Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Myositis y la Fundación Peter Buck. Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Yuanfan Zhang por compartir su experiencia y formación en la técnica quirúrgica de xenoinjerto.

Todo uso de especímenes de investigación de sujetos humanos fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Johns Hopkins (IRB) para proteger los derechos y el bienestar de los participantes. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (IACUC) de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones host nulantes (NRG) no-varones NOD-Rag1...

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	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Los xenoinjertos derivados del paciente son una forma innovadora de modelar la enfermedad muscular y llevar a cabo estudios preclínicos. El método descrito aquí para crear xenoinjertos musculares esqueléticos es rápido, sencillo y reproducible. Las cirugías unilaterales se pueden realizar en 15 a 25 minutos, o bilateralmente en 30 a 40 minutos. Los xenoinjertos bilaterales pueden proporcionar flexibilidad experimental adicional. Por ejemplo, los investigadores pueden realizar un tratamiento localizado de un xenoinj...

Se ha informado que sólo 13.8% de todos los programas de desarrollo de fármacos sometidos a ensayos clínicos son exitosos y conducen a terapias aprobadas1. Si bien esta tasa de éxito es superior al 10,4% reportado anteriormente2, todavía hay un margen significativo de mejora. Un enfoque para aumentar la tasa de éxito de los ensayos clínicos es mejorar los modelos de laboratorio utilizados en la investigación preclínica. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) requiere estudios en animales para mostrar la eficacia del tratamiento y evaluar la toxicidad antes de los ensayos clínicos de fase 1. Sin embargo, a menudo hay una concordancia limitada en los resultados del tratamiento entre los estudios en animales y los ensayos clínicos3. Además, la necesidad de estudios preclínicos en animales puede ser una barrera insuperable para el desarrollo terapéutico en enfermedades que carecen de un modelo animal aceptado, que a menudo es el caso de enfermedades raras o esporádicas.
Una forma de modelar enfermedades humanas es trasplantando tejido humano en ratones inmunodeficientes para generar xenoinjertos. Hay tres ventajas clave para los modelos de xenoinjerto: en primer lugar, pueden recapitular las complejas anomalías genéticas y epigenéticas que existen en la enfermedad humana que pueden nunca ser reproducibles en otros modelos animales. En segundo lugar, los xenoinjertos se pueden utilizar para modelar enfermedades raras o esporádicas si hay muestras de pacientes disponibles. En tercer lugar, los xenoinjertos modelan la enfermedad dentro de un sistema in vivo completo. Por estas razones, hipotetizar que los resultados de eficacia del tratamiento en modelos de xenoinjerto son más propensos a traducirse en ensayos en pacientes. Los xenoinjertos tumorales humanos ya se han utilizado con éxito para desarrollar tratamientos para cánceres comunes, incluyendo mieloma múltiple, así como terapias personalizadas para pacientes individuales4,5,6, 7.
Recientemente, xenoinjertos se han utilizado para desarrollar un modelo de enfermedad muscular humana8. En este modelo, las muestras de biopsia muscular humana se trasplantan en las extremidades posteriores de ratones NRG inmunodeficientes para formar xenoinjertos. Las miofibers humanas trasplantadas mueren, pero las células madre musculares humanas presentes en el xenoinjerto posteriormente se expanden y diferencian en nuevas miofibers humanas que repoblan la lámina basal humana injertada. Por lo tanto, las miofibers regeneradas en estos xenoinjertos son completamente humanas y son espontáneamente revascularizadas e inervadas por el huésped del ratón. Es importante destacar que el tejido muscular del paciente trasplantado en ratones recapitula las características clave de la enfermedad humana, a saber, la expresión del factor de transcripción DUX4 8. La FSHD es causada por la sobreexpresión de DUX4, que se silencia epigenéticamente en el tejido muscular normal9,10. En el modelo de xenoinjerto FSHD, se ha demostrado que el tratamiento con un mortorfino específico de DUX4 reprime con éxito la expresión y la función de DUX4, y puede ser una opción terapéutica potencial para los pacientes con FSHD11. Estos resultados demuestran que los xenoinjertos musculares humanos son un nuevo enfoque para modelar la enfermedad muscular humana y probar posibles terapias en ratones. Aquí, describimos en detalle el método quirúrgico para crear xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Los efectos del tratamiento observados en estudios con animales a menudo no se recapitulan en ensayos clínicos. Si bien este problema es multifacético, una de las razones de este fallo es el uso de modelos de laboratorio inadecuados. Es difícil modelar enfermedades humanas complejas en organismos de laboratorio tradicionales, pero esta cuestión puede eludirse mediante el estudio de xenoinjertos humanos. El método quirúrgico que describimos aquí permite la creación de xenoinjertos musculares esqueléticos humanos, que se pueden utilizar para modelar la enfermedad muscular y para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas. Bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB), las muestras de músculo esquelético se adquieren de los pacientes y luego se trasplantan en ratones huésped NOD-Rag1nullIL2r. Estos ratones son huéspedes ideales para estudios de trasplante debido a su incapacidad para producir linfocitos maduros y, por lo tanto, son incapaces de desarrollar respuestas inmunitarias adaptativas mediadas por células y humorales. Los ratones huésped son anestesiados con isoflurano, y se eliminan los músculos del ratón tibialis anterior y digitorum longus extensor. Luego se coloca un pedazo de músculo humano en el compartimento tibial vacío y se sutura a los tendones proximales y distales del músculo peroneus longus. El músculo xenoinjerado es vascularizado e inervado espontáneamente por el huésped del ratón, lo que resulta en un músculo humano robusto mente regenerado que puede servir como modelo para estudios preclínicos.

