Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Myositis Association und der Peter Buck Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Yuanfan Zhang für den Austausch ihrer Expertise und Ausbildung in der Xenograft-Chirurgietechnik.

Alle Verwendung von Forschungsproben von menschlichen Probanden wurde vom Johns Hopkins Institutional Review Board (IRB) genehmigt, um die Rechte und das Wohlergehen der Teilnehmer zu schützen. Alle Tierversuche wurden vom Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals genehmigt. Männliche NOD-Rag1nullIL2r-null (NRG) Wirt...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Patienten-abgeleitete Xenografts sind eine innovative Möglichkeit, Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische Studien durchzuführen. Die hier beschriebene Methode zur Herstellung von Skelettmuskel-Xenografts ist schnell, unkompliziert und reproduzierbar. Einseitige Operationen können in 15 bis 25 Minuten oder bilateral in 30 bis 40 Minuten durchgeführt werden. Bilaterale Xenografts können zusätzliche experimentelle Flexibilität bieten. Zum Beispiel können Forscher eine lokalisierte Behandlung eines Xenog...

Es wurde berichtet, dass nur 13,8% aller Arzneimittelentwicklungsprogramme, die sich in klinischen Studien befinden, erfolgreich sind und zu zugelassenen Therapien führen1. Während diese Erfolgsquote höher ist als die zuvor gemeldeten 10,4%2, gibt es noch erheblichen Raum für Verbesserungen. Ein Ansatz zur Steigerung der Erfolgsrate klinischer Studien besteht darin, Labormodelle zu verbessern, die in der präklinischen Forschung verwendet werden. Die Food and Drug Administration (FDA) verlangt, dass Tierstudien die Wirksamkeit der Behandlung nachweisen und die Toxizität vor klinischen Phase-1-Studien bewerten. Allerdings gibt es oft eine begrenzte Übereinstimmung in den Behandlungsergebnissen zwischen Tierstudien und klinischen Studien3. Darüber hinaus kann die Notwendigkeit präklinischer Tierstudien ein unüberwindbares Hindernis für die therapeutische Entwicklung bei Krankheiten sein, bei denen kein akzeptiertes Tiermodell gilt, was häufig bei seltenen oder sporadischen Krankheiten der Fall ist.
Eine Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren, besteht darin, menschliches Gewebe in immundefizizizizizizizizizizide Mäuse zu transplantieren, um Xenografts zu erzeugen. Xenograft-Modelle haben drei wesentliche Vorteile: Erstens können sie die komplexen genetischen und epigenetischen Anomalien rekapitulieren, die bei menschlichen Krankheiten existieren und in anderen Tiermodellen möglicherweise nie reproduzierbar sind. Zweitens können Xenografts verwendet werden, um seltene oder sporadische Krankheiten zu modellieren, wenn Patientenproben verfügbar sind. Drittens modellieren Xenografts die Krankheit innerhalb eines vollständigen In-vivo-Systems. Aus diesen Gründen gehen wir davon aus, dass die Wirksamkeit der Behandlung zu Xenograft-Modellen führt, die eher zu Studien bei Patienten führen. Humantumor Xenografts wurden bereits erfolgreich verwendet, um Behandlungen für häufige Krebsarten zu entwickeln, einschließlich multiples Myelom, sowie personalisierte Therapien für einzelne Patienten4,5,6, 7.
