Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av The myositt Association og Peter Buck Foundation. Vi vil gjerne takke Dr. Yuanfan Zhang for å dele sin ekspertise og opplæring i xenograft kirurgisk teknikk.

All bruk av forsknings prøver fra forsøkspersoner ble godkjent av Johns Hopkins institusjonelle Review Board (IRB) for å beskytte rettighetene og velferden til deltakerne. Alle dyr eksperimenter ble godkjent av Johns Hopkins University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) i samsvar med National Institutes of Health (NIH) guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr. Mann NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) vert mus (8-12 uker gammel) brukes til å utfør...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Pasient-avledet xenotransplantater er en innovativ måte å modellere muskel sykdom og gjennomføre prekliniske studier. Metoden er beskrevet her for å lage skjelettlidelser muskel xenotransplantater er rask, grei, og reproduserbar. Ensidige operasjoner kan utføres i 15 til 25 minutter, eller bilateralt i 30 til 40 minutter. Bilaterale xenotransplantater kan gi ekstra eksperimentell fleksibilitet. For eksempel kan forskerne utføre lokaliserte behandling av en xenograft, med den andre venstre som en kontroll. NRG-mus e...

Det har blitt rapportert at bare 13,8% av alle narkotika utviklingsprogrammer gjennomgår kliniske studier er vellykket og føre til godkjent behandling1. Selv om denne suksessen rate er høyere enn 10,4% tidligere rapportert2, er det fortsatt betydelige rom for forbedring. En tilnærming for å øke suksessraten for kliniske studier er å forbedre laboratorie modeller som brukes i prekliniske forskning. Food and Drug Administration (FDA) krever dyrestudier for å vise behandlingseffekt og vurdere toksisitet før fase 1-kliniske studier. Det er imidlertid ofte begrenset overensstemmelse i behandlingsresultatene mellom dyrestudier og kliniske studier3. I tillegg, behovet for prekliniske dyrestudier kan være en umulig barriere for terapeutisk utvikling i sykdommer som mangler en akseptert dyremodell, som ofte er tilfelle for sjeldne eller sporadiske sykdommer.
En måte å modellere menneskelig sykdom er ved å transplantere menneskelig vev i immunodeficient mus for å generere xenotransplantater. Det er tre viktige fordeler ved xenograft modeller: for det første kan de recapitulate de komplekse genetiske og epigenetic unormalt som finnes i menneskelig sykdom som kanskje aldri kan reproduseres i andre dyremodeller. For det andre kan xenotransplantater brukes til å modellere sjeldne eller sporadiske sykdommer hvis pasientprøvene er tilgjengelige. For det tredje, xenotransplantater modellere sykdommen innenfor et komplett in vivo-system. Av disse grunner hypothesize vi at behandlingseffekten resulterer i xenograft modeller er mer sannsynlig å oversette til studier hos pasienter. Human svulst xenotransplantater har allerede blitt utnyttet til å utvikle behandlinger for vanlige kreftformer, inkludert flere myelom, samt personlig behandling for individuelle pasienter4,5,6, 7i.
Nylig har xenotransplantater blitt brukt til å utvikle en modell av menneskelig muskel sykdom8. I denne modellen, menneskelige muskel biopsi prøvene er transplantert inn i hindlimbs av immunodeficient NRG mus å danne xenotransplantater. Det transplantert Human myofibers dø, bortsett fra Human muskelen stilk celler gave inne det xenograft heretter utfolde og skille ut i ny Human myofibers hvilke gjenbefolke det engrafted Human basal lamina. Derfor, den genereres myofibers i disse xenotransplantater er helt menneskelig og er spontant revascularized og innervated av musen verten. Viktigere, fascioscapulohumeral muskuløse dystrofi (FSHD) pasient muskel vev transplantert til mus viser viktige funksjoner i den menneskelige sykdommen, nemlig uttrykk for DUX4 transkripsjon faktor8. FSHD er forårsaket av overuttrykte av DUX4, som er epigenetically taushet i normal muskel vev9,10. I FSHD xenograft-modellen har behandling med en DUX4-spesifikk morpholino vist å kunne undertrykke DUX4 uttrykk og funksjon, og kan være et mulig terapeutisk alternativ for FSHD pasienter11. Disse resultatene viser at menneskelige muskel xenotransplantater er en ny tilnærming til modell menneskelige muskel sykdom og teste potensielle terapier i mus. Her beskriver vi i detalj den kirurgiske metoden for å skape menneskelige Skjelettmuskel xenotransplantater i immunodeficient mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Behandlingseffekter observert i dyrestudier ofte ikke sammenfattet i kliniske studier. Selv om dette problemet er mangesidig, er en årsak til denne feilen bruk av utilstrekkelige laboratorie modeller. Det er utfordrende å modellere komplekse menneskelige sykdommer i tradisjonelle laboratorie organismer, men dette problemet kan omgås gjennom studiet av menneskelig xenotransplantater. Den kirurgiske metoden vi beskriver her gir mulighet for etablering av menneskelige skjelettlidelser muskel xenotransplantater, som kan brukes til å modellere muskel sykdom og å gjennomføre prekliniske terapeutisk testing. Under en institusjonell gjennomgang Board (IRB)-godkjent protokoll, skjelettlidelser muskel prøver er ervervet fra pasienter og deretter transplantert inn NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) vert mus. Disse musene er ideelle verter for transplantasjon studier på grunn av deres manglende evne til å gjøre modne lymfocytter og er således ikke i stand til å utvikle celle-mediert og humoral adaptive immunresponser. Host mus er anesteserte med isoflurane, og musen tibialispuls fremre og extensor senen Longus musklene er fjernet. Et stykke av Human muskelen er så oppstilt inne det tom emballasje tibial avlukke og sutured å det proksimale og tømme sener av det peroneus Longus muskelen. Den xenografted muskelen er spontant vascularized og innervated av musen vert, noe som resulterer i robust generert menneskelig muskel som kan tjene som en modell for prekliniske studier.