Como lo demuestra Yuanfan Zhang et al., este protocolo quirúrgico es un método sencillo para producir xenoinjertos de músculo esquelético humano8. Los xenoinjertos regenerados se inerten espontáneamente y muestran contractilidad funcional. Además, el xenoinjerto muscular de pacientes con FSHD recapitula los cambios en la expresión génica observados en pacientes con FSHD8.
En nuestra experiencia, aproximadamente 7 de los 8 xenoinjertos rea...

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Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Las enfermedades humanas complejas pueden ser difíciles de modelar en los sistemas de modelos de laboratorio tradicionales. Aquí, describimos un enfoque quirúrgico para modelar la enfermedad muscular humana a través del trasplante de biopsias musculares esqueléticas humanas en ratones inmunodeficientes.

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para crear xenoinjertos musculares esqueléticos humanos, que se pueden utilizar para modelar la enfermedad muscular y para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas. Este modelo de xenoinjerto permite a los investigadores estudiar el músculo humano in vivo para entender mejor la biología de las células musculares humanas y desarrollar modelos novedosos para enfermedades musculares raras o adquiridas. Después de obtener una biopsia muscular humana, coloque la muestra en una placa Petri de 100 por 15 milímetros que contenga un medio muscular, y use un microscopio estéreo y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier fascia o tejido graso restante.Disecciona la biopsia muscular en trozos de aproximadamente siete por tres por tres milímetros, teniendo cuidado de que las fibras estén dispuestas longitudinalmente dentro de la muestra. A continuación, transfiera el plato de Petri que contiene el músculo diseccionado sobre hielo, y coloque suturas sintéticas no absorbibles en un plato Petri de 100 por 15 milímetros de 70% etanol. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón NOD-Rag-gamma anestesiado de ocho a 12 semanas de edad, aplique un ung ón en los ojos del animal inmunodeficient, y use una recortadora para eliminar el vello que hace sobreladura del tibialis anterior desde el tobillo hasta la rodilla.A continuación, aplicar crema depilatoria sobre la piel expuesta durante un minuto antes de desinfectar el sitio quirúrgico con solución de povidona-yodo y 70%etanol. Para injertar el tejido humano, primero cinta adhesiva por la pierna del ratón, y hacer una incisión recta sobre los tibialis anteriores originados en los tendones distales y terminando por debajo de la rodilla. Usa una disección contundente para separar la piel del tejido muscular, y usa tijeras para hacer una incisión de menos de 0,5 milímetros a través del epimysium del músculo anterior tibialis, comenzando en el tendón y terminando en la rodilla.Después de cortar el tendón distal del tibialis anterior, agarre el tendón con fórceps de iris, y tire del músculo hacia arriba hacia la rodilla. A continuación, corta el tendón distal del extensor digitorum longus, y tira del digitorum extensor largo hacia la rodilla. Una vez que el tendón proximal del músculo peroneus longus es visible, retire el digitorum longus extensor y el tibialis anterior con las tijeras.Use una toallita quirúrgica húmeda con PBS para aplicar una ligera presión hasta que se logre la hemostasia, y enhebrar una sutura a través del tendón peruso peroneus proximal, dejando un trozo de hilo de aproximadamente 1,5 pulgadas a cada lado del tendón. Haga la primera mitad de un nudo cuadrado quirúrgico de dos manos sin apretar para formar un círculo, y coloque un xenoinjerto en el círculo, apretando el lazo para asegurar el tejido del injerto. Completa la otra mitad del nudo cuadrado para suturar el xenoinjerto al tendón proximal del peroneus longus, y enhebra la sutura a través del tendón del peroneus longus distal para repetir la técnica del nudo cuadrado en el tendón distal.Cuando ambos extremos