In letzter Zeit wurden Xenografts verwendet, um ein Modell der menschlichen Muskelerkrankung zu entwickeln8. In diesem Modell werden menschliche Muskelbiopsieproben in die Hinterbeine immundefizien NRG-Mäuse transplantiert, um Xenografts zu bilden. Die transplantierten menschlichen Myofiber sterben, aber menschliche Muskelstammzellen, die im Xenograft vorhanden sind, dehnen sich anschließend aus und differenzieren sich in neue menschliche Myofiber, die die transplantierte menschliche Basallamina wieder bevölkern. Daher sind die regenerierten Myofiber in diesen Xenografts vollständig menschlich und werden spontan revaskularisiert und vom Mauswirt innerviert. Wichtig ist, fascioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) Patienten Muskelgewebe in Mäuse transplantiert rekapituliert Schlüsselmerkmale der menschlichen Krankheit, nämlich Expression der DUX4 Transkriptionsfaktor8. FSHD wird durch Überexpression von DUX4 verursacht, das im normalen Muskelgewebe epigenetisch zum Schweigen gebracht wird9,10. Im FSHD Xenograft Modell hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit einem DUX4-spezifischen Morpholino die DUX4-Expression und -Funktion erfolgreich reprimieren und eine mögliche therapeutische Option für FSHD-Patienten sein kann11. Diese Ergebnisse zeigen, dass menschliche Muskelxenografts ein neuer Ansatz sind, um menschliche Muskelerkrankungen zu modellieren und potenzielle Therapien bei Mäusen zu testen. Hier beschreiben wir detailliert die chirurgische Methode zur Schaffung menschlicher Skelettmuskel-Xenografts bei immundefizienten Mäusen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Behandlungseffekte, die in Tierstudien beobachtet werden, lassen sich in klinischen Studien oft nicht rekapitulieren. Obwohl dieses Problem vielschichtigen Probleme hat, ist ein Grund für diesen Ausfall die Verwendung unzureichender Labormodelle. Es ist eine Herausforderung, komplexe menschliche Krankheiten in traditionellen Labororganismen zu modellieren, aber dieses Problem kann durch das Studium menschlicher Xenografts umgangen werden. Die chirurgische Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht die Schaffung von menschlichen Skelettmuskel-Xenografts, die verwendet werden können, um Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische therapeutische Tests durchzuführen. Im Rahmen eines von einem Institutional Review Board (IRB) zugelassenen Protokolls werden Skelettmuskelproben von Patienten erworben und dann in NOD-Rag1nullIL2r-null (NRG) Wirtsmäuse transplantiert. Diese Mäuse sind ideale Wirte für Transplantationsstudien aufgrund ihrer Unfähigkeit, reife Lymphozyten herzustellen und sind daher nicht in der Lage, zellvermittelte und humoral adaptive Immunantworten zu entwickeln. Wirtsmäuse werden mit Isofluran betäuht, und die Maus tibialis anterior und extensor digitorum longus Muskeln werden entfernt. Ein Stück menschlicher Muskeln wird dann in das leere Tibialfach gelegt und an die proximalen und distalen Sehnen des Peroneus longus Muskels vernässt. Der xenotransplantierte Muskel wird vom Mauswirt spontan vaskularisiert und innerviert, was zu robust regenerierten menschlichen Muskeln führt, die als Modell für präklinische Studien dienen können.

