Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Эта работа была поддержана Ассоциацией миозита и Фондом Питера Бака. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Yuanfan Чжан для обмена своим опытом и обучение в ксенотрансплантат хирургической техники.

Все использование научных образцов из человеческих субъектов было одобрено Советом по институциональному обзору Джона Хопкинса (IRB) для защиты прав и благополучия участников. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Джонса Х...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Кшенотрансплантаты, полученные из пациента, являются инновационным способом моделирования заболеваний мышц и проведения доклинических исследований. Метод, описанный здесь для создания скелетных мышечных ксенотрансплантатов, является быстрым, простым и воспроизводимым. Односторонн...

Было сообщено, что только 13,8% всех программ разработки лекарственных средств, проходящих клинические испытания являются успешными и привести к утвержденным терапии1. Хотя этот показатель успеха выше, чем 10,4% ранее сообщалось2, есть еще значительные возможности для совершенствования. Одним из подходов к повышению успешности клинических испытаний является совершенствование лабораторных моделей, используемых в доклинических исследованиях. Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) требует проведения исследований на животных, чтобы показать эффективность лечения и оценить токсичность до фазы 1 клинических испытаний. Тем не менее, часто ограничено согласование в исходах лечения между исследованиями на животных и клинических испытаний3. Кроме того, необходимость в доклинических исследованиях на животных может быть непреодолимым барьером для терапевтического развития при заболеваниях, в которых отсутствует принятая модель животных, что часто характерно для редких или спорадических заболеваний.
Один из способов моделирования человеческих заболеваний путем трансплантации человеческих тканей в иммунодефицитных мышей для создания ксенотрансплантатов. Есть три ключевых преимущества ксенотрансплантата модели: Во-первых, они могут резюмировать сложные генетические и эпигенетические аномалии, которые существуют в болезни человека, которые никогда не могут быть воспроизводимы в других животных моделей. Во-вторых, ксенотранспланты могут быть использованы для моделирования редких или спорадических заболеваний, если у пациента имеются образцы. В-третьих, ксенотранспланты моделируют болезнь в рамках полной системы in vivo. По этим причинам, мы предполагаем, что эффективность лечения приводит к ксенотрансплантат модели, скорее всего, перевести на испытания у пациентов. Ксенотранспланты опухоли человека уже успешно используются для разработки методов лечения распространенных видов рака, включая множественную миелому, а также персонализированные методы лечения для отдельных пациентов4,5,6, 7.
В последнее время, ксенотранспланты были использованы для разработки модели болезни человеческих мышц8. В этой модели, образцы биопсии мышц человека пересаживаются в задние конечности иммунодефицитных мышей NRG для формирования ксенотрансплантатов. Пересаженные человеческие миофибы умирают, но стволовые клетки человеческих мышц, присутствующие в ксенотрансплантате, впоследствии расширяются и дифференцируются в новые человеческие миофибы, которые заселяют привяженную человеческую базальную ламину. Таким образом, регенерированные миофибы в этих ксенотрансплантах полностью человеческие и спонтанно реваскуляризованы и иннерватированы хозяином мыши. Важно отметить, что фасциоскапуглогумеральная мышечная дистрофия (ФСХР) мышечной ткани пациента, пересаженная мышам, перезывает на мышей ключевые особенности болезни человека, а именно выражение фактора транскрипции DUX4 8. FSHD вызвано переэкспрессией DUX4, который эпигенетически заглушается в нормальной мышечной ткани9,10. В модели FSHD xenograft, лечение с DUX4-специфический морфолино было показано, успешно подавлять DUX4 выражение и функции, и может быть потенциальным терапевтическим вариантом для пациентов FSHD11. Эти результаты показывают, что человеческие мышцы ксенотрансплантатов являются новым подходом к модели человеческой мышечной болезни и проверить потенциальные методы лечения у мышей. Здесь мы подробно описываем хирургический метод создания ксенотрансплантатов скелетных мышц у иммунодефицитных мышей.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Эффекты лечения, наблюдаемые в исследованиях на животных, часто не подводятся в клинических испытаниях. Хотя эта проблема является многогранной, одной из причин этой неудачи является использование неадекватных лабораторных моделей. Смоделировать сложные заболевания человека в традиционных лабораторных организмах сложно, но этот вопрос можно обойти путем изучения ксенотрансплантатов. Хирургический метод, который мы описываем здесь, позволяет создать келетальные мышечные ксенотрансплантаты, которые могут быть использованы для моделирования мышечных заболеваний и проведения доклинических терапевтических испытаний. В соответствии с утвержденным Институциональным наблюдательным советом (IRB) протоколом, образцы скелетных мышц приобретаются у пациентов, а затем пересаживаются в НОД-Rag1nullIL2r null (NRG) хозяйских мышей. Эти мыши являются идеальными хозяевами для трансплантации исследований из-за их неспособности сделать зрелые лимфоциты и, таким образом, не в состоянии развивать клеточные опосредовано и гуморальные адаптивные иммунные реакции. Мышей-хозяев обезврежывают изофлюраном, а мышь tibialis передняя и разгибающая дигенорора длинные мышцы удаляются. Кусок человеческой мышцы затем помещается в пустой отсек tibial и зашивается на проксимальных и дистальных сухожилий peroneus longus мышцы. Ксенотрансплантная мышца спонтанно васкуляризована и иннерватируется хозяином мыши, что приводит к активному регенерированию человеческой мышцы, которая может служить моделью для доклинических исследований.