del injerto se hayan asegurado, tire de la piel sobre el músculo xenoinjertado, selle la incisión con pegamento quirúrgico y coloque de dos a tres grapas quirúrgicas sobre el pegamento. A continuación, coloque el ratón en una jaula limpia sobre una almohadilla calentada con monitoreo hasta la reclinación completa. De cuatro a seis meses después de la cirugía, coloque un vaso de precipitados cubierto que contenga 200 mililitros de 2-metilbutano en una caja de hielo seco durante al menos 30 minutos antes de la cosecha de xenoinjerto.Cuando el 2-metilbutano se ha enfriado, confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie, y eliminar el pelo que sobrevía el tibialis anterior desde el tobillo hasta la rodilla con un recortador y crema depilatoria. Las suturas que sostienen el xenoinjerto en su lugar deben observarse a través de la piel. Asegure la pierna con cinta adhesiva y use tijeras y fórceps de iris para abrir la piel sobre el xenoinjerto hasta que ambas suturas estén descubiertas.Usa un bisturí para cortar entre el xenoinjerto y la tibia para liberar un lado del xenoinjerto antes de cortar entre el músculo peroneus longus y el músculo gastrocnemius. Cortar por debajo de la sutura distal y a través del tendón distal del peroneus longus, y utilizar los fórceps del iris para agarrar y desviar la sutura hacia la rodilla mientras se utilizan tijeras para cortar el xenoinjerto lejos del tejido muscular subyacente. Luego, usa tijeras para cortar por encima de la sutura proximal para eliminar el xenoinjerto y el peroneus longus, y coloca el espécimen cosechado en un pequeño pedazo de cartón.Ancle el tejido lo más cerca posible de las suturas mientras estira suavemente el músculo para asegurarse de que la orientación de la fibra se mantendrá durante el proceso de congelación a presión. Cuando los pasadores estén bien en su lugar, deslice el músculo hacia arriba de los pasadores para que el tejido descanse justo por encima del cartón, y congele el xenoinjerto en el 2-metilbutano preenfriado para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius. Un xenoinjerto exitoso demuestra una regeneración robusta de miofibers humanos identificados con anticuerpos específicos para el ser humano.La tinción positiva de miosina embrionaria dentro de una proporción de miofibers indica que el proceso de regeneración todavía está en curso. Por el contrario, una mala técnica quirúrgica o una muestra inadecuada pueden conducir a una mala regeneración de las fibras musculares. Los xenoinjertos realizados a partir de un paciente diagnosticado con una miopatía inflamatoria idiopática presentan un número moderado de miofibras humanas regeneradas en colecciones de cuatro y seis meses, y la tinción de miosina embrionaria persiste a los seis meses.Las células inflamatorias también están presentes dentro del xenoinjerto, como se observa en la tinción H y E. Los tamaños individuales de miofiber son similares entre cuatro y seis meses en xenoinjertos de miopatía inflamatoria idiopática. Se observan fibras raras que muestran un área transversal superior a 3.500 micrómetros cuadrados dentro de los xenoinjertos, pero no en las biopsias de miopatía inflamatoria idiopática, lo que indica que algunas de las miofiberas de los xenografos pueden regenerarse a una zona transversal similar en tamaño a miofibers saludables.Las partes más importantes de este procedimiento son identificar todos los tendones en el tobillo después de que se realiza la incisión inicial y cortar con éxito a través del epimysium. La competencia funcional de los xenoinjertos se puede evaluar aislando enzimáticamente miofibras individuales y probando transitorios de calcio o realizando mediciones forzadas evocadas después de la estimulación eléctrica.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicación de la estimulación crónica para estudiar adaptaciones fenotípicas de músculo esquelético de rata inducida por actividad contráctil

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...