Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Myositis Association og Peter Buck Foundation. Vi vil gerne takke Dr. Yuanfan Zhang for at dele sin ekspertise og træning i xenograft Operations teknik.

Al brug af forskningsenheder fra forsøgspersoner blev godkendt af Johns Hopkins institutions Review Board (IRB) for at beskytte deltagernes rettigheder og velfærd. Alle dyreforsøg blev godkendt af Johns Hopkins University institutionel Animal Care og brug Committee (IACUC) i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) guide til pleje og brug af forsøgsdyr. Mandlige NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) Host-mus (8-12 uger gamle) bruges til at udføre xenog...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Patient afledte xenografter er en innovativ måde at modellere muskelsygdomme og udføre prækliniske undersøgelser. Den beskrevne metode til at skabe skeletmuskulatur xenografter er hurtig, ligetil og reproducerbar. Ensidige operationer kan udføres i 15 til 25 minutter, eller bilateralt i 30 til 40 minutter. Bilaterale xenografter kan give yderligere eksperimentel fleksibilitet. For eksempel, forskere kan udføre lokaliseret behandling af en xenograft, med den anden venstre som en kontrol. NRG-musene er modstandsdygti...

Det er blevet rapporteret, at kun 13,8% af alle narkotika udviklingsprogrammer undergår kliniske forsøg er vellykket og føre til godkendte terapier1. Selv om denne succesrate er højere end de 10,4% tidligere rapporterede2, er der stadig betydelige plads til forbedringer. En metode til at øge succesraten for kliniske forsøg er at forbedre laboratorie modeller, der anvendes i præklinisk forskning. Food and Drug Administration (FDA) kræver dyreforsøg for at vise behandlingens virkning og vurdere toksicitet før fase 1 kliniske forsøg. Der er dog ofte begrænset overensstemmelse i behandlingsresultaterne mellem dyreforsøg og kliniske forsøg3. Desuden kan behovet for prækliniske dyreforsøg være en uovervindelig barriere for terapeutisk udvikling i sygdomme, der mangler en accepteret dyremodel, hvilket ofte er tilfældet for sjældne eller sporadiske sygdomme.
En måde at modellere sygdomme hos mennesker på er ved at Trans planterer humant væv til immundefekt mus for at generere xenografts. Der er tre vigtige fordele ved xenograft-modeller: for det første kan de rekapitulere de komplekse genetiske og epigenetiske abnormiteter, der findes i sygdomme hos mennesker, som aldrig kan reproducerbare i andre dyremodeller. For det andet kan xenografter bruges til at modellere sjældne eller sporadiske sygdomme, hvis der er tilgængelige patientprøver. For det tredje modellere xenografter sygdommen inden for et komplet in vivo-system. Af disse grunde har vi en hypotese om, at behandlingseffekt resultater i xenograft-modeller er mere tilbøjelige til at oversætte til forsøg hos patienter. Humane tumor xenografter er allerede blevet udnyttet med succes til at udvikle behandlinger for almindelige kræftformer, herunder multipelt Myeloma, samt personligt tilpassede terapier for individuelle patienter4,5,6, 7.
For nylig, xenografter er blevet brugt til at udvikle en model af human muskelsygdom8. I denne model, humane muskel biopsiprøver er transplanteres i bagbenene af immunodedygtige NRG mus til dannelse af xenografts. De transplanterede humane myofibers dør, men humane muskel stamceller, der er til stede i xenograft, udvider og differentierer efterfølgende til nye humane myofibers, som genbefolker den enpodede humane basal lamina. Derfor er de regenererede myofibers i disse xenografter helt menneskelige og er spontant revaskulariseret og innerveret af musen vært. Vigtigere, fascioscapulohumeral muskuløs dystrofi (FSHD) patient muskelvæv transplanterede i mus rekapitulerer centrale elementer i den menneskelige sygdom, nemlig udtryk for DUX4 transkriptionen faktor8. Fshd er forårsaget af overekspression af DUX4, som er epigenetisk lyddæmpet i normale muskelvæv9,10. I FSHD xenograft-modellen har behandling med en DUX4-specifik morpholino vist sig at undertrykke DUX4 ekspression og funktion med succes og kan være en potentiel terapeutisk mulighed for fshd-patienter11. Disse resultater viser, at humane muskel xenografter er en ny tilgang til model Human muskelsygdom og teste potentielle terapier i mus. Her beskriver vi i detaljer den kirurgiske metode til at skabe humane skeletmuskulatur xenografter i immundefekt mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