Как показал Yuanfan Чжан и др., этот хирургический протокол является простым методом для производства человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов8. Регенерированные ксенотранспланты становятся спонтанно иннерватированными и отображают функциональную контрактность. К?...

Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Сложные заболевания человека могут быть сложными для моделирования в традиционных системах лабораторных моделей. Здесь мы описываем хирургический подход к модели человеческой мышечной болезни путем трансплантации биопсии скелетных мышц человека на иммунодефицитных мышей.

Выполнение человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он может быть использован для создания человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов, которые могут быть использованы для моделирования мышечных заболеваний и для проведения доклинального терапевтического тестирования. Эта модель ксенотрансплантата позволяет исследователям изучать человеческие мышцы in vivo, чтобы лучше понять биологию мышечных клеток человека и разработать новые модели редких или приобретенных мышечных заболеваний. После получения биопсии мышц человека поместите образец в чашку Петри размером 100 на 15 миллиметров, содержащую мышечную среду, и используйте стерео микроскоп и хирургические ножницы для удаления оставшейся фасции или жировой ткани.Рассеките биопсию мышц примерно на три на три миллиметра, заботясь о том, чтобы волокна были расположены продольно внутри образца. Затем перенесите чашку Петри, содержащую расчлененную мышцу на лед, и поместите синтетические, неаспасимываемые швы в чашку Петри размером 100 на 15 миллиметров из 70% этанола. После подтверждения отсутствия ответа на щипать в 8-12-недельный, анестезированный NOD-Rag-гамма мыши, применять мазь на глазах иммунодефицитного животного, и использовать триммер, чтобы удалить волосы чрезмерно tibialis передней от лодыжки до колена.Затем нанесите депиляативный крем на обитаемую кожу в течение одной минуты, прежде чем дезинфицировать хирургическое отделение раствором пувидона-йода и 70%этанолом. Чтобы привить человеческую ткань, сначала лентой вниз мыши ногу, и сделать прямой разрез над голени, происходящих на дистальных сухожилий и прекращения ниже колена. Используйте тупое вскрытие, чтобы отделить кожу от мышечной ткани, и использовать ножницы, чтобы сделать менее чем 0,5-миллиметровый разрез через эпимизий передней мышцы голени, начиная с сухожилия и заканчивая коленом.После резки дистального сухожилия голени передней, схватить сухожилие с радужной оболочки миок, и тянуть мышцы вверх к колену. Далее, сократить дистальное сухожилие дитенсора digitorum longus, и вытащить дитенсор digitorum longus к колену. Как только проксимальное сухожилие мышцы peroneus longus видно, удалите дитенсор digitorum longus и tibialis передней с ножницами.Используйте хирургическую салфетку мокрой с PBS, чтобы применить небольшое давление, пока гемостаз не будет достигнут, и нить шва через проксимальный перон longus сухожилия, в результате чего примерно 1,5-дюймовый кусок нити по обе стороны сухожилия. Сделайте первую половину двух рук хирургического квадратного узла без затягивания, чтобы сформировать круг, и поместите ксенотрансплантат в круг, затягивая петлю, чтобы обезопасить трансплантатную ткань. Завершите другую половину квадратного узла, чтобы шов ксенотрансплантата проксимального сухожилия перонеус longus, и нить шва через дистальный peroneus longus сухожилия повторить технику квадратного узла на дистального сухожилия.