Name: serum free production of three-dimensional human hepatospheres from pluripotent stem cells
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך עם פרסים של פלטפורמת הרפואה הרגנרטיבית בבריטניה (MRC MR/L022974/1) ואת משרד המדען הראשי (TCS/16/37).

1. הכנת תבניות מיקרופלייט
הערה: התקשורת המשמשת לניסויים אלה חייבת להיות סטרילית ובטמפרטורת החדר (RT) עבור תרבות התא.
<ol><li>
הכינו 2% תבניות.
	<ol>
<li>התמוססות 2 גרם של טמפרטורת ההיתוך נמוכה agarose לתוך 100 mL של מים מזוקקים מעוקר. חום בזהירות במיקרוגל עם מרווח רועד להתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>הוסף 520 μL של מומס נמס לתבנית 256-היטב פורמט ולעזוב כדי לגבש.</li>
		<li>העבר כל מיקרוצלחת הצמח לתוך באר אחת של 12-היטב צלחת.</li>
		<li>הוסף 1.5 mL של מלוחים באגירה של 1 x דולפי (DPBS) עם Ca2 +/Mg2 + כל טוב ולהסיר את בועות האוויר מן המיקרוגל על ידי pipetting בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות קצה P1000. הדבר מבוצע כדי להבטיח שזריעת תאים אחידה. הערה: ניתן לאחסן מיקרופלטות בנפח של עד 6 חודשים ב -4 ° c ב-1x DPBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. זריעת האדם בתאי גזע רב עוצמה לתוך לוחות למיקרוגל
<ol><li>
הכנת השעיית תאים
	<ol>
<li>מנושף את המדיום מתרבות מובחן של hPSCs כפי שתוארה בעבר8. הערה: hPSCs הם מתורבתים ב-in-521 ב mTeSR1 עם המדיום השתנה כל 24 שעות, ו החוצה באופן סדיר פעם התאים להגיע 75% כדי 85% השטף כמתואר בעבר8.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם 5 מ ל של RT 1x DPBS ללא Ca2 +/Mg2 + ולהסיר את המאגר.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל של 1x מגיב דיסוציאציה של תא 1 (טבלת חומרים) לתאים ולאפשר הדיסוציאציה של התא על ידי מריטינג תאים ב 37 ° c עבור 6-8 דקות. הערה: , כדי לעצור את התגובה. בדוק ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ התאים צריכים להיות מנותקים חלקית מלוחית. הארך את הדגירה עבור 1-2 דקות נוספות אם נדרש זמן רב יותר.</li>
		<li>להפסיק את התגובה על ידי הסרת מגיב הדיסוציאציה של התא ולהוסיף 5 מ ל mTeSR1 בינונית טריים בתוספת עם 10 μM Rho-הקשורים בY27632 קינאז (רוק) מעכב מדכא לתאים. הנתק תאים על-ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים באמצעות טיפ P1000.</li>
		<li>לספור את התאים הקיימא באמצעות מחלת הומוציטוטומטר וטריקון כחול מכתים. לאחר מכן, הכן את התא הבולם בריכוז הנדרש.</li>
		<li>חשב את המספר הכולל של התאים הדרושים. עבור 3d hepatosphere בידול, הזרע 3.84 x 105 תאים לכל agarose מיקרוצלחת לייצר spheroids עם 100-150 יקרומטר קוטר.</li>
		<li>להעביר את המספר הרצוי של תאים לתוך סטרילי 15 מ"ל או 50 mL צנטריפוגה שפופרת צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 5 דקות ב RT כדי גלולה התאים.</li>
		<li>מרוב ולמחוק את supernatant ולהשעות את התאים מחדש ב mTeSR1 בינונית ועוד 10 μM סלע מעכבי Y27632. לדלל את הגלולה תא בנפח המתאים של בינוני לריכוז הסופי של 2.1 x 106 תאים/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זריעת התאים למיקרו-צלחות מוכנות הערה: אם נעשה שימוש במקרר מאוחסן מיקרולוחות מיקרו, למקם אותם בחממה תא ב 37 ° c לפחות שעה לפני השימוש ומכה את DPBS 1x מן הבאר לפני זריעת התאים.<ol>
<li>הוסף 190 μL של השעיית התא לתוך המיקרוגל.</li>
		<li>לאחר זריעה, להחזיר את הצלחות לחממה התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 h כדי לאפשר לתאים להתיישב.</li>
		<li>לאחר 2 h, להוסיף 1 מ ל של טרי וחמים mTeSR1 בינוני בתוספת עם 10 μM סלע מעכב Y27632 כל טוב.</li>
		<li>החזר את הלוחות לאינקובטור התא ב-37 ° c ו-5% CO2 עבור 24 שעות ובדוק את היווצרות הספירות ביום שלמחרת כדי לאפשר לתאים להתחבר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הבחנה בין hPSCs ל-3D הפטלוספירות על הצמח
<ol><li>הכנת בארות מצופות פולי 2-הידרוטקסיל (פולי-HEMA)
	<ol>
<li>התמוססות 2 גרם של פולי HEMA ב 100 mL של 95% אתנול. מערבבים את התמיסה בלילה באמצעות פלטה חמה ב-55 ° c. הוסף 250 μL של הפתרון פולי-HEMA לבאר של 24-באר ויבש בן לילה ב-60 ° צ' באמצעות תנור.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מדיום בידול