Wie von Yuanfan Zhang et al. gezeigt, ist dieses chirurgische Protokoll eine einfache Methode, um menschliche Skelettmuskel Xenografts zu produzieren8. Regenerierte Xenografts werden spontan innerviert und zeigen funktionale Kontraktilität. Darüber hinaus rekapituliert Muskelxenografted von FSHD-Patienten Veränderungen in der Genexpression, die bei FSHD-Patienten beobachtet wurden8.
Nach unserer Erfahrung zeigen ca. 7 von 8 Xenografts, die aus...

Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Komplexe menschliche Krankheiten können in traditionellen Labormodellsystemen eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir einen chirurgischen Ansatz zur Modellierung menschlicher Muskelerkrankungen durch die Transplantation menschlicher Skelettmuskelbiopsien in immundefizienten Mäusen.

Durchführung von Human Skeletal Muscle Xenografts bei immundefizienten Mäusen

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es verwendet werden kann, um menschliche Skelettmuskel Xenografts zu schaffen, die verwendet werden können, um Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische therapeutische Tests durchzuführen. Dieses Xenograft-Modell ermöglicht es Forschern, menschliche Muskeln in vivo zu untersuchen, um die menschliche Muskelzellbiologie besser zu verstehen und neuartige Modelle für seltene oder erworbene Muskelerkrankungen zu entwickeln. Nach Erhalt einer menschlichen Muskelbiopsie, legen Sie die Probe in eine 100 x 15-Millimeter Petrischale mit Muskelmedium, und verwenden Sie ein Stereomikroskop und chirurgische Schere, um alle verbleibenden Faszien oder Fettgewebe zu entfernen.Sezieren Sie die Muskelbiopsie in etwa sieben mal drei mal drei Millimeter, wobei darauf geachtet wird, dass die Fasern längs innerhalb der Probe angeordnet sind. Als nächstes die Petrischale mit dem sezierten Muskel auf Eis übertragen und synthetische, nicht resorbierbare Nähte in eine 100 mal 15 Millimeter lange Petrischale mit 70% Ethanol legen. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen in einer acht bis zwölf Wochen alten, anästhesierten NOD-Rag-Gamma-Maus, tragen Sie Salbe auf die Augen des immungeschwächten Tieres auf und verwenden Sie einen Trimmer, um das Haar zu entfernen, das das Tibialis vordem vom Knöchel bis zum Knie überragt.Dann eine Minute lang Enthaarungscreme auf die exponierte Haut auftragen, bevor Sie die chirurgische Stelle mit Povidon-Jod-Lösung und 70% Ethanol desinfizieren. Um das menschliche Gewebe zu transplantieren, zuerst Band auf dem Mausbein, und machen einen geraden Schnitt über die tibialis vordere, die an den distalen Sehnen und endet unter dem Knie. Verwenden Sie stumpfe Sezierung, um die Haut vom Muskelgewebe zu trennen, und verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt von weniger als 0,5 Millimetern durch das Epimysium des tibialis vorderen Muskels zu machen, beginnend an der Sehne und endend am Knie.Nach dem Schneiden der distalen Sehne des Tibialis vorder, greifen Sie die Sehne mit Iriszange, und ziehen Sie den Muskel in Richtung knie. Als nächstes schneiden Sie die distale Sehne des Extensor digitorum longus, und ziehen Sie den Extensor digitorum longus in Richtung Knie. Sobald die proximale Sehne des Peroneus longus Muskels sichtbar ist, entfernen Sie den Extensor digitorum longus und den Tibialis vorder mit der Schere.Verwenden Sie ein chirurgisches Wischen nass mit PBS, um leichten Druck auszuüben, bis Hämostase erreicht ist, und fädeln Sie eine Naht durch die proximale Peroneus Longussehne, so dass ein etwa 1,5-Zoll-Gewinde auf beiden Seiten der Sehne. Machen Sie die erste Hälfte eines zweihändigen chirurgischen quadratischen Knotens ohne Anziehen, um einen Kreis zu bilden, und legen Sie ein Xenograft in den Kreis, Die Schleife anziehen, um das Transplantatgewebe zu sichern. Vervollständigen Sie die andere Hälfte des quadratischen Knotens, um das Xenograft an die proximale Sehne des Peroneus longus zu nähen, und fädeln Sie die Naht durch die distale Peroneuslongussehne, um die quadratische Knotentechnik an der