Som demonstrert av Yuanfan Zhang et al., er denne kirurgiske protokollen en grei metode for å produsere menneskelige Skjelettmuskel xenotransplantater8. Generert xenotransplantater blir spontant innervated og viser funksjonell contractility. I tillegg, muskel xenografted fra FSHD pasienter viser endringer i genuttrykk observert hos FSHD pasienter8.
I vår erfaring, ca 7 av 8 xenotransplantater utført fra kontroll pasientens prøver vil vise vel...

Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Komplekse menneskelige sykdommer kan være utfordrende å modellere i tradisjonelle laboratorie modellsystemer. Her beskriver vi en kirurgisk tilnærming til modell menneskelige muskel sykdom gjennom transplantasjon av menneskelige skjelettlidelser muskel biopsier inn immunodeficient mus.

Utføre menneskelige Skjelettmuskel Xenotransplantater i Immunodeficient mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Denne protokollen er viktig fordi den kan brukes til å lage menneskelige skjelettmuskulatur xenografts, som kan brukes til å modellere muskelsykdom og å utføre preklinisk terapeutisk testing. Denne xenograft modellen tillater forskere å studere menneskelig muskel in vivo å bedre forstå menneskelig muskel celle biologi og å utvikle nye modeller for sjeldne eller ervervet muskelsykdommer. Etter å ha fått en menneskelig muskelbiopsi, legg prøven i en 100-by-15-millimeter petriskål som inneholder muskelmedium, og bruk et stereomikroskop og kirurgisk saks for å fjerne eventuelle gjenværende fascia eller fettvev.Disseker muskelbiopsien i omtrent syv ganger tre ganger tre millimeter stykker, og ta vare på at fibrene er ordnet langsgående i prøven. Deretter overfører du petriskålen som inneholder den dissekerte muskelen på is, og plasserer syntetiske, ikke-absorberbare suturer i en 100-by-15-millimeter petriskål på 70% etanol. Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme i en åtte til 12 uker gammel, bedøvet NOD-Rag-gamma mus, bruke salve på immunsvikt dyr øyne, og bruke en trimmer for å fjerne håret overliggende tibialis fremre fra ankelen til kneet.Deretter påfør hårfjerningskrem på eksponert hud i ett minutt før desinfiserer operasjonsstedet med povidon-jodoppløsning og 70% etanol. For å pode det menneskelige vevet, først tape ned musebenet, og gjøre et rett snitt over tibialis fremre opprinnelse på distale sener og avslutte under kneet. Bruk sløv disseksjon for å skille huden fra muskelvevet, og bruk saks for å lage et mindre enn 0,5 millimeter snitt gjennom epimysium av tibialis fremre muskel, starter på senen og slutter på kneet.Etter å ha kuttet den distale senen av tibialis fremre, ta tak i senen med iris tang, og trekk muskelen opp mot kneet. Deretter kutter du den distale senen av extensor digitorum longus, og trekker extensor digitorum longus opp mot kneet. Når den proksimale senen av peroneus longus muskelen er synlig, fjern extensor digitorum longus og tibialis fremre med saksen.Bruk en kirurgisk tørk våt med PBS for å bruke lite trykk til hemostase er oppnådd, og tre en sutur gjennom den proksimale peroneus longus senen, og la en ca 1,5-tommers stykke tråd på hver side av senen. Gjør den første halvdelen av en tohånds kirurgisk firkant knute uten å stramme for å danne en sirkel, og plasser en xenograft i sirkelen, stramme løkken for å sikre graftvevet. Fullfør den andre halvdelen av firkantede knuten for å suturere xenograften til den proksimale senen på peroneus longus, og tre suturen gjennom den distale peroneus longus-senen for å gjenta firkantede knuteteknikken på den distale senen.Når begge ender av transplantatet er sikret, trekk huden over xenografted muskelen, forsegle snittet