	<ol>
<li>הכנת פתרון מניות 1, 000x של הפעילות האנושית על ידי המסת הפעילות האנושית חלבון ליאופה1 ב סטרילי 0.2% סרום שור (BSA)/dpbs לריכוז הסופי של 100 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.</li>
		<li>להכין 1, 000x פתרון מלאי של Wnt3a על ידי המסת העכבר Wnt3a ליאופ, חלבון סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. . השתמש ב-1:200</li>
		<li>הכנת 1, 000x פתרון מניות של גורם הגדילה האנושי hepatocyte (HGF) על ידי המסת חלבון HGF האדם ליאופפיהיפיהילי ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.</li>
		<li>להכין 1, 000x פתרון מלאי של אונסטטין M (OSM) על ידי המסת OSM סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 20 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.</li>
		<li>הכינו פתרון מניות של 1000x של מקדם האפיתל (EGF) על ידי המסת החלבון ליאופהולן ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.</li>
		<li>הכנת 1, 000x פתרון מניות של גורם גדילה בסיסית הפיצוץ בסיסי (bFGF) על ידי המסת החלבון הלינו, ב סטרילי 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.</li>
		<li>להכין פתרון מניות 1, 000x של כלי הדם גורם מקדם גידול (באמצעות) על ידי המסת החלבון ליאופה1 ב 0.2% BSA/DPBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. חנות ב-20 ° c במבחנות קטנות. השתמש ב-1:1000.</li>
		<li>להפוך בינוני אנדועור בינונית המורכבת פארק רוזוול הזיכרון המכון 1640 (RPMI 1640) בינונית בתוספת עם 2% B27 תוספת (50x, ללא אינסולין), ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוזים הסופיים: 100 IU/mL ו100 μg/mL, בהתאמה). אלא אם צוין, בכל שינוי בינוני, להוסיף את העוצמה הנדרשת עם Wnt3a והפעלות A בריכוז סופי של 50 ng/mL ו 100 ng/mL, בהתאמה. הערה: החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.</li>
		<li>הפוך hepatoblast חוז בידול בינוני המורכב של מדיום שונה של Dulbecco הנשר (KO-DMEM) עם 20% החלפת סרום (KOSR) ושיושלם עם 0.5% של תוסף חלופי ל-L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1 מ"מ ביתא-mercaptoethanol, 1% diמתיל סולפוקסיד (DMSO), ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזי הסופי ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). מסנן תחת ואקום. הערה: החנות ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.</li>
		<li>הפוך hepatocyte התבגרות בינונית המורכבת של hepatocyte בינונית בתוספת עם 1% של תוסף חלופי ל-גלוטמין, 10 μM הידרוקורטיזון מלחים מלח נתרן (HCC), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוזים הסופיים ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). עבור כל שינוי בינוני, להוסיף את העוצמה הנדרשת עם OSM ו HGF (ריכוזי הסופי ב 20 ng/mL ו-10 ng/mL, בהתאמה). הערה: אחסן את המניה ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.</li>
		<li>להפוך hepatocyte תחזוקה בינונית המורכבת של E בינונית של ויליאם השלימה עם 10% החלפת סרום, המורכב 1% של תוספת חלופית L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים סופיים ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה). עבור כל שינוי בינוני, הוסף את העוצמה הנדרשת עם HGF, EGF, bFGF ו-וורף (הריכוז הסופי של כל גורם גדילה ב-10 ng/mL). הערה: אחסן את המניה ב -4 ° c ושימוש בתוך שבועיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בדוק את מערך ה-hepatosphere 24 שעות שלאחר זריעה והתחל בבידול. בזהירות להסיר את המדיום mTeSR1 ולהחליף אותו עם 1 מ ל של בינוני חדש בידול עור בתוספת עם 100 ng/mL הפעילות A ו 50 ng/mL Wnt3a.</li>
	<li>שינוי בינונית לטרמה בתוספת עור כל 24 שעות עבור 3 ימים עבור hESCs. בעבודה עם hiPSCs, הארך את השלב במשך יומיים נוספים הכוללים את המדיה באמצעות הפעילות (100ng/mL) בלבד.</li>
	<li>בעקבות האינדוקציה האנדופאתית הסופית, לעבור לתוך מחוז hepatoblast ידול בינוני עבור מפרט hepatoblast חוז עבור 5 ימים החלפת המדיום כל 2 ימים ולבצע את השינוי האחרון ביום האחרון של המפרט hepatoblast חוז.</li>
	<li>העבר את הספירות לתוך הבארות הצופות בפולי-HEMA.
