Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par l'Association Myositis et la Fondation Peter Buck. Nous tenons à remercier le Dr Yuanfan Zhang pour le partage de son expertise et de sa formation dans la technique chirurgicale de xénogreffe.

Toute utilisation de spécimens de recherche provenant de sujets humains a été approuvée par la Johns Hopkins Institutional Review Board (IRB) pour protéger les droits et le bien-être des participants. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins (IACUC) conformément au Guide des National Institutes of Health (NIH) pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les souris hôtes mâles NO...

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	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Les xénogreffes dérivées du patient sont une façon novatrice de modéliser les maladies musculaires et de mener des études précliniques. La méthode décrite ici pour créer des xénogreffes de muscle squelettique est rapide, simple, et reproductible. Les chirurgies unilatérales peuvent être effectuées en 15 à 25 minutes, ou bilatéralement en 30 à 40 minutes. Les xénogreffes bilatérales peuvent fournir une flexibilité expérimentale supplémentaire. Par exemple, les chercheurs peuvent effectuer un traiteme...

Il a été signalé que seulement 13,8 % de tous les programmes de développement de médicaments faisant l'objet d'essais cliniques sont couronnés de succès et mènent à des thérapies approuvées1. Bien que ce taux de réussite soit supérieur aux 10,4 % précédemment déclarés2,il y a encore beaucoup de place à l'amélioration. Une approche pour augmenter le taux de réussite des essais cliniques consiste à améliorer les modèles de laboratoire utilisés dans la recherche préclinique. La Food and Drug Administration (FDA) exige que des études sur les animaux montrent l'efficacité du traitement et évaluent la toxicité avant les essais cliniques de phase 1. Cependant, il y a souvent une concordance limitée dans les résultats du traitement entre les études sur les animaux et les essais cliniques3. En outre, la nécessité d'études précliniques sur les animaux peut constituer un obstacle insurmontable au développement thérapeutique dans les maladies qui n'ont pas de modèle animal accepté, ce qui est souvent le cas pour les maladies rares ou sporadiques.
Une façon de modéliser la maladie humaine est de transplanter des tissus humains dans des souris immunodéficientes pour générer des xénogreffes. Il y a trois avantages principaux aux modèles de xénogreffe : premièrement, ils peuvent récapituler les anomalies génétiques et épigénétiques complexes qui existent dans la maladie humaine qui peuvent ne jamais être reproductibles dans d'autres modèles animaux. Deuxièmement, les xénogreffes peuvent être utilisées pour modéliser des maladies rares ou sporadiques si des échantillons de patients sont disponibles. Troisièmement, les xénogreffes modéliser la maladie dans un système in vivo complet. Pour ces raisons, nous émettons l'hypothèse que les résultats d'efficacité du traitement dans les modèles de xénogreffe sont plus susceptibles de se traduire par des essais chez les patients. Les xénogreffes de tumeur humaine ont déjà été utilisées avec succès pour développer des traitements pour les cancers communs, y compris le myélome multiple, aussi bien que des thérapies personnalisées pour les patients individuels4,5,6, 7.
Récemment, les xénogreffes ont été utilisées pour développer un modèle de maladie musculaire humaine8. Dans ce modèle, des spécimens de biopsie de muscle humain sont transplantés dans les membres postérieurs des souris immunodéficientes de NRG pour former des xénogreffes. Les myofibres humaines transplantées meurent, mais les cellules souches de muscle humain présentes dans le xénogreffe se développent et se différencient par la suite en nouveaux myofibers humains qui repeuplent la lame basale humaine greffée. Par conséquent, les myofibres régénérées dans ces xérogreffes sont entièrement humaines et sont spontanément revascularisées et innervées par l'hôte de souris. Fait important, la dystrophie musculaire fascioscapulohumeral (FSHD) tissu musculaire patient transplanté chez des souris récapitule les caractéristiques clés de la maladie humaine, à savoir l'expression du facteur de transcription DUX4 8. FSHD est causée par la surexpression de DUX4, qui est épigénétiquement réduit au silence dans le tissu musculaire normal9,10. Dans le modèle de xénogreffe de FSHD, le traitement avec un morpholino DUX4-spécifique a été montré pour réprimer avec succès l'expression et la fonction de DUX4, et peut être une option thérapeutique potentielle pour des patients de FSHD11. Ces résultats démontrent que les xénogreffes musculaires humaines sont une nouvelle approche pour modéliser la maladie musculaire humaine et tester des thérapies potentielles chez la souris. Ici, nous décrivons en détail la méthode chirurgicale pour créer des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Les effets de traitement observés dans les études sur les animaux ne sont souvent pas récapitulés dans les essais cliniques. Bien que ce problème soit multiforme, l'une des raisons de cet échec est l'utilisation de modèles de laboratoire inadéquats. Il est difficile de modéliser des maladies humaines complexes dans les organismes de laboratoire traditionnels, mais cette question peut être contournée par l'étude des xénogreffes humaines. La méthode chirurgicale que nous décrivons ici permet la création de xénogreffes musculaires squelettiques humaines, qui peuvent être utilisées pour modéliser les maladies musculaires et pour effectuer des tests thérapeutiques précliniques. En vertu d'un protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel (CISR), des échantillons de muscle squelettique sont acquis auprès de patients, puis transplantés chez des souris hôtes NOD-Rag1nullIL2rMD (NRG). Ces souris sont des hôtes idéaux pour les études de transplantation en raison de leur incapacité à faire des lymphocytes matures et sont donc incapables de développer des réponses immunitaires adaptatives à médiation cellulaire et humoristique. Les souris hôtes sont anesthésiés avec de l'isoflurane, et les muscles de la souris tibialis antérieure et extensor digitorum longus sont enlevés. Un morceau de muscle humain est alors placé dans le compartiment tibial vide et suture aux tendons proximalets et distal du muscle de longus de peroneus. Le muscle xénogreed est spontanément vascularisé et innervé par l'hôte de souris, ayant pour résultat le muscle humain robustement régénéré qui peut servir de modèle pour des études précliniques.

