Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Associação de myositis e pela Fundação de Peter Buck. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Yuanfan Zhang por compartilhar sua expertise e treinamento na técnica cirúrgica do xenograft.

Todo o uso de espécimes de pesquisa de sujeitos humanos foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional (IRB) da Johns Hopkins para proteger os direitos e o bem-estar dos participantes. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC), de acordo com o guia nacional de saúde (NIH) para o cuidado e uso de animais de laboratório. Macho NOD-Rag1NULLIL2rγNULL (NRG) ca...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Os xenoenxertos derivados do paciente são uma forma inovadora de modelar a doença muscular e realizar estudos pré-clínicos. O método descrito aqui para criar xenoenxertos do músculo esqueletal é rápido, direto, e reprodutível. Cirurgias unilaterais podem ser realizadas em 15 a 25 minutos, ou bilateralmente em 30 a 40 minutos. Os xenoenxertos bilaterais podem fornecer flexibilidade experimental adicional. Por exemplo, os pesquisadores podem realizar o tratamento localizado de um Xenoenxerto, com a outra esquerda ...

Tem sido relatado que apenas 13,8% de todos os programas de desenvolvimento de medicamentos submetidos a ensaios clínicos são bem-sucedidos e levam a terapias aprovadas1. Quando esta taxa de sucesso for mais elevada do que os 10,4% relatados previamente2, há ainda uma sala significativa para a melhoria. Uma abordagem para aumentar a taxa de sucesso dos ensaios clínicos é melhorar os modelos laboratoriais utilizados na investigação pré-clínica. A administração de alimentos e drogas (FDA) requer estudos em animais para demonstrar a eficácia do tratamento e avaliar a toxicidade antes dos ensaios clínicos de fase 1. No entanto, muitas vezes há concordância limitada nos desfechos de tratamento entre estudos em animais e ensaios clínicos3. Além disso, a necessidade de estudos pré-clínicos em animais pode ser uma barreira intransponível para o desenvolvimento terapêutico em doenças que não têm um modelo animal aceito, o que geralmente é o caso de doenças raras ou esporádicas.
Uma maneira de modelar a doença humana é transplantar o tecido humano em camundongos imunodeficientes para gerar xenoenxertos. Existem três principais vantagens para os modelos de Xenoenxerto: primeiro, eles podem recapitular as complexas anormalidades genéticas e epigenéticas que existem na doença humana que podem nunca ser reprodutíveis em outros modelos animais. Em segundo, os xenoenxertos podem ser usados para modelar doenças raras ou esporádicas se as amostras do paciente estiverem disponíveis. Terceiro, os xenoenxertos modelam a doença dentro de um sistema completo in vivo. Por estas razões, nós supor que os resultados da eficácia do tratamento em modelos do xenograft são mais prováveis traduzir aos testes nos pacientes. Os xenoenxertos de tumores humanos já foram utilizados com sucesso para desenvolver tratamentos para cânceres comuns, incluindo mielomamúltiplo, bemcomo terapias personalizadas para pacientes individuais4,5,6, o 7.
Recentemente, os xenoenxertos têm sido usados para desenvolver um modelo de doença muscular humana8. Neste modelo, os espécimes humanos da biópsia do músculo são transplantados nos hindmembros de ratos immunodeficientes de NRG para dar forma a xenoenxertos. Os myofibers humanos transplantados morrem, mas as pilhas de haste humanas do músculo atuais no xenograft expandem subseqüentemente e diferenciam-se em myofibers humanos novos que repovoam o lamina básico humano enxertado. Conseqüentemente, os myofibers regenerados nestes xenoenxertos são inteiramente humanos e são revascularizados espontâneamente e inervado pelo anfitrião do rato. Importante, o tecido muscular do paciente da distrofia muscular fascioscapulohumeral (FSHD) transplantado em ratos recapitula características chaves da doença humana, a saber expressão do fator8da transcrição DUX4 . A FSHD é causada pela superexpressão de DUX4, que é epigeneticamente silenciada no tecido muscular normal9,10. No modelo de FSHD xenograft, o tratamento com um morfolino DUX4-specific foi mostrado para reprisificar com sucesso DUX4 expressão e função, e pode ser uma opção terapêutica potencial para pacientes de FSHD11. Estes resultados demonstram que os xenoenxertos do músculo humano são uma aproximação nova para modelar a doença do músculo humano e para testar terapias potenciais nos ratos. Aqui, nós descrevemos em detalhe o método cirúrgico para criar xenoenxertos humanos do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Os efeitos do tratamento observados em estudos em animais muitas vezes não conseguem ser recapitulados em ensaios clínicos. Embora esse problema seja multifacetado, uma razão para essa falha é o uso de modelos laboratoriais inadequados. É desafiador modelar doenças humanas complexas em organismos laboratoriais tradicionais, mas esta questão pode ser contornada através do estudo de xenoenxertos humanos. O método cirúrgico que descrevemos aqui permite a criação de xenoenxertos de músculo esquelético humano, que podem ser usados para modelar a doença muscular e realizar testes terapêuticos pré-clínicos. um Conselho de revisão institucional (IRB)-protocolo aprovado, espécimes de músculo esquelético são adquiridos de pacientes e, em seguida, transplantados em NOD-Rag1NULLIL2rγNULL (NRG) hospedeiro camundongos. Esses camundongos são hospedeiros ideais para estudos de transplante devido à sua incapacidade de fazer linfócitos maduros e, portanto, não conseguem desenvolver respostas imunes adaptáveis mediadas por células e humorais. Camundongos hospedeiros são anestesiados com isoflurano, e os músculos do rato tibial anterior e extensor dos dedos longos são removidos. Uma parte do músculo humano é colocada então no compartimento tibial vazio e suturada aos tendões proximal e longe do ponto de origem do músculo do longo do peroneus. O músculo xenografado é espontaneamente vascularizado e inervado pelo hospedeiro do camundongo, resultando em músculo humano regenerado de forma robusta que pode servir de modelo para estudos pré-clínicos.