	<ol>
<li>שטוף את התאים פעם אחת עם התבגרות ההבשלה בינונית ללא תוספי מזון לאחר הסרת KSR/DMSO בינונית ולהוסיף 1 מ ל של התבגרות ההבשלה של hepatocyte שיושלם עם 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM.</li>
		<li>תוך שימוש בפיפטה P1000, הרם את הספירות מתוך המיקרו-ליטוף של התמיסה מספר פעמים.</li>
		<li>העבר את המדיום המכיל את הספירות לבאר מצופה פולי HEMA.</li>
		<li>לשטוף את מיקרוצלחת הצמח באמצעות 1 מ ל של התבגרות ההבשלה בינונית בתוספת 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM ולהעביר את המדיום כדי פולי HEMA מצופה היטב.</li>
		<li>חזור על השלב 3.6.4 פעמים רבות ככל האפשר על מנת להעביר את כל כדורי hepatospheres המיקרו לוחית. הערה: זה קריטי לפיפטה בזהירות למעלה ולמטה את הפתרון המכיל את כדורי hepatospheres להימנע מפגיעה בהם.</li>
	</ol></li>
	<li>הקפדה בזהירות על המדיום עודף מבלי להסיר hepatospheres באמצעות מP100 בצנרת עד ~ 1 מ ל של בינוני המכיל את הספירות האלה נשאר ב פולי-HEMA מצופה היטב.</li>
	<li>לשנות את המדיום כל 48 h עבור 12 ימים.</li>
	<li>ביום 20 כאשר עובדים עם hESCs או יום 22 אם עובדים עם hiPSCs, העבר את המדיום למדיום תחזוקה hepatocyte.
	<ol>
<li>הסרת hepatocyte התבגרות בינונית ולשטוף את התאים פעם אחת עם מדיום תחזוקה hepatocyte ללא תוספי. להוסיף 1 מ ל של מדיום תחזוקה hepatocyte שיושלם עם 10 ng/mL של HGF, EGF, FGF ו-ואגף.</li>
	</ol></li>
	<li>לשנות את המדיום עבור תחזוקה מדיום טרי החציט כל 48 h.</li>
</ol>4. ניתוח פונקציונלי של מתורבת לטווח ארוך תלת-ממד כדורים החפאאלים
<ol><li>עבור אל hepatocyte התבגרות בינונית בתוספת עם 10 μM HCC, L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזי הסופי ב 100 IU/mL ו 100 μg/mL, בהתאמה) ו 10 ng/mL HGF 48 h לפני ביצוע ניתוח פונקציונלי.</li>
	<li>
ניתוח של הפונקציה המטבולית של hepatocyte באמצעות ציטוכרום (CYP) P450 assays.
	<ol>
<li>להחליף בינוני עם 1 מ ל של ההבשלה התבגרות טריים בינונית בתוספת עם 50 μM לluciferin-6'-פנטטאורו-בנזיל אתר (לוציפראב-PFBE) מצע לזיהוי פעילות CYP3A בסיס או 100 μM לוציפראב-מתיל אתר (לוציפראב-ME) מצע לזהות CYP1A2 פעילות בסיס (מספר המשכפלת = 3). השתמש במדיה של תרבות הרקמה כשליטה שלילית. הערה: כדי למנוע הצלבה, מומלץ לא להשתמש באותם בארות המכילים 3D hepatospheres כדי לבדוק פעילויות שונות CYP P450 אלא לבצע אותם בבארות נפרדות.</li>
		<li>התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° C.</li>
		<li>לאסוף את הסופרנטנים על-ידי טיפ P100 מתוך ולבצע את השיטה לפי הוראות היצרן.</li>
		<li>למדוד את הרמות היחסיות של פעילות בסיס ולנרמל ל-mg חלבון כפי שנקבע על ידי שיטת החומצה הבינותית (BCA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
סרום לבדיקת חלבון משתמש בשיטת חיסוני מקושרת אנזימים (אליסה).
	<ol>
<li>החלף בינוני עם 1 מ ל של התבגרות החלציט טרי מדיום בתוספת 10 ng/mL HGF ו 20 ng/mL OSM (מספר משכפל = 3). השתמש במדיה של תרבות הרקמה כשליטה שלילית.</li>
		<li>התאים הדגירה עבור 24 h ב 37 ° C.</li>
		<li>לאסוף את supernatant באמצעות עצה P100 tte ולמדוד את הרמות היחסיות של ייצור חלבון הסרום לפי הוראות היצרן.</li>
		<li>הנורמליזציה לחלבון mg לפי הקביעה שנקבעה על-ידי שיטת BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימונוציטוכימיה
<ol><li>
הכנת חתכי פרפין המכילים כדורים.