Comme l'a démontré Yuanfan Zhang et coll., ce protocole chirurgical est une méthode simple pour produire des xénogreffes musculaires squelettiques humaines8. Les xénogreffes régénérés deviennent spontanément innervés et affichent la contractilité fonctionnelle. En outre, le muscle xénografted des patients de FSHD récapitule des changements dans l'expression de gène observédans les patients de FSHD8.
Dans notre expérience, approxi...

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Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Les maladies humaines complexes peuvent être difficiles à modéliser dans les systèmes modèles de laboratoire traditionnels. Ici, nous décrivons une approche chirurgicale pour modéliser la maladie de muscle humain par la transplantation des biopsies humaines de muscle squelettique dans les souris immunodéficientes.

Exécution des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Ce protocole est significatif parce qu’il peut être utilisé pour créer des xénogreffes musculaires squelettiques humaines, qui peuvent être utilisées pour modéliser les maladies musculaires et effectuer des tests thérapeutiques précliniques. Ce modèle de xénogreffe permet aux chercheurs d’étudier le muscle humain in vivo pour mieux comprendre la biologie des cellules musculaires humaines et de développer de nouveaux modèles pour les maladies musculaires rares ou acquises. Après avoir obtenu une biopsie musculaire humaine, placez le spécimen dans une boîte petri de 100 x 15 millimètres contenant un milieu musculaire, et utilisez un microscope stéréo et des ciseaux chirurgicaux pour enlever tout fascia ou tissu adipeux restant.Disséquer la biopsie musculaire en environ sept par trois par trois millimètres morceaux, en prenant soin que les fibres sont disposées longitudienment dans le spécimen. Ensuite, transférez la boîte de Pétri contenant le muscle disséqué sur la glace et placez des sutures synthétiques et non absorbables dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millimètres de 70 % d’éthanol. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris NOD-Rag-gamma de huit à 12 semaines, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal immunodéficient et utilisez une tondeuse pour enlever les cheveux qui survolent l’antérieur tibialis de la cheville au genou.Ensuite, appliquez de la crème depilatory sur la peau exposée pendant une minute avant de désinfecter le site chirurgical avec la solution povidone-iode et 70% d’éthanol. Pour greffer le tissu humain, d’abord ruban adhésif sur la jambe de la souris, et faire une incision droite sur l’antérieur tibialis provenant des tendons distal et se terminant sous le genou. Utilisez la dissection contondante pour séparer la peau du tissu musculaire, et utilisez des ciseaux pour faire une incision inférieure à 0,5 millimètre par l’épimysium du muscle antérieur tibialis, à partir du tendon et se terminant au genou.Après avoir coupé le tendon distal de l’antérieur tibialis, saisir le tendon avec des forceps de l’iris, et tirer le muscle vers le haut vers le genou. Ensuite, coupez le tendon distal de l’extenseur digitorum longus, et tirez l’extenseur digitorum longus vers le haut vers le genou. Une fois que le tendon proximal du muscle peroneus longus est visible, retirez l’extenseur digitorum longus et le tibialis antérieur avec les ciseaux.Utilisez un lingette chirurgicale humide avec PBS pour appliquer une légère pression jusqu’à ce que l’hémostase soit atteinte, et enfiler une suture à travers le tendon proximal peroneus longus, laissant un morceau de fil d’environ 1,5 pouce de chaque côté du tendon. Faire la première moitié d’un noeud carré chirurgical à deux mains sans serrer pour former un cercle, et placer une xénogreffe dans le cercle, serrant la boucle pour fixer le tissu de greffe. Compléter l’autre moitié du nœud carré pour suturer la xénogreffe au tendon proximal du peroneus longus, et enfiler la suture à travers le tendon distal peroneus longus pour répéter la technique du nœud carré au tendon distal.Lorsque les deux extrémités