med kirurgisk lim, og plasser to til tre kirurgiske stifter over limet. Deretter plasserer du musen i et rent bur på en oppvarmet pute med overvåking til full recumbency. Fire til seks måneder etter operasjonen, plasser et dekket beger som inneholder 200 milliliter 2-metylbutan i en boks med tørris i minst 30 minutter før xenografthøsten.Når 2-metylbutan har avkjølt, bekrefter du mangel på respons på tåklemmen, og fjern håret overliggende tibialis fremre fra ankelen til kneet med en trimmer og hårfjerningskrem. Suturene som holder xenograften på plass bør observeres gjennom huden. Fest benet med tape, og bruk saks og iris tang for å åpne huden over xenograft til begge suturene er avdekket.Bruk en skalpell til å kutte mellom xenograft og tibia å frigjøre den ene siden av xenograft før du kutter mellom peroneus longus muskel og gastrocnemius muskelen. Klipp under distal sutur og gjennom den distale senen på peroneus longus, og bruk iris-tangen til å gripe og avlede suturen mot kneet mens du bruker saks til å kutte xenograften bort fra det underliggende muskelvevet. Deretter bruker du saks til å kutte over den proksimale suturen for å fjerne xenograft og peroneus longus, og legg den høstede prøven på et lite stykke papp.Pin vevet så nær suturene som mulig mens forsiktig strekke muskelen for å sikre at fiber orientering vil bli opprettholdt under snap-frysing prosessen. Når pinnene er sikkert på plass, skyv muskelen opp pinnene slik at vevet hviler like over papp, og snap fryse xenograft i pre-avkjølt 2-metylbutan for minus 80-graders Celsius lagring. En vellykket xenograft demonstrerer en robust regenerering av menneskelige myofibers som identifisert med menneskespesifikke antistoffer.Positiv embryonal myosinfarging innenfor en andel av myofibers indikerer at regenereringsprosessen fortsatt pågår. I motsetning kan dårlig kirurgisk teknikk eller en utilstrekkelig prøve føre til dårlig regenerering av muskelfibrene. Xenografts utført fra en pasient diagnostisert med en idiopatisk inflammatorisk myopati viser moderate antall regenererte menneskelige myofibers på fire og seks måneders samlinger, og embryonal myosinfarging vedvarer etter seks måneder.Inflammatoriske celler er også tilstede i xenograft, som observert av H og E farging. Individuelle myofiberstørrelser er like mellom fire og seks måneder i idiopatisk inflammatorisk myopati xenografts. Sjeldne fibre som viser et tverrsnittsområde større enn 3, 500 mikrometer kvadrert observeres innenfor xenograftene, men ikke i idiopatisk inflammatorisk myopati biopsier, noe som indikerer at noen av myofibers i xenograftene kan regenerere til et tverrsnittsområde som ligner på sunne myofibers.De viktigste delene av denne prosedyren er å identifisere alle sener i ankelen etter at det første snittet er gjort og vellykket kutte gjennom epimysium. Den funksjonelle kompetansen til xenograftene kan vurderes ved å isolere enkelt myofibers og teste kalsiumtransienter eller ved å utføre fremkalte tvangsmålinger etter elektrisk stimulering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Bruke Isolert Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Mikro respirasjonsmålinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse av kronisk stimulering å studere kontraktile aktivitet-indusert rotte Skjelettmuskel fenotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolasjon, kultur, karakterisering, og differensiering av Human Muscle stamceller fra skjelettmuskelen biopsi prosedyre

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolering og differensiering av primær Myoblasts fra mus skjelettlidelser Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...