	<ol>
<li>שטוף את הכדורים שלוש פעמים. עם כדורי הרנטגן</li>
		<li>תקן את הכדורים עם מתנול קר קרח במשך 30 דקות.</li>
		<li>שטוף שלוש פעמים עם 1x DPBS.</li>
		<li>הטמע the hepatospheres ב 300 μL של פתרון מחוסמת של 2% agarose מומס H2O באמצעות באר ריקה של צלחת 24-היטב כתבנית ולהשאיר אותו לגבש עבור 30 דקות.</li>
		<li>הטמע את הצמח המכיל את הספירות בפרפין.</li>
		<li>סעיף בלוק פרפין המכיל hepatospheres קבוע ב 4 יקרומטר סעיפים עבים באמצעות microtome.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דה-שעווה והסבה של הסעיפים. הערה: השתמש בפתרונות רעננים בכל פעם שניתן. אין להשתמש בפתרונות שהיו על שוקת הצביעת במשך יותר משבוע.<ol>
<li>מקם מקטעים במדף שקופיות.</li>
		<li>לטבול מתלה שקופיות המכיל סעיפים באבוס מכתים המכיל 300 mL של קסילן עבור 5 דקות.</li>
		<li>חזור על שלב ה5.2.2.</li>
		<li>לטבול באתנול מוחלט עבור 20 s.</li>
		<li>לטבול ב 95% אתנול עבור 20 s.</li>
		<li>לטבול ב 90% אתנול עבור 20 s.</li>
		<li>לטבול ב 80% אתנול עבור 20 s.</li>
		<li>לטבול ב 70% אתנול עבור 20 s.</li>
		<li>להשקות מחדש את הסעיפים עם מים עבור 5 דקות. הערה: שמור על השקופיות באותו מדף שקופיות והעבר אותה מאבוס כתמים אחד לשני. הנפח המשמש (בדרך כלל ~ 300 mL) תלוי בגודל של שוקת הצביעת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לאחזור אנטיגן של מקטעי פרפין המכילים כדורי hepatospheres
	<ol>
<li>חום דה-שעווה מקטעים מחדש ב-1x טריס-EDTA (TE) pH 9.0 מאגר פתרון עבור 15 דקות במיקרוגל ב 800 W.</li>
		<li>לצנן את דגימות על ידי האישר אותם במי ברז עבור 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כתמים חיסוני.
	<ol>
<li>דגירה שקופיות עם פתרון חסימה העשוי PBS עם 0.1% polysorbate 20 (PBS/T)/10% BSA עבור 1 h בשעה RT.</li>
		<li>החלפת פתרון חסימת עם הנוגדן העיקרי המתאים מדולל ב-PBS/T/1% BSA ו-דגירה ב 4 ° צ' עם עצבנות עדינה בן לילה.</li>
		<li>שטוף תאים עם PBS/T עבור 5 דקות וחזור שלוש פעמים.</li>
		<li>דגירה עם הנוגדן המשני המתאים מדולל ב-PBS/T/1% BSA ו-דגירה בחושך ב-RT במשך 1 h עם עצבנות עדינה. הערה: הנוגדנים העיקריים והמשניים הממוטבים מפורטים ברשימת החומרים.</li>
		<li>שטוף תאים עם PBS/T עבור 5 דקות וחזור שלוש פעמים.</li>
		<li>להוסיף 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) לתאים לפי הוראות היצרן והמקום שמיכות זכוכית בעדינות כדי להפחית בועות אוויר. שמרו על תאים קבועים ב -4 ° c בחשכה. שימו לב לצביעת תחת מיקרוסקופ עם מסנן מתאים ומנורה פלואורסצנטית. הערה: הצלחות מאחסנות ב -4 ° c בחשכה עד להדמיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+hepatocyte-like+cells+exhibiting+functional+activities.">Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities.</a> Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Differentiation+of+Hepatocytes+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+Exhibiting+Markers+Recapitulating+Liver+Development+In+vivo.">Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo.</a> STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Hannan, N. R., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatocyte+like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Functional+Human+Hepatic+Endoderm+from+Human+iPS+cells.">Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells.</a> Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Generation+of+Human+Hepatocyte-like+Cells+from+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).</li><li>Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+Production+of+Hepatocyte+Like+Cells+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Innate+Immunity+Improves+Hepatitis+C+Virus+Infection+and+Replication+in+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes.">Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).</li><li>Lyall, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+human+hepatocyte-like+cells.">Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Lucendo-Villarin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+foetal+exposure+to+maternal+smoking+using+hepatoblasts+from+pluripotent+stem+cells.">Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells.</a> Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+networks+and+transcription+factor+motifs+defining+the+differentiation+of+stem+cells+into+hepatocyte-like+cells.">Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells.</a> Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).</li><li>Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+hepatocytes:+using+materials+to+define+cellular+differentiation+and+tissue+engineering.">Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).</li><li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development.">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Gieseck, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLoS ONE. 9 (1), (2014).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).</li><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency.">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li><li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+hepatospheres+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+and+Reproducible+Production+of+Liver+Buds+Entirely+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li></ol>

דוד ס. חי הוא מייסד ובעל בעלי מניות של סטנובאט בע מ והיירסטייקים בע מ. שאר המחברים מאשרים כי אין להם ניגודי אינטרסים בנושא או בחומרים הנדונים במאמר זה.

