Name: performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Myositis Association och Peter Buck Foundation. Vi skulle vilja tacka Dr Yuanfläkt Zhang för att dela sin expertis och utbildning i xenograft kirurgisk teknik.

All användning av forskning prover från försökspersoner godkändes av Johns Hopkins institutionella Review Board (IRB) för att skydda rättigheter och välfärd för deltagarna. Alla djur experiment godkändes av Johns Hopkins University institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) i enlighet med National Institutes of Health (NIH) Guide för vård och användning av försöksdjur. Man nickar-Rag1NullIL2rγNull (NRG) värd möss (8-12 veckor ...

<ol>
	<li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters.">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. , 1-14 (2018).</li><li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs.">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li><li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials:+systematic+review.">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li><li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients.">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li><li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina.">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li><li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB.">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders.">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li><li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+:+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle.">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li><li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy.">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li><li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics.">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li><li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).</li><li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction.">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li></ol>

Xenograft från patient är ett innovativt sätt att modellera muskelsjukdomar och genomföra prekliniska studier. Den metod som beskrivs här för att skapa skelettmuskulaturen xenograft är snabb, okomplicerad, och reproducerbara. Ensidiga operationer kan utföras i 15 till 25 minuter, eller bilateralt i 30 till 40 minuter. Bilaterala xenograft kan ge ytterligare experimentell flexibilitet. Till exempel kan forskare utföra lokaliserad behandling av en xenograft, med den andra kvar som en kontroll. Den NRG möss är re...

Det har rapporterats att endast 13,8% av alla läkemedelsutveckling program som genomgår kliniska prövningar är framgångsrika och leda till godkända terapier1. Även om denna framgång är högre än 10,4% tidigare rapporterat2, det finns fortfarande betydande utrymme för förbättringar. En metod för att öka andelen framgångsrika kliniska prövningar är att förbättra laboratorie modeller som används i preklinisk forskning. Food and Drug Administration (FDA) kräver djurstudier för att Visa behandlingseffekt och bedöma toxicitet före fas 1 kliniska prövningar. Emellertid, det finns ofta begränsad konkordans i behandlingsresultat mellan djurstudier och kliniska prövningar3. Dessutom kan behovet av prekliniska djurstudier vara ett oöverstigligt hinder för terapeutisk utveckling vid sjukdomar som saknar en accepterad djurmodell, vilket ofta är fallet för sällsynta eller sporadiska sjukdomar.
Ett sätt att modellera människans sjukdom är genom att transplanterar mänsklig vävnad till immunobristfälliga möss för att generera xenografter. Det finns tre viktiga fördelar med xenograft modeller: för det första kan de recapitulate de komplexa genetiska och epigenetiska avvikelser som finns i mänskliga sjukdomar som aldrig kan reproduceras i andra djurmodeller. För det andra kan xenografter användas för att modellera sällsynta eller sporadiska sjukdomar om patientprover finns tillgängliga. För det tredje, xenograft modellera sjukdomen inom ett komplett in vivo-system. Av dessa skäl, vi hypotes om att behandlingseffekt resultat i xenograft modeller är mer benägna att översätta till prövningar hos patienter. Human tumör xenograft har redanframgångsrikt utnyttjas för att utveckla behandlingar för vanliga cancerformer, inklusive multipelt myelom, samt individanpassade terapier för enskilda patienter4,5,6, 7.
Nyligen har xenograft använts för att utveckla en modell av mänsklig muskelsjukdom8. I denna modell, mänskliga muskelbiopsi prover transplanteras in i bakbenen av immunobristfällig NRG möss att bilda xenografts. Den transplanterade humana myofibers dör, men mänskliga muskelstamceller som finns i xenograft senare expandera och differentiera till nya humana myofibers som återbefolkar den inympade mänskliga basal lamina. Därför är regenererad myofibers i dessa xenograft helt mänskliga och spontant revaskularized och innerveras av mus värden. Viktigt, fascioscapulohumeral muskeldystrofi (FSHD) patientens muskelvävnad transplanteras till möss recapitulates viktiga egenskaper hos den mänskliga sjukdomen, nämligen uttrycket av DUX4 transkriptionsfaktorn8. Fshd orsakas av överuttryck av DUX4, som är epigenetiskt tystas i normal muskelvävnad9,10. I fshd xenograft-modellen har behandling med en DUX4-specifik morfolino visat sig framgångsrikt förtränga DUX4 uttryck och funktion, och kan vara ett potentiellt terapeutiskt alternativ för fshd-patienter11. Dessa resultat visar att humana muskelxenografter är en ny metod för att modellera människans muskelsjukdom och testa potentiella terapier hos möss. Här beskriver vi i detalj den kirurgiska metoden för att skapa mänskliga skelettmuskulaturen xenograft hos immunobristfälliga möss.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x 30 mm micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Weighing Scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning, Cellgro</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoClip System</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chick embryo extract</td>
			<td>Accurate</td>
			<td>CE650TL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM1860 UV cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM1860UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin staining jar</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S13976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice - pellet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9584462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Myosin antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F1.652</td>
			<td>recommended concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite MI-150</td>
			<td>Dolan-Jenner</td>
			<td>Mi-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11295-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21145</td>
			<td>recommended concentration 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hams F-10 Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-070-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive</td>
			<td>Tissue seal</td>
			<td>TS1050044FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific lamin A/C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab40567</td>
			<td>recommended concentration 1:50-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human specific spectrin antibody</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>NCLSPEC1</td>
			<td>recommended concentration 1:20-1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>941444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11066-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>TD.06596</td>
			<td>Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>surgical wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapleson E Breathing Circuit</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>921412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile Anesthesia Machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse on Mouse Basic Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BMK-2202</td>
			<td>mouse IgG blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>007799</td>
			<td>2 to 3 months old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4870500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen) injectable</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>10000319</td>
			<td>surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #11</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Accu-scope</td>
			<td>3075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-706-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VaporGaurd Activated Charcoal Filter</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>931401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips, 9 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12022-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

