Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
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この作品は、筋炎協会とピーターバック財団によって支援されました。異種移植片の外科技術に関する専門知識と訓練を共有してくれたユアンファン・チャン博士に感謝します。

ヒト被験者からの研究標本の使用はすべて、参加者の権利と福祉を保護するためにジョンズ・ホプキンス機関審査委員会(IRB)によって承認されました。すべての動物実験は、ジョンズ・ホプキンス大学の施設動物管理・使用委員会(IACUC)によって、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所(NIH)ガイドに従って承認されました。雄NOD−Rag1ヌルIL2rγ(NRG)<...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

患者由来の異種移植片は、筋肉疾患をモデル化し、前臨床試験を行う革新的な方法です。骨格筋異種移植片を作成するためにここで説明する方法は、迅速、簡単、および再現性があります。一方的な手術は15~25分、または30~40分で両側手術が可能です。両側異種移植片は、追加の実験的柔軟性を提供することができます。例えば、研究者は、一方の異種移植片の局所的な治療を行うことができ...

臨床試験を受けているすべての薬剤開発プログラムのわずか13.8%が成功し、承認された治療法1につながることが報告されています。この成功率は、以前に報告された10.4%よりも高いですが、まだ改善の余地があります。臨床試験の成功率を高めるための1つのアプローチは、前臨床研究で使用される実験室モデルを改善することです。食品医薬品局(FDA)は、第1相臨床試験の前に治療効果を示し、毒性を評価するために動物研究を必要とします。しかし、動物実験と臨床試験3の間の治療結果には、しばしば限られた一致がある。さらに、前臨床動物研究の必要性は、受け入れられた動物モデルを欠いている疾患の治療開発のための克服不可能な障壁であり、これはしばしば稀または散発性疾患の場合である。
ヒト疾患をモデル化する1つの方法は、ヒト組織を免疫不全マウスに移植して異種移植片を生成することである。異種移植片モデルには3つの主要な利点があります:まず、他の動物モデルでは再現できない可能性のあるヒト疾患に存在する複雑な遺伝的およびエピジェネティックな異常を要約することができます。第二に、異種移植片は、患者のサンプルが利用可能な場合、希少または散発性疾患をモデル化するために使用することができる。第三に、異種移植片は、生体内の完全な内で疾患をモデル化する。これらの理由から、異種移植片モデルにおける治療効果の結果は、患者の試験に翻訳する可能性が高いと仮定する。ヒト腫瘍異種移植片は、多発性骨髄腫を含む一般的な癌の治療法の開発に既に成功しており、個々の患者に対する個別化療法4、5、6、 7.
最近、異種移植片は、ヒト筋疾患8のモデルを開発するために使用されている。このモデルでは、ヒト筋肉生検標本を免疫不全NRGマウスの後肢に移植し、異種移植片を形成する。移植されたヒト筋線維は死ぬが、異種移植片に存在するヒト筋肉幹細胞は、その後、生着したヒト基底ラミナを再び生人口する新しいヒト筋線維に拡大して分化する。したがって、これらの異種移植片中の再生されたミオ繊維は完全にヒトであり、マウス宿主によって自発的に可逆化され、インビナー化される。重要なことに、マウスに移植された筋組織筋ジストロフィー(FSHD)患者の筋肉組織は、ヒト疾患の主要な特徴、すなわちDUX4転写因子8の発現を要約する。FSHDは、正常な筋肉組織9、10でエピジェネティックに沈黙しているDUX4の過剰発現によって引き起こされる。FSHD異種移植片モデルでは、DUX4特異的モルフォリノによる治療は、DUX4発現および機能を正常に抑圧することが示されており、FSHD患者11に対する潜在的な治療選択肢となりうる。これらの結果は、ヒト筋異種移植片がヒト筋肉疾患をモデル化し、マウスの潜在的な治療法をテストする新しいアプローチであることを示している。ここでは、免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片を作成する外科的方法を詳細に説明する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

動物実験で観察される治療効果は、多くの場合、臨床試験で要約に失敗します。この問題は多面的ですが、この失敗の理由の1つは、不十分なラボモデルの使用です。従来の実験室生物における複雑なヒト疾患のモデル化は困難であるが、この問題はヒト異種移植片の研究を通じて回避することができる。ここで説明する外科的方法は、筋肉疾患をモデル化し、前臨床試験を行うために使用することができるヒト骨格筋異種移植片の作成を可能にする。機関レビュー委員会(IRB)承認プロトコルの下で、骨格筋標本は患者から取得され、その後NOD-Rag1 nullIL2rγヌル(NRG)宿主マウスに移植される。これらのマウスは、成熟したリンパ球を作ることができないため、移植研究のための理想的な宿主であり、したがって、細胞媒介性および体液性適応免疫応答を開発することができない。宿主マウスはイソルランで麻酔され、マウス脛骨前部および伸張デジコラム長い筋肉が除去される。人間の筋肉の一部は、空の脛骨コンパートメントに配置され、ペロンヌス長い筋肉の近位および遠位腱に縫合される。異種移植された筋肉は、マウス宿主によって自発的に血管化され、活性化され、前臨床研究のモデルとして機能し得るヒト筋肉を強く再生する。

Yuanfan Zhangらによって示されるように、この外科的プロトコルは、ヒト骨格筋異種移植片8を産生する簡単な方法である。再生された異種移植片は自発的にインナーベーター化し、機能的収縮性を示す。加えて、FSHD患者から移植された筋肉異種移植片は、FSHD患者8で観察された遺伝子発現の変化を要約する。
我々の経験では、コントロー...