ההתפתחות של מערכות xeno-free לייצר האדם hepatospheres בתלת-ממד נדרש הן בתחום החוץ והן בvivo מאמצים. בשלב הנוכחי רוב ההפטציט גישות מתאי גזע בעלי עוצמה מעשית בשתי תרבויות ממדיות. סביבות אלה חסרות הרבה רמזים סביבתיים המעורבים רקמות בראשית הומאוסטזיס הכוללים; אינטראקציות תא הטרוטיפקס, ייצור מטריקס ושיפוץ, וכתוצאה מכך תרגום עני ל vivo ביולוגיה18,19.
כתוצאה מכך, המחקר התמקד גישות חלופיות להפקת hepatospheres מתאי גזע פלאוריטי. מספר מחקרים תלת-ממדיים התקדמו לאורך המגרש, אך אלה נשענים על מוצרים בעלי חיים20,22,24 לספק תמיכה ו/או דורשים שימוש ברקמת האדם21,22 אשר מסבך טכנולוגיה היקף ופשרות היישום הנסיוני והאפליקציה.
הנוהל המתואר במאמר שלנו (איור 1) מוגדר, יעיל, מאוד מועיל וחסכוני, ומאפשר הפקת כדורי כבד פונקציונליים, אשר נשארים פונקציונליים לאורך שנה בתחום החוץ, ומספקים תמיכה קריטית בכבד ב . vivo14 חשוב, פלטפורמה זו מאפשרת למשתמש לשלוט בגודל של כדורי הכבד 3D, הגבלת היווצרות של מרכזים נקרופטיים צפוף ואובדן של פנוטיפים.
העברת הספירות התלת-ממדית ללוחות הציפוי של פולי-HEMA מייצגת שלב קריטי בפרוטוקול זה. חשוב לפיפטה בעדינות בשלב זה בהליך כדי להימנע מפגיעה בכדור. בנוסף, יש לבצע בקפידה שינויי מדיה כדי למנוע הטיית מתח ועיוות של מבנה הספירה.
במחקרים אלה, 3D hepatospheres הציגו מבנה מאורגן (איור 2 ואיור 3), ציטוכרום P450 פונקציה (איור 4) ו חלבונים בכבד המופרש, כולל אלבומין ו אלפא פטוטופרוטאין (איור 5). הליך זה כבר בוצע בהצלחה בארבעה שורות בתאי גזע החזקים עם תוצאות דומות. במבט קדימה, טכנולוגיה זו יכולה להיות מועסק כפלטפורמה לפתח רקמות שורש נוסף, mesenchymal עם ארכיטקטורות מורכבות.

היכולת של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) לחידוש עצמי, תוך שמירה על גמישות, מספקת הזדמנות לייצר סוגי תאים אנושיים ורקמות על פי דרישה. hPSCs הובלו ביעילות לתאים של הפאציט (hlcs) באמצעות מערכות תרבות דו ממדיות (2d),1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10 מערכות אלה נעשה שימוש בהצלחה מודל מונוגניים מחלה, מחזור חיים של וירוס, התרופה הנגרמת פגיעה בכבד (dili), חשיפה העובר רעלים ומחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (nafld)11,12,13 ,14,15. עם זאת, מודלים אלה בעלי מספר חסרונות, אשר מגבילים את השימוש השגרתי שלהם. אלה כוללים ביטוי מסמן העובר, פנוטיפ לא יציב ואדריכלות הרקמה המסכנה16,17,18,19, אשר יכול גם להגביל את הפונקציה לתפקוד איברים ב vivo.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, תלת מימדי (3D) פלטפורמות בידול פותחו לחקות באדריכלות רקמה vivo. למרות הפיכתה, גישות אלה להסתמך על השימוש של מוצרים נגזר בעלי חיים ומטריצות כדי לכונן רקמת בראשית20,21,22, הגבלת בהיקף ויישום נרחב.
כאן, אנו פירוט הליכים כדי ליצור כמויות גדולות של 3D hepatospheres מ hPSCs באמצעות חומרים מוגדרים הרכבה עצמית תא. בעיקר, את רקמת שנוצר על ידי ההליך שלנו נשאר פונקציונלי במשך יותר משנה אחת בתרבות התא והוא מסוגל לתמוך בתפקוד הכבד ב vivo23.