De behandlingseffekter, der er observeret i dyreforsøg, gentages ofte ikke i kliniske forsøg. Selv om dette problem er mangesidet, er en af grundene til denne fiasko brugen af utilstrækkelige laboratorie modeller. Det er udfordrende at modellere komplekse sygdomme hos mennesker i traditionelle laboratorie organismer, men dette problem kan omgås gennem studiet af humane xenografter. Den kirurgiske metode, vi beskriver her, giver mulighed for at oprette humane skeletmuskulatur xenografts, som kan bruges til at modellere muskelsygdomme og til at udføre præklinisk terapeutisk testning. Under en IRB-godkendt protokol, er skeletmuskulatur prøver erhvervet fra patienter og derefter transplanteret i NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) Host mus. Disse mus er ideelle værter for transplantation undersøgelser på grund af deres manglende evne til at gøre modne lymfocytter og er derfor ude af stand til at udvikle celle-medierede og humorale adaptive immunrespons. Host mus er bedøvet med isofluran, og musen tibias forreste og extensor digitorum longus muskler fjernes. Et stykke menneskelig muskel placeres derefter i det tomme tibiale rum og sutureres til den proksimale og distale sener af peroneus longus muskel. Den xenograferede muskel er spontant vaskulariseret og innerveret af musen vært, hvilket resulterer i robust regenereret menneskelige muskler, der kan tjene som en model for prækliniske undersøgelser.

Som påvist af yuanfan Zhang et al., denne kirurgiske protokol er en ligetil metode til at producere menneskelige skeletmuskulatur xenografter8. Regenereret xenografter bliver spontant innerveret og udviser funktionel kontraktilitet. Desuden sammenfattende muskel xenograferet fra FSHD patienter ændringer i genekspression observeret i FSHD patienter8.
I vores erfaring, vil ca 7 ud af 8 xenografter udført fra kontrol patientprøver vise vellykket...

Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Komplekse sygdomme hos mennesker kan være udfordrende at modellere i traditionelle laboratoriemodel systemer. Her beskriver vi en kirurgisk tilgang til model af menneskelig muskelsygdom gennem transplantation af humane skeletmuskulatur biopsier i immundefekt mus.