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Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

複雑な人間の疾患は、従来の実験室モデルシステムでモデル化するのが難しい場合があります。ここでは、ヒト骨格筋生検を免疫不不十分マウスに移植することにより、ヒト筋疾患をモデル化する外科的アプローチについて述べた。

免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片の実行

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

このプロトコルは、筋肉疾患のモデル化および前臨床治療試験の実施に使用できるヒト骨格筋異種移植片を作成するために使用できるため、重要である。この異種移植モデルは、研究者がヒトの筋肉細胞生物学をよりよく理解し、稀または後天性筋肉疾患の新しいモデルを開発するために生体内でヒトの筋肉を研究することを可能にする。ヒト筋肉生検を得た後、筋肉培地を含む100×15ミリメートルのペトリ皿に標本を入れ、ステレオ顕微鏡と手術用はさみを使用して残りの筋膜または脂肪組織を除去する。筋肉生検を約7~3ミリメートルに解剖し、標本内に繊維が縦方向に配置されるように注意する。次に、解剖した筋肉を含むペトリ皿を氷の上に移し、合成の非吸収性縫合糸を70%エタノールの100ミリメートルのペトリ皿に入れます。生後8~12週でつま先ピンチに対する反応の欠如を確認した後、麻酔NOD-Rag-γマウスを麻酔し、免疫不全動物の目に軟膏を塗布し、トリマーを使用して脛取り前髪を足首から膝に上に引き出す。次いで、ポビドネヨウ素溶液および70%エタノールで手術部位を消毒する前に、露出した皮膚に1分間脱毛クリームを塗布する。ヒト組織を移植するには、まずマウス脚をテープダウンし、遠位腱に由来し、膝の下に終端する脛骨前部の上にまっすぐ切開を行う。鈍い解剖を使用して筋肉組織から皮膚を分離し、はさみを使用して脛表筋のエピミシウムを通して0.5ミリメートル未満の切開を行い、腱から始まり、膝で終わる。脛指前部の遠位腱を切断した後、虹彩鉗子で腱をつかみ、筋肉を膝に向かって引き上げる。次に、伸長体長間の遠位腱を切り、伸長体長膜を膝に向かって引き上げる。骨蓋長筋の近位腱が見えたら、伸長体の長体龍と脛骨前部をはさみで取り除きます。PBSで濡れた外科的ワイプを使用して、止まりが達成されるまでわずかな圧力を加え、近位ペローヌス腱を通して縫合糸を通し、腱の両側に約1.5インチの糸を残します。2手の外科的正方形の結び目の前半を締め付けずに円を形成し、異種移植片を円に入れ、ループを締めて移植片組織を固定します。四角結び目の残りの半分を完了して、異種移植片を近位腱の長膜に縫合し、遠位腱を通して縫合糸を通して遠位腱で正方形の結び目のテクニックを繰り返します。移植片の両端が固定されたら、異種移植筋肉の上に皮膚を引っ張り、外科的な接着剤で切開を密封し、接着剤の上に2〜3つの外科的ステープルを置く。次に、マウスを加熱されたパッドの清潔なケージに入れ、完全な再発まで監視します。手術後4~6ヶ月後、ゼノグラフト収穫の少なくとも30分間、ドライアイスの箱に200ミリリットルの2-メチルブタンを含む覆われたビーカーを入れる。2-メチルブタンが冷却されたら、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認し、トリマーと脱毛クリームで足首から膝に脛表の前部を覆う髪を取り除きます。異種移植片を所定の位置に保持する縫合糸は、皮膚を通して観察されるべきである。脚をテープで固定し、両縫合糸が発覚するまではさみと虹彩鉗子を使って異種移植片の上に皮膚を開きます。メスを使って異種移植片と脛診の間を切断し、異種移植片の片側を解放してから、百腸筋と胃腸筋の間で切断する。遠位縫合糸の下と頸部の遠位腱を通して切り、虹彩鉗子を使用して縫合糸を膝に向かってつかみ、そらしながら、はさみを使用して外異移植片を根底にある筋肉組織から切り離します。次に、ハサミを使用して近位縫合糸の上に切り取り、異種移植片とペロネウスの龍を取り除き、収穫した標本を小さな段ボールの上に置きます。筋肉を優しく伸ばしながら縫合糸にできるだけ近い組織を固定し、スナップ凍結プロセス中に繊維配向が維持されるようにします。ピンがしっかりと所定の位置にある場合は、筋肉をピンの上にスライドさせて組織が段ボールのすぐ上に置き、事前に冷却された2-メチルブタンの異種移植片をマイナス80°Cのストレージにスナップします。正常な異種移植片は、ヒト特異的抗体で同定されたヒト筋繊維の強い再生を示す。筋線維の割合内での陽性胚性ミオシン染色は、再生プロセスがまだ進行中であることを示している。対照的に、手術技術が不十分であったり、不十分な標本が筋線維の再生不良を引き起こし得る。特発性炎症性筋腫と診断された患者から行われた異種移植片は、4ヶ月および6ヶ月のコレクションで適度な数の再生ヒト筋線維を示し、胚性筋シン染色は6ヶ月で持続する。炎症性細胞は、異種移植片内にも存在し、HおよびE染色によって観察される。個々の筋繊維サイズは、特発性炎症性筋症異種移植片において4ヶ月から6ヶ月の間で類似している。3,500マイクロメートル平方メートルを超える断面面積を示す稀な繊維は、異種移植片内では観察されるが、特発性炎症性筋腫性生検では観察されず、異種移植片の筋繊維の一部が健康な筋繊維の大きさと同様の断面領域まで再生できることを示している。この手順の最も重要な部分は、最初の切開が行われ、正常にエピミシウムを切断した後、足首のすべての腱を識別することです。異種移植片の機能的能力は、単一のミオファイバーを酵素的に単離し、カルシウム過渡症を試験するか、または電気刺激に続いて誘発された強制測定を行うことによって評価することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...