לסיכום, שלנו גישה בידול מוגדר מאפשר את הדור של הגוף האנושי יציבה האדם מתאי גזע האדם העובריים (hESCs) ו המושרה תאים גזע pluripotent (iPSCs). אנו מאמינים כי ההליך המתואר מייצג פריצת דרך משמעותית בדור של 3D hepatospheres עבור מחקר מדעי בסיסי ומיושם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:993px;" width="993">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Cell Culture and functional assays</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>10766834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A2058&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Activin A&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Alpha Fetoprotein ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Basic Fibrobaslt Growth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Epithelial Gropwth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Oncostatin M&#160;</td>
			<td>Peprotech&#160;</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Recombinant Laminin 521&#160;</td>
			<td>BioLamina&#160;</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin ELISA</td>
			<td>Alpha Diagnostics</td>
			<td>1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Vascular Growth Factor</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-mold spheroids&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z764000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P3932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant mouse Wnt3a&#160;</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Equipment</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Microwave</td>
			<td style="width:183px;">Bosch</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Microtome</td>
			<td style="width:183px;">Leika</td>
			<td style="width:196px;">RM2125RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:379px;">Antibodies</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A6684&#160;</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">CYP3A4</td>
			<td style="width:183px;">University of Dundee</td>
			<td style="width:196px;">University of Dundee</td>
			<td style="width:236px;">1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HNF-4&#945;</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">IgG</td>
			<td style="width:183px;">DAKO</td>
			<td style="width:196px;">X0943</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:379px;">Vimentin</td>
			<td style="width:183px;">DAKO</td>
			<td style="width:196px;">M0725</td>
			<td style="width:236px;">1:100 (sheep)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

serum free production of three-dimensional human hepatospheres from pluripotent stem cells

התפתחות של מקורות מתחדשים של רקמת הכבד נדרשת כדי לשפר את העיצוב המבוסס על תאים, ולפתח רקמות האדם להשתלה. האדם תאים גזע עובריים (hESCs) ותאי גזע המושרה האדם pluriפוטנטי (hiPSCs) מייצגים מקורות מבטיחים של כדורי כבד אנושיים. פיתחנו סרום חינם ומוגדר שיטה של בידול הסלולר כדי ליצור כדורים תלת מימדי הכבד האנושי הנוצר מתאי גזע האדם pluriפוטנטי. מגבלה פוטנציאלית של הטכנולוגיה היא הפקת כדורים צפופים עם חומר מת בפנים. כדי לעקוף את זה, העסקנו את טכנולוגיית המיקרוגל בצפיפות תא מוגדרת כדי לשלוט בגודל הספירות התלת-ממדית, מניעת הדור של ליבות האפוטוטיות ו/או נמק.  בעיקר, הספירות שנוצרו על ידי הגישה שלנו להציג את תפקוד הכבד ואת פנוטיפ יציבה, המייצג משאב יקר עבור מחקר בסיסי ומיושם מדעי. אנו מאמינים כי הגישה שלנו יכול לשמש כטכנולוגיה פלטפורמה כדי לפתח רקמות נוספות למודל ולטפל במחלות אנושיות ובעתיד יכול לאפשר את הדור של רקמת האדם עם אדריכלות רקמה מורכבת.

אגרגטים תלת מימדיים מתוך קו הגזע העובריים (H9) או קו הגזע המושרה החזק pluripotent P106) הובלו לקראת שושלת היוחסין של hepatocyte באמצעות ההליך המוגדר שלנו (איור 1). בתאי גזע פלאוריטי היו ראשונים מוכן לכיוון האנדופתית הסופית לפני מפרט hepatoblast חוז. בעקבות זאת, הבשיל הבשילו לתוך שלושה יח ' הפטאודורים שיכלו להישמר בתרבות עד לשנה23.
כדי ללמוד את המבנה של כדורים תלת-ממדיים, הספירות של hESC-or iPSC, שנות היום, הינן קבועות ומוכתמות כדי לזהות את הנוכחות של חלבונים המתבטאים בתאי הפטוציטים ובתאים mesenchymal. הפטציט גורם גרעיני 4 אלפא (HNF4α) ו הסמן mesenchymal היתה מועסקים, חשיפת נוכחות של שכבה חיצונית המורכבת החרופציט כמו תאים המקיפים ליבה של תאי mesenchymal (איור 2). עקבנו אחר הניסויים הללו באמצעות ניתוח ביטוי החלבונים המובטאים בהיפטציטים: אלבומין, CYP3A ו-E-קדהרין. המונח "חיסוני" חשף שהביטוי של חלבונים אלה הוגבל לרובד החיצוני של התחומים (איור 3).
ניתוחים פונקציונליים של כדורי hepatospheres וצעו ביום 30 תרבויות. CYP1A2 ו CYP3A הם אנזימים חשובים בתוך hepatocytes פונקציונלי. הפעילות שלהם הוערך באמצעות assays הוקמה. H9-כדורי hepatospheres הציגו CYP3A פעילות של 220,375 ± 74514 RLU/mL/mg חלבון ו CYP1A2 פעילות של 732,440 ± 33,330 RLU/mL/mg חלבון (איור 4א). פעילות CYP3A ב-P106 hepatospheres היה 132117 ± 43,391 RLU/mL/mg חלבון ו CYP1A2 פעילות היתה 409,907 ± 121,723 RLU/mL/mg חלבון (איור 4ב). בהשוואה לשתי קבוצות של hepatocytes הראשי האדם, כדורי הכבד 3D הציג רמות מכובד של פעילות CYP10.