performing human skeletal muscle xenografts in immunodeficient mice

Behandlingseffekter som observerats i djurstudier misslyckas ofta att rekapitueras i kliniska prövningar. Även om detta problem är mångfacetterat, en orsak till detta misslyckande är användningen av otillräckliga laboratorie modeller. Det är utmanande att modellera komplexa mänskliga sjukdomar i traditionella laboratorieorganismer, men denna fråga kan kringgås genom studiet av mänskliga xenografts. Den kirurgiska metod som vi beskriver här gör det möjligt för skapandet av mänskliga skelettmuskulaturen xenografts, som kan användas för att modellera muskelsjukdom och utföra prekliniska terapeutiska tester. Enligt en institutionell granskningsnämnd (IRB)-godkänt protokoll, skelettmuskulaturen prover förvärvas från patienter och sedan transplanteras in NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) värd möss. Dessa möss är idealiska värdar för transplantations studier på grund av deras oförmåga att göra mogna lymfocyter och är därmed oförmögna att utveckla Cell-medierad och humorala adaptiva immunsvar. Värd möss bedövas med isofluran, och musen tibialis anterior och extensor digitorum longus muskler avlägsnas. En bit av mänsklig muskel placeras sedan i den tomma Tibia facket och sys till proximala och distala senor i peroneus longus muskeln. Den xenografted muskeln är spontant vaskulariserad och innerveras av mus värden, vilket resulterar i robust regenererad mänsklig muskel som kan fungera som en modell för prekliniska studier.

Som framgår av yuanfläkt Zhang et al., detta kirurgiska protokoll är en enkel metod för att producera mänskliga skelettmuskulaturen xenograft8. Regenererad xenograft blir spontant innerveras och Visa funktionell kontraktilitet. Dessutom, muskelxenografted från FSHD patienter recapitulates förändringar i genuttryck observerats i FSHD patienter8.
Enligt vår erfarenhet, cirka 7 av 8 xenograft utförs från kontroll patientprover kommer att ...

Watch this Scientific Journal Video about Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice at JoVE.com

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Komplexa mänskliga sjukdomar kan vara utmanande att modellera i traditionella laboratoriemodell system. Här beskriver vi en kirurgisk metod för att modellera människans muskelsjukdom genom transplantation av mänskliga skelettmuskulaturen biopsier till immunobristfällig möss.

Utföra humana skelettmuskulaturen xenografts hos Immunobristfällig möss

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Detta protokoll är betydande eftersom det kan användas för att skapa mänskliga skelettmuskulaturen xenografts, som kan användas för att modellera muskelsjukdom och att utföra preklinisk terapeutisk testning. Denna xenograft modell tillåter forskare att studera mänskliga muskler in vivo att bättre förstå mänskliga muskel cellbiologi och att utveckla nya modeller för sällsynta eller förvärvade muskelsjukdomar. Efter att ha erhållit en mänsklig muskelbiopsi, placera exemplaret i en 100-by-15-millimeter Petri-skålen som innehåller muskel medium, och använda en stereo mikroskop och kirurgiska sax för att ta bort eventuella kvarvarande fascia eller fettvävnad.Dissekera muskelbiopsin i ungefär sju-av-tre-av-tre-millimeters bitar, var noga med att fibrerna är ordnade i längsled inom exemplaret. Därefter överför petriskålen som innehåller den dissekerade muskeln på is, och placera syntetiska, icke-absorberbara suturer i en 100-by-15-millimeters petriskål med 70%etanol. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i en åtta-till 12-veckors, sövda NOD-Rag-gamma mus, applicera salva på immundeficient djurets ögon, och använda en trimmer för att ta bort håret överliggande tibialis främre från fotleden till knäet.Applicera sedan depilatory cream på den exponerade huden i en minut innan desinficering av operationsstället med povidone-jodlösning och 70%etanol. Att ympa den mänskliga vävnaden, först tejpa ner musbenet, och göra ett rakt snitt över tibialis främre som har sitt ursprung vid de distala senorna och avslutas under knäet. Använd trubbig dissekering för att separera huden från muskelvävnaden, och använd sax för att göra en mindre än-0,5-millimeters snitt genom epimysium av tibialis främre muskeln, börjar vid senan och slutar vid knäet.Efter styckning den distala senan av tibialis främre, greppa senan med iris tlyktor, och dra muskeln upp mot knäet. Därefter skär den distala senan av extensor digitorum longus, och dra extensor digitorum longus upp mot knäet. När den proximala senan av peroneus longus muskeln är synlig, ta bort extensor digitorum longus och tibialis anterior med saxen.Använd en kirurgisk torka våt med PBS att tillämpa lätt tryck tills hemostas uppnås, och trä en sutur genom proximala peroneus longus sena, lämnar en cirka 1,5-tums bit tråd på vardera sidan av senan. Gör den första halvan av en två-hand kirurgiska kvadrat knut utan åtdragning för att bilda en cirkel, och placera en xenograft i cirkeln, dra åt slingan för att säkra transplantatvävnaden. Slutföra den andra halvan av den fyrkantiga knut att sutur xenograft till proximala senan av peroneus longus, och trä suturen genom distala peroneus longus sena att upprepa den kvadratiska knut tekniken vid den distala senan.När båda ändarna av transplantatet har säkrats, dra huden över xenografted muskeln, försegla snittet med kirurgiskt lim, och placera två