse der Hepatosphärenproteinsekretion. Die Sekretion von Albumin und Alpha-Fetoprotein (AFP) wurde in (A) abgeleiteten 3D-Hepatosphären und (B) P106-abgeleiteten 3D-Hepatosphären analysiert. Die Daten sind repräsentativ für drei biologische Replikationen, und die Fehlerbalken stellen die SD dar. Sezersier Protein wird als Nanogramm Protein pro ml pro 24 h pro mg Protein zitiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Diese methogenetics große Menge von 3D Hepatosphären von menschlichen pluripotentStammzellen mit den feinen Materialien und Zellen der Montage. Der Hauptfortschritt dieser Technik ist, dass es die Kontrolle der Größe der 3D-Leberkugeln, Begrenzung der Bildung von nekrotischen Zentren und Verlust von Phänotyp ermöglicht. Demonstriert das Verfahren mit mir wird Yu Wang, ein Post-Doktorat in unserem Labor sein.Bereiten Sie sich darauf vor, Agaroseformen zu präsentieren, indem Sie zwei Gramm Niedrigschmelztemperatur-Agarose in 100 Milliliter sterilisiertes destilliertes Wasser auflösen. Die Mischung vorsichtig in der Mikrowelle mit Intervallschütteln erhitzen, um die Agarose vollständig aufzulösen. 520 Mikroliter der geschmolzenen Agarose zu einer 256-gut formatierten Form geben und erstarren lassen.Dann übertragen Sie jede Agarose-Mikroplatte in einen einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte. Fügen Sie 1,5 Milliliter DPBS mit Kalzium und Magnesium zu jedem Brunnen und Pipette nach oben und unten, um Blasen zu entfernen. Um die Zellsuspension vorzubereiten, beginnen Sie mit der Ansaugung des Mediums aus einer undifferenzierten Kultur menschlicher pluripotenter Stammzellen oder HPSCs.Spülen Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter Raumtemperatur DPBS, Kalzium oder Magnesium frei hinzufügen, und entfernen Sie dann den Puffer. Fügen Sie den Zellen fünf Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu und brüten sie sechs bis acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und verlängern Sie die Inkubation bei Bedarf um weitere ein bis zwei Minuten.Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das Zelldissoziationsreagenz entfernen und fünf Milliliter frisches MT hinzufügen, das einem Medium serviert wird, das mit 10 mikromolarem Gesteinsinhibitor, Y27632, ergänzt wird. Pipette auf und ab mehrmals, um Zellen zu dissoziieren. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit dem Hämozytometer und Trypanblaufärbung, um die Gesamtzahl der benötigten Zellen zu berechnen.Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein steriles 15- oder 50-Milliliter-Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 200-fachem G für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in MT mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren für eine Endkonzentration von 2,1 Millionen Zellen pro Milliliter. Als nächstes retten Sie die Zellen, indem Sie 190 Mikroliter vorbereitete Zellsuspension pro Agarose Mikrobrunnen hinzufügen und die Agarose-Mikroplatten bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid für zwei Stunden inkubieren.Nach der Inkubation je einen Milliliter frisches, warmes T-Serve-Medium mit Gesteinsinhibitor zu jedem Brunnen geben. Bringen Sie die Platten zum Inkubator zurück und lassen Sie sie dort für 24 Stunden. Am nächsten Tag die Sphäre der Bildung untersuchen.Bereiten Sie Poly-zwei Hydroxyethylmethacrylat oder Poly-Hema-beschichtete Brunnen vor, indem Sie zwei Gramm Poly-Hema in 100 Milliliter 95%Ethanol auflösen und die Lösung über Nacht auf einer 55 Grad Celsius-Heißplatte rühren. Am nächsten Tag 250 Mikroliter der Lösung zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen und die Platte über Nacht in einem 60 Grad Celsius Ofen trocknen. Initiieren Sie die Hepatozytendifferenzierung, indem Sie das MT sorgfältig aus den zuvor gesäten Zellen entfernen und durch einen Milliliter frisches Endoderm-Differenzierungsmedium ersetzen.Für menschliche embryonale Stammzellen, erfrischen Medium alle 24 Stunden für drei Tage. Es ist wichtig, Hepatozytendifferenzierung 24 Stunden nach der Aussaat zu initiieren, um eine spontane Zelldifferenzierung zu vermeiden. Nach der endgültigen Endoderm-Induktion das Medium für fünf Tage auf Hepatoblast-Differenzierungsmedium umstellen.Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage und führen Sie die letzte Änderung am letzten Tag der Hepatoblast-Spezifikation durch. Um die Hepatosphären in die vorbereiteten poly-hemabeschichteten Brunnen zu übertragen, waschen Sie die Zellen mit Hepatozytenreifungsmedium und fügen Sie dann einen Milliliter des Mediums hinzu, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter HGF und 20 Nanogramm pro Milliliter OSM. Pipette die Lösung auf und ab mehrmals, um die Hepatosphären von der Agarose Mikroplatte zu heben und sie auf einen Poly-Hema beschichtet enthoben Brunnen übertragen.Waschen Sie die Agarose-Mikroplatte mit einem Milliliter des ergänzten Hepatozytenreifungsmediums und übertragen Sie das Medium gut auf das Poly-Hema beschichtet. Mit einer P-100 Pipette, vorsichtig aspirieren überschüssiges Medium ohne Entfernung Hepatosphären, bis es etwa ein Milliliter Medium im Brunnen links. Erfrischen Sie das Medium alle 48 Stunden für 12 Tage.Wenn Sie mit embryonalen Stammzellen arbeiten, schalten Sie das Medium auf Hepatozyten-Erhaltungsmedium an Tag 20, indem Sie das Reifungsmedium entfernen, die Zellen mit Pflegemedium waschen und dann einen Milliliter zusätzliches Pflegemedium hinzufügen. Danach alle 48 Stunden medienaktualisieren. Sofortige Änderungen müssen sorgfältig durchgeführt werden, um ernsthafte Belastungen und Verzerrungen dieser sphärischen Struktur zu vermeiden.Die Färbung von Hepatozyten in mesenchymalen Markern schwelgt darin, dass die hepatosphärenförmig mit dieser Technik gebildeten Hepatosphären aus Hepatozyten-ähnlichen Zellen bestehen, die einen Kern mesenchymaler Zellen umgeben. Andere Proteine, die typischerweise in Hepatozyten exprimiert werden, finden sich ebenfalls auf der äußeren Schicht der Kugeln. Die funktionelle Analyse von Cytochrom-P450-Enzymen oder CYP in 30-tägigen Hepatosphärenkulturen zeigte, dass die 3D-Sphären im Vergleich zu menschlichen primären Hepatozyten respektable CYP-Aktivitätswerte aufweisen.Darüber hinaus kann nachgewiesen werden, dass die Hepatosphären Leberproteine wie Albumin und Alfa-Fetoprotein absondern. Das Wichtigste, was man sich für dieses Protokoll merken sollte, ist, die Lösung mit 3D-Hepatosphären beim Übertragen in die polyhämabeschichtete Platte sanft nach oben und unten zu pipette. Dies hilft, sie nicht zu beschädigen.Einmal gemeistert, ermöglicht diese Methode die Erzeugung von 3D-Leberkugeln, die über ein Jahr in-vitro mit mehreren Anwendungen in der Decease-Modellierung und dem Arzneimittelscreening funktionsfähig bleiben. Mit Blick auf die Zukunft könnte diese Technologie als Plattform zur Weiterentwicklung von entodermalen und mesenchymalen Geweben mit komplexen Architekturen eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...