Когда оба конца трансплантата были обеспечены, потяните кожу над ксенотрансплантированных мышц, печать разрез с хирургическим клеем, и место два-три хирургических скобы над клеем. Затем поместите мышь в чистую клетку на нагретую площадку с мониторингом до полного лежачих времени. Через четыре-шесть месяцев после операции поместите крытый стакан, содержащий 200 миллилитров 2-метилбутана, в коробку сухого льда в течение по крайней мере 30 минут до сбора ксенотрансплантата.Когда 2-метилбутан остынет, подтвердить отсутствие реакции на щепотку носа, и удалить волосы чрезмерно голени передней от лодыжки до колена с триммером и депилятивным кремом. Швы, держащие ксенотрансплантат на месте, следует наблюдать через кожу. Закрепте ногу лентой и используйте ножницы и щипцы радужной оболочки глаза, чтобы открыть кожу над ксенотрансплантом до тех пор, пока оба шва не будут обнаружены.Используйте скальпель, чтобы сократить между ксенотрансплантатом и голени, чтобы освободить одну сторону ксенотрансплантата перед резки между мышцей перонеуса longus и мышцы гастроконемиуса. Вырезать ниже дистального шва и через дистальное сухожилие peroneus longus, и использовать радужную оболочку миппы, чтобы схватить и отвлечь шв к колену при использовании ножниц, чтобы сократить ксенотрансплантат от основной мышечной ткани. Затем используйте ножницы, чтобы вырезать выше проксимального шва, чтобы удалить ксенотрансплантат и перонеус longus, и поместить собранный образец на небольшой кусок картона.Прикрепите ткань как можно ближе к швам, мягко растягивая мышцы, чтобы убедиться, что ориентация волокна будет поддерживаться во время процесса snap-freezing. Когда булавки надежно на месте, слайд мышцы вверх булавки так ткани лежит чуть выше картона, и оснастки заморозить ксенотрансплантат в предварительно охлажденных 2-метилбутан для минус 80 градусов по Цельсию хранения. Успешный ксенотрансплантат демонстрирует надежную регенерацию миофиберов человека, отождествляемых с специфическими для человека антителами.Положительные эмбриональные окрашивания миозин в пропорции миофиберов указывает на то, что процесс регенерации все еще продолжается. В отличие от этого, плохая хирургическая техника или неадекватный образец может привести к плохой регенерации мышечных волокон. Ксенотрансплантаты, выполняемые у пациента с диагнозом идиопатическая воспалительная миопатия, демонстрируют умеренное количество регенерированных миофиберов человека в четырех- и шестимесячных коллекциях, а эмбриональное окрашивание миозином сохраняется в течение шести месяцев.Воспалительные клетки также присутствуют в ксенотрансплантате, как это наблюдается H и E окрашивания. Индивидуальные размеры миофибера похожи между четырьмя и шестью месяцами при идиопатических воспалительных ксенотрансплантатах. Редкие волокна, показывающие поперечную площадь более 3, 500 микрометров в квадрате наблюдаются в ксенотрансплантатах, но не в идиопатической воспалительной биопсии миопатии, что указывает на то, что некоторые из миофиберов в ксенотрансплантатах могут регенерировать к поперечной области, похожей по размеру на здоровые миофиберы.Наиболее важными частями этой процедуры являются выявление всех сухожилий в лодыжке после первоначального разреза и успешно резки через эпимизий. Функциональную компетентность ксенотрансплантатов можно оценить, опоясывая одиночные миофиберы и проверяя преходящие кальция или выполняя вызванные принудительные измерения после электрической стимуляции.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Оценка травмы индуцированного старения и в естественных условиях перепрограммирования в скелетных мышцах

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Применение хронической стимуляции для изучения сократительной активности индуцированной крыса скелетных мышц Фенотипическая адаптация

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Изоляция и дифференциация первичных миобластов от мышь скелетных мышц высасывания

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...