distalen Sehne zu wiederholen.Wenn beide Enden des Transplantats gesichert sind, ziehen Sie die Haut über den xenotransplantierten Muskel, versiegeln Sie den Schnitt mit chirurgischem Kleber und legen Sie zwei bis drei chirurgische Klammern über den Kleber. Legen Sie dann die Maus in einen sauberen Käfig auf einem beheizten Pad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Vier bis sechs Monate nach der Operation einen abgedeckten Becher mit 200 Millilitern 2-Methylbutan mindestens 30 Minuten vor der Xenograft-Ernte in eine Dose Trockeneis geben.Wenn das 2-Methylbutan abgekühlt ist, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen, und entfernen Sie das Haar, das den Tibialis vor dem Knöchel zum Knie mit einem Trimmer und enthaarter Creme überlagert. Die Nähte, die das Xenograft an Ort und Stelle halten, sollten durch die Haut beobachtet werden. Sichern Sie das Bein mit Klebeband, und verwenden Sie Scheren und Iriszange, um die Haut über dem Xenograft zu öffnen, bis beide Nähte aufgedeckt sind.Verwenden Sie ein Skalpell zwischen dem Xenograft und der Tibia zu schneiden, um eine Seite des Xenograft vor dem Schneiden zwischen dem Peroneus longus Muskel und dem Magen-Darm-Muskel zu befreien. Schneiden Sie unter die distale Naht und durch die distale Sehne des Peroneus longus, und verwenden Sie die Iriszange, um die Naht zu greifen und in Richtung Knie zu lenken, während Sie eine Schere verwenden, um das Xenograft vom darunter liegenden Muskelgewebe wegzuschneiden. Dann verwenden Sie eine Schere, um über die proximale Naht zu schneiden, um den Xenograft und Peroneus longus zu entfernen, und legen Sie das geerntete Exemplar auf ein kleines Stück Pappe.Pin das Gewebe so nah wie möglich an den Nähten, während sanft den Muskel dehnen, um sicherzustellen, dass die Faserausrichtung während des Snap-Freezing-Prozesses beibehalten wird. Wenn die Stifte sicher an Ort und Stelle sind, schieben Sie den Muskel die Stifte nach oben, so dass das Gewebe knapp über dem Karton ruht, und fangen Sie das Xenograft im vorgekühlten 2-Methylbutan für minus 80 Grad Celsius Lagerung einfrieren. Ein erfolgreiches Xenograft zeigt eine robuste Regeneration menschlicher Myofiber, die mit humanspezifischen Antikörpern identifiziert werden.Positive embryonale Myosinfärbung innerhalb eines Anteils von Myofibers deutet darauf hin, dass der Regenerationsprozess noch im Gange ist. Im Gegensatz dazu kann eine schlechte Operationstechnik oder eine unzureichende Probe zu einer schlechten Regeneration der Muskelfasern führen. Xenografts, die von einem Patienten durchgeführt wurden, bei dem eine idiopathische entzündliche Myopathie diagnostiziert wurde, zeigen eine moderate Anzahl regenerierter menschlicher Myofiber bei vier- und sechsmonatigen Sammlungen, und die embryonale Myosinfärbung bleibt sechs Monate an.Entzündliche Zellen sind auch innerhalb des Xenograft vorhanden, wie durch H und E Färbung beobachtet. Einzelne Myofibergrößen sind bei idiopathischen entzündungshemmenden Homöopathie-Xenografts zwischen vier und sechs Monaten ähnlich. Seltene Fasern mit einer Querschnittsfläche größer als 3, 500 Mikrometer im Quadrat werden innerhalb der Xenografts beobachtet, aber nicht in den idiopathischen entzündungshemmenden Myopathie-Biopsien, was darauf hindeutet, dass einige der Myofiber in den Xenografts sich zu einem Querschnittsbereich ähnlich in der Größe wie gesunde Myofiber regenerieren können.Die wichtigsten Teile dieses Verfahrens sind die Identifizierung aller Sehnen im Knöchel nach dem ersten Schnitt und das erfolgreiche Durchschneiden des Epimysiums. Die funktionelle Kompetenz der Xenografts kann beurteilt werden, indem einzelne Myofiber enzymatisch isoliert und Kalziumtransienten getestet oder evozierte Zwangsmessungen nach elektrischer Stimulation durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anwendung der chronische Stimulation kontraktilen Aktivität induzierten Ratte Skelettmuskulatur phänotypische Anpassungen zu studieren

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...