de la greffe ont été fixées, tirez la peau sur le muscle xénogreffe, sceller l’incision avec de la colle chirurgicale, et placer deux à trois agrafes chirurgicales sur la colle. Ensuite, placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la récumbence complète. Quatre à six mois après l’opération, placer un bécher couvert contenant 200 millilitres de 2 méthylbutane dans une boîte de glace sèche pendant au moins 30 minutes avant la récolte de xénogreffe.Lorsque le 2-méthylbutane a refroidi, confirmer un manque de réponse à la pincement des orteils, et enlever les cheveux au-dessus de l’antérieur tibialis de la cheville au genou avec une tondeuse et crème depilatory. Les sutures tenant la xénogreffe en place doivent être observées à travers la peau. Fixez la jambe avec du ruban adhésif et utilisez des ciseaux et des forceps d’iris pour ouvrir la peau sur la xénogreffe jusqu’à ce que les deux sutures soient découvertes.Utilisez un scalpel pour couper entre la xénogreffe et le tibia pour libérer un côté de la xénogreffe avant de couper entre le muscle peroneus longus et le muscle gastrocnemius. Coupez en dessous de la suture distale et à travers le tendon distal du peroneus longus, et utilisez les forceps de l’iris pour saisir et dévier la suture vers le genou tout en utilisant des ciseaux pour couper la xénogreffe loin du tissu musculaire sous-jacent. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper au-dessus de la suture proximale pour enlever la xénogreffe et le peroneus longus, et placez le spécimen récolté sur un petit morceau de carton.Épinglez le tissu aussi près que possible des sutures tout en étirant doucement le muscle pour s’assurer que l’orientation de fibre sera maintenue pendant le processus de snap-gel. Lorsque les broches sont solidement en place, faites glisser le muscle vers le haut des broches de sorte que le tissu repose juste au-dessus du carton, et casser geler la xénogreffe dans le pré-refroidi 2-méthylbutane pour moins 80 degrés Celsius de stockage. Une xénogreffe réussie démontre une régénération robuste des myofibers humains tels qu’identifiés avec des anticorps spécifiques à l’homme.La coloration embryonnaire positive de myosine dans une proportion de myofibers indique que le processus de régénération est toujours en cours. En revanche, une mauvaise technique chirurgicale ou un spécimen inadéquat peut conduire à une mauvaise régénération des fibres musculaires. Les xénogreffes exécutées d’un patient diagnostiqué avec une myopathie inflammatoire idiopathique montrent des nombres modérés de myofibers humains régénérés aux collections de quatre et six mois, et la coloration embryonnaire de myosine persiste à six mois.Les cellules inflammatoires sont également présentes dans la xénogreffe, comme l’observent les taches H et E. Les tailles individuelles de myofiber sont semblables entre quatre et six mois dans les xénogreffes inflammatoires idiopathiques de myopathie. Des fibres rares montrant une zone transversale supérieure à 3500 micromètres carrés sont observées dans les xénogreffes, mais pas dans les biopsies inflammatoires idiopathiques de myopathie, ce qui indique que certains des myofibers dans les xénogreffes peuvent se régénérer en une zone transversale similaire en taille aux myofibers sains.Les parties les plus importantes de cette procédure sont l’identification de tous les tendons de la cheville après l’incision initiale est faite et avec succès la coupe à travers l’épimysium. La compétence fonctionnelle des xénogreffes peut être évaluée en isolant enzymatiquement les myofibers simples et en testant les transitoires de calcium ou en effectuant des mesures forcées évoquées après stimulation électrique.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Recherche

Biologie du développement

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Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolement et différenciation des myoblastes primaires des explantations de muscle squelettique de souris

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...