ניתוח סינתזה והפרשת אלבומין ו-alpha-fetoprotein (AFP) חשף כי H9-נגזר hepatospheres מופרש 683.9 ± 84 ו 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg חלבון של אלבומין ו-alpha-fetoprotein, בהתאמה (איור 5א). בעוד P106-hepatospheres נגזר מופרש 497 ± 41 ו 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg חלבון של אלבומין ו-alpha-fetoprotein, בהתאמה (איור 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> איור 1 : הליך בידול סטפני ליצור 3d hepatospheres מ hESCs. הסוגריים הכחולים מייצגים ימים של בידול עבור hiPSCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> איור 2 : התארגנות מבנית של כדורי תלת-ממד. תמונות מייצגות של הביטוי של הגורם הגרעיני של hepatocyte 4 אלפא (HNF4α-green) ו-vimentin (אדום) ב-(א) H9-d הנגזרות תלת-ממד ו-(ב) P106-נגזרות תלת-ממד כדורים ובקרות החיסוני המקביל שלהם G (igg) . סרגלי קנה מידה מייצגים 60 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> איור 3 : הערכה של ביטוי סמן הכבד בתוך 3D hepatospheres. תמונות מייצגות של הביטוי של הפטציט סמנים-אלבומין, CYP3A, E-קדהרין ושולטת הigg המקבילה שלהם ב (א) H9-ו (ב) P106-3d הנגזרים כדורים. קנה מידה של סרגלים = 60 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> איור 4 : ציטוכרום P450 פונקציה ב-3D hepatospheres. מדידה של ציטוכרום P450 1A2 ו-3A הפעילות ב (A) H9-3a הנגזרים ספירות ו (ב) P106-הנגזרת 3a hepatospheres. הנתונים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל ביולוגי, וקווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן (SD). הפעילות מצוטטים כיחידות אור יחסיות (RLU) לכל מ ל לחלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> איור 5 : ניתוח הפרשת החלבון של hepatosphere. הפרשת אלבומין ואלפא פטופפרוטאין (AFP) נותחו ב-(א) H9-d-האפיכדורים תלת-ממדיים ו-(ב) P106-הנגזרים התלת-ממדיים. הנתונים מייצגים שלושה משכפל ביולוגי, ושורות השגיאה מייצגות את ה-SD. החלבון המופרש מצוטט כ-ננוגרם של חלבון ל-mL לכל מ ל 24 שעות לכל מ ג של חלבון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר גישה להפקת hepatospheres של תאי גזע האדם בעלי עוצמה באמצעות מערכת התרבות המוגדרת הרכבה עצמית תא. פרוטוקול זה מתוכנת במספר קווי תאים, העלות האפקטיבית ומאפשרת ייצור של כדורי גוף האדם יציבים עבור יישומים ביו-רפואיים.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

זה מתוגנטי כמות גדולה של hepatospheres 3D של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חומרים עדין ותאי הרכבה. ההתקדמות העיקרית של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת שליטה בגודל של כדורי הכבד 3D, הגבלת היווצרות של מרכזים נמקיים ואובדן פנוטיפ. הדגמת ההליך איתי תהיה יו וונג, פוסט דוקטורט במעבדה שלנו.היכונו להציג תבניות התעוררות על ידי המסת שני גרם של טמפרטורה נמוכה נמסה agarose ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים מעוכלים. מחממים בזהירות את התערובת במיקרוגל עם מרווח רועד כדי להמיס את ההתעוררות לחלוטין. מוסיפים 520 מיקרוליטרים של אגרוז מומס לתבנית 256 בפורמט טוב ולאפשר לו להתגבש.לאחר מכן, להעביר כל צלחת מיקרו agarose לתוך באר אחת של צלחת 12 באר. הוסף 1.5 מיליליטר של DPBS עם סידן ומגנזיום לכל באר פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות. כדי להכין את ההשעיה התא, להתחיל על ידי שאפת המדיום מתרבות מוגלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, או HPSCs.לשטוף את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר DPBS, סידן, או מגנזיום חינם ולאחר מכן להסיר את המאגר. מוסיפים חמישה מיליליטר של ניתוב תאים לתאים ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש עד שמונה דקות. יש להתבונן בניתוק התאים תחת מיקרוסקופ ולהרחיב את הדגירה למשך שעה או שתיים נוספות במידת הצורך.לעצור את התגובה על ידי הסרת ריאגנט דיסוציאציה התא והוספת חמישה מיליליטר של MT טרי לשרת מדיום אחד בתוספת 10 מעכבי סלע micromolar, Y27632. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לנתק תאים. לספור את התאים קיימא עם ההמוציטומטר ואת הכתמים הכחולים trypan על מנת לחשב את המספר הכולל של תאים הדרושים.העבר את המספר הרצוי של תאים לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 או 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים. להשליך את supernatant מחדש להשעות את התאים MT לשרת מדיום אחד עם 10 מעכבי סלע micromolar עבור ריכוז סופי של 2.1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, להציל את התאים על ידי הוספת 190 microliters של השעיית תא מוכן לכל באר מיקרו אגרוז ודגירה של צלחות מיקרו אגרוז ב 37 מעלות צלזיוס בחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שעתיים.לאחר הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של טרי, חם, T-לשרת מדיום אחד עם מעכבי סלע לכל באר. מחזירים את הצלחות לאנקובטור ומשאירים אותן שם למשך 24 שעות. למחרת, לבחון את תחום היווצרות.הכינו בארות מצופות פולי-2 הידרוקסיאתיל או פולי-הימה על ידי המסת שני גרם של פולי-הימה ב-100 מיליליטר של 95% אתנול וערבבו את הפתרון בן לילה על צלחת חמה של 55 מעלות צלזיוס. למחרת, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של הפתרון לכל באר של צלחת 24 באר ולייבש את הצלחת לילה בתנור 60 מעלות צלזיוס. ליזום התביור hepatocyte על ידי הסרת בזהירות MT לשרת מדיום אחד מן התאים זרעים בעבר והחלפתו עם מיליליטר אחד של מדיום התברדות אנדודרם טרי.לתאי גזע עובריים אנושיים, יש לרענן את המדיום כל 24 שעות במשך שלושה ימים. חשוב ליזום התביור hepatocyte 24 שעות לאחר הזריעה, כדי למנוע התבראות תאים ספונטנית. לאחר אינדוקציה אנדודרמה סופית, לעבור את המדיום למדיום התברואה hepatoblast במשך חמישה ימים.החלף את המדיום כל יומיים, ביצוע השינוי האחרון ביום האחרון של מפרט hepatoblast. כדי להעביר את hepatospheres לתוך בארות מצופה פולי-hema מוכן, לשטוף את התאים עם מדיום התבגרות hepatocyte ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של המדיום בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר HGF ו 20 ננוגרם לכל OSM מיליליטר. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להרים את hepatospheres מצלחת מיקרו agarose ולהעביר אותם פולי הימה מצופה היטב.לשטוף את צלחת מיקרו agarose עם מיליליטר אחד של מדיום התבגרות hepatocyte בתוספת ולהעביר את המדיום לפולי-hema מצופה היטב. באמצעות P-100 פיפטה, בזהירות שאף מדיום עודף מבלי להסיר hepatospheres עד שיש כמיליליטר אחד של בינוני שמאל הבאר. יש לרענן את המדיום כל 48 שעות למשך 12 יום.אם עובדים עם תאי גזע עובריים, מעבירים את המדיום למדיום תחזוקה hepatocyte ביום 20 על ידי הסרת מדיום ההבשלה, שוטפים את התאים עם מדיום תחזוקה, ולאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תחזוקה נוסף. לאחר מכן, רענון בינוני כל 48 שעות. שינויים מיידיים חייבים להתבצע בזהירות כדי למנוע מתח ועיוות רציניים של מבנה כדורי זה.כתמים עבור hepatocyte בסמנים mesenchymal מתענג כי hepatospheres נוצר באמצעות טכניקה זו מורכבים תאים דמויי hepatocyte המקיפים ליבה של תאים mesenchymal. חלבונים אחרים המובעים בדרך כלל בהפטוציטים נמצאים גם בשכבה החיצונית של הספירות. ניתוח תפקודי של אנזימי ציטוכרום P450 או CYP בתרבויות הפטוספירה של 30 יום הראה כי הספירות תלת-מימדיות מציגות רמות מכובדות של פעילות CYP בהשוואה להפטוציטים ראשוניים אנושיים.יתר על כן, ניתן להדגים כי hepatospheres להפריש חלבונים בכבד כגון אלבומין אלפא-fetoprotein. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עבור פרוטוקול זה הוא בעדינות pipette למעלה ולמטה את הפתרון המכיל hepatospheres 3D בעת העברתם לתוך צלחת מצופה פולי-hema. זה עוזר להימנע מפגיעה בהם.לאחר השליטה, מתודולוגיה זו מאפשרת את הדור של כדורי כבד 3D להישאר פונקציונלי על פני שנה במבחנה עם יישומים מרובים במודלים הונאה הקרנת סמים. במבט קדימה, טכנולוגיה זו יכולה להיות מועסקת כפלטפורמה לפתח רקמות entodermal ו mesenchymal נוספות עם ארכיטקטורות מורכבות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...