Como demonstrado por Yuanfan Zhang et al., este protocolo cirúrgico é um método direto para produzir xenoenxertos de músculo esquelético humano8. Xenoenxertos regenerados tornam-se espontaneamente inervado e exibem contratilidade funcional. Além, o músculo xenografados dos pacientes de FSHD recapitula mudanças na expressão de gene observadas em pacientes de FSHD8.
Em nossa experiência, aproximadamente 7 de 8 xenoenxertos executados dos ...

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Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Doenças humanas complexas podem ser desafiadoras para modelar em sistemas de modelos laboratoriais tradicionais. Aqui, nós descrevemos uma aproximação cirúrgica para modelar a doença do músculo humano com a transplantação de biópsias humanas do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Este protocolo é significativo porque pode ser usado para criar xenoenxertos musculares esqueléticos humanos, que podem ser usados para modelar doenças musculares e realizar testes terapêuticos pré-clínicos. Este modelo de xenoenxerto permite que os pesquisadores estudem os músculos humanos in vivo para entender melhor a biologia celular muscular humana e desenvolver novos modelos para doenças musculares raras ou adquiridas. Após a obtenção de uma biópsia muscular humana, coloque a amostra em uma placa de Petri de 100 por 15 milímetros contendo meio muscular, e use um microscópio estéreo e uma tesoura cirúrgica para remover qualquer fáscia restante ou tecido gorduroso.Disseque a biópsia muscular em pedaços de aproximadamente sete por três por três milímetros, tomando cuidado para que as fibras sejam dispostas longitudinalmente dentro da amostra. Em seguida, transfira a placa de Petri contendo o músculo dissecado no gelo, e coloque suturas sintéticas e não absorvíveis em uma placa petri de 100 por 15 milímetros de 70% de etanol. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um rato de oito a 12 semanas de idade, anestesiado NOD-Rag-gamma, aplique pomada aos olhos do animal imunodeficente, e use um aparador para remover o cabelo sobreposto do tibialis anterior do tornozelo ao joelho.Em seguida, aplique creme depilatório na pele exposta por um minuto antes de desinfetar o local cirúrgico com solução povidone-iodo e 70% de etanol. Para enxertar o tecido humano, primeiro fita para baixo da perna do rato, e fazer uma incisão reta sobre a tibialis anterior originária dos tendões distais e terminando abaixo do joelho. Use dissecção sem corte para separar a pele do tecido muscular, e use uma tesoura para fazer uma incisão de menos de 0,5 milímetros através do epimísio do músculo tibialis anterior, começando no tendão e terminando no joelho.Depois de cortar o tendão distal do tibial anterior, segure o tendão com fórceps de íris, e puxe o músculo para cima em direção ao joelho. Em seguida, corte o tendão distal do extensor digitorum longus, e puxe o extensor digitorum longus até o joelho. Uma vez visível o tendão proximal do músculo peroneus longus, remova o extensor digitorum longus e o tibialis anterior com a tesoura.Use um lenço cirúrgico molhado com PBS para aplicar uma leve pressão até que a hemostasia seja alcançada, e enfie uma sutura através do tendão peroneus proximal peroneus longus, deixando um pedaço de linha de aproximadamente 1,5 polegadas em ambos os lados do tendão. Faça a primeira metade de um nó quadrado cirúrgico de duas mãos sem apertar para formar um círculo, e coloque um xenoenxerto no círculo, apertando o laço para fixar o tecido do enxerto. Complete a outra metade do nó quadrado para suturar o xenoenxerto no tendão proximal do peroneus longus, e enfie a sutura através do tendão peroneus longo distal para repetir a técnica do nó quadrado no tendão distal.Quando ambas as extremidades do enxerto tiverem sido fixadas, puxe a pele sobre o músculo xenoenxerado, sele a incisão com cola cirúrgica e coloque de dois a três grampos cirúrgicos sobre a cola. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada aquecida com monitoramento até a recumbência total. Quatro a seis meses após a cirurgia, coloque um béquer coberto contendo 200 mililitros de 2-metilbutano em uma caixa de gelo seco por pelo menos 30 minutos antes da colheita de xenoenxerto.Quando o 2-metilbutano tiver esfriado, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé e remova o cabelo sobreominando a tibialis anterior do tornozelo para o joelho com um aparador e creme depilatório. As suturas que seguram o xenoenxerto no lugar devem ser observadas através da pele. Segure a perna com fita adesiva, e use tesouras e fórceps de íris para abrir a pele sobre o xenoenxerto até que ambas as suturas sejam descobertas.Use um bisturi para cortar entre o xenoenxerto e a tíbia para libertar um lado do xenoenxerto antes de cortar entre o músculo peroneus longus e o músculo gastrocnemius. Corte abaixo da sutura distal e através do tendão distal do peroneus longus, e use os fórceps de íris para agarrar e desviar a sutura em direção ao joelho enquanto usa uma tesoura para cortar o xenoenxerto longe do tecido muscular subjacente. Em seguida, use uma tesoura para cortar acima da sutura proximal para remover o xenoenxerto e peroneus longus, e coloque o espécime colhido em um pequeno pedaço de papelão.Fixar o tecido o mais próximo possível das suturas enquanto estica suavemente o músculo para garantir que a orientação das fibras seja mantida durante o processo de congelamento de snap. Quando os pinos estiverem firmemente no lugar, deslize o músculo até os pinos para que o tecido fique logo acima do papelão, e congele o xenoenxerto no pré-resfriado 2-metilbutano para menos 80 graus Celsius armazenamento. Um xenoenxerto bem sucedido demonstra uma regeneração robusta de miofibers humanos como identificado com anticorpos específicos do homem.A coloração positiva de minosina embrionária dentro de uma proporção de miofibers indica que o processo de regeneração ainda está em curso. Em contraste, a má técnica cirúrgica ou uma amostra inadequada podem levar a uma má regeneração das fibras musculares. Xenoenxertos realizados a partir de um paciente diagnosticado com uma miopatia inflamatória idiopática apresentam um número moderado de miofibers humanos regenerados em coleções de quatro e seis meses, e a coloração de minosina embrionária persiste aos seis meses.As células inflamatórias também estão presentes dentro do xenoenxerto, como observado pelas manchas de H e E. Os tamanhos individuais de miofibra são semelhantes entre quatro e seis meses em xenoenxertos de miopatia inflamatória idiopática. Fibras raras que mostram uma área transversal superior a 3.500 micrômetros ao quadrado são observadas dentro dos xenoenxertos, mas não nas biópsias de miopatia inflamatória idiopática, indicando que alguns dos miofibers nos xenoenxertos podem se regenerar para uma área transversal semelhante em tamanho aos miofibers saudáveis.As partes mais importantes deste procedimento são identificar todos os tendões do tornozelo após a incisão inicial ser feita e cortar com sucesso através do epimísio. A competência funcional dos xenoenxertos pode ser avaliada por meio da isolação enzimática de miofibers únicos e testando transitórios de cálcio ou realizando medições forçadas evocadas após estimulação elétrica.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

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Biologia do Desenvolvimento

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Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

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Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

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Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

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Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...