Udførelse af humane skeletmuskulatur Xenografts i immundefekt mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Denne protokol er signifikant, fordi det kan bruges til at skabe menneskelige skeletmuskulatur xenografts, som kan bruges til at modellere muskelsygdom og til at udføre prækliniske terapeutiske test. Denne xenograft model giver forskerne mulighed for at studere menneskelige muskler in vivo til bedre at forstå menneskelige muskelcellebiologi og til at udvikle nye modeller for sjældne eller erhvervede muskelsygdomme. Efter at have opnået en menneskelig muskel biopsi, placere prøven i en 100-by-15-millimeter petriskål indeholdende muskel medium, og bruge et stereomikroskop og kirurgisk saks til at fjerne eventuelle resterende fascia eller fedtvæv.Dissekere muskelbiopsi i ca syv-af-tre-by-tre-millimeter stykker, idet det sørges for, at fibrene er arrangeret langsgående i prøven. Dernæst overføre petriskålen, der indeholder den dissekerede muskel på is, og placere syntetiske, ikke-absorberbare suturer i en 100-by-15-millimeter petriskål på 70% ethanol. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids i en otte-til 12-ugergamle, bedøvet NOD-Rag-gamma mus, anvende salve på immundefekt dyrets øjne, og bruge en trimmer til at fjerne håret overliggende skinnebenet forreste fra anklen til knæet.Derefter anvende depilatory creme til den eksponerede hud i et minut, før desinficere operationsstedet med povidone-jod opløsning og 70% ethanol. At pode det menneskelige væv, første tape ned musebenet, og foretage en lige snit over skinnebialis forreste oprindelse på de distale sener og afslutning under knæet. Brug stump dissektion til at adskille huden fra muskelvæv, og bruge en saks til at gøre en mindre end 0,5-millimeter snit gennem epimysium af skinnebialis forreste muskel, der starter ved senen og slutter på knæet.Efter at skære den distale senen af skinnebenet forreste, gribe senen med iris stæcener, og trække musklen op mod knæet. Dernæst skæres den distale senen af extensor digitorum longus, og træk extensor digitorum longus op mod knæet. Når den proksimale senen af peroneus longus musklen er synlig, fjerne extensor digitorum longus og tibialis forreste med saksen.Brug en kirurgisk tørre våd med PBS at anvende let tryk, indtil hæmostase er opnået, og tråd en sutur gennem den proksimale peroneus longus senen, efterlader en ca 1,5-tommer stykke tråd på hver side af senen. Gør den første halvdel af en to-hånds kirurgisk firkantet knude uden at stramme til at danne en cirkel, og placere en xenograft i cirklen, stramme løkken for at sikre transplantatet væv. Gennemfør den anden halvdel af den firkantede knude for at sutur xenograft til den proksimale senen af peroneus longus, og tråd suturen gennem den distale peroneus longus senen for at gentage den firkantede knude ved den distale senen.Når begge ender af transplantatet er sikret, trække huden over xenografted muskel, forsegle snittet med kirurgisk lim, og placere to til tre kirurgiske hæfteklammer over limen. Derefter placere musen i et rent bur på en opvarmet pad med overvågning, indtil fuld recumbency. Fire til seks måneder efter operationen skal et overdækket bægerglas indeholdende 200 milliliter 2-methylbutan i en kasse tøris i mindst 30 minutter før xenografthøsten.Når 2-methylbutan er afkølet, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids, og fjerne håret overliggende skinnebialis forreste fra anklen til knæet med en trimmer og depilatory creme. Suturerne, der holder xenograften på plads, skal observeres gennem huden. Fastgør benet med tape, og brug saks og iris kraftæcesser til at åbne huden over xenograften, indtil begge suturer er afdækket.Brug en skalpel til at skære mellem xenograft og skinnebenet til at frigøre den ene side af xenograft før skæring mellem peroneus longus muskel og gastrocnemius muskel. Skær under den distale sutur og gennem den distale senen af peroneus longus, og bruge iris kraftberne til at forstå og aflede suturen mod knæet, mens du bruger en saks til at skære xenograft væk fra det underliggende muskelvæv. Brug derefter en saks til at skære over den proksimale sutur for at fjerne xenograft og peroneus longus, og læg den høstede prøve på et lille stykke pap.Pin vævet så tæt på suturerne som muligt, mens forsigtigt strække musklen for at sikre, at fiber orientering vil blive opretholdt under snap-frysning proces. Når benene er sikkert på plads, skub musklen op benene, så vævet hviler lige over pap, og snap fryse xenograft i pre-afkølet 2-methylbutan for minus 80-graders Celsius opbevaring. En vellykket xenograft demonstrerer en robust regenerering af humane myofibers som identificeret med human-specifikke antistoffer.Positiv embryonal myosin farvning inden for en del af myofibers indikerer, at regenereringsprocessen stadig er i gang. I modsætning hertil kan dårlig kirurgisk teknik eller en utilstrækkelig prøve føre til en dårlig regenerering af muskelfibre. Xenografts udført fra en patient diagnosticeret med en idiopatisk inflammatorisk myopati udviser moderat antal regenererede humane myofibers på fire-og seks-måneders samlinger, og embryonale myosin farvning fortsætter ved seks måneder.Inflammatoriske celler er også til stede i xenograft, som observeret af H og E farvning. Individuelle myofiber størrelser ligner mellem fire og seks måneder i idiopatisk inflammatorisk myopati xenografts. Sjældne fibre, der viser et tværsnitsområde større end 3, 500 mikrometer kvadreret er observeret inden for xenografts, men ikke i den idiopatiske inflammatoriske myopati biopsier, hvilket indikerer, at nogle af de myofibers i xenografts kan regenerere til et tværsnitsområde svarende i størrelse til sunde myofibers.De vigtigste dele af denne procedure er at identificere alle de sener i anklen efter den første snit er lavet og held skære gennem epimysium. Xenografts funktionelle kompetence kan vurderes ved at enzymatisk isolere enkelte myofibers og teste calciumtransienter eller ved at udføre fremkaldte tvungne målinger efter elektrisk stimulation.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering og kvantitativ Immuncytokemisk karakterisering af primære myogene celler og fibroblaster fra human skeletmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Brug af Isoleret Mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High throughput Mikropladekrav Respiratory Målinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion af akut Skeletal Muscle Regeneration af cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse af kronisk stimulering til at studere kontraktile aktivitet-induceret rotte skeletmuskulatur fænotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolation, kultur, karakterisering og differentiering af humane muskel stamceller fra skeletmuskulaturen biopsi procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolering og differentiering af primære Myoblaster fra mus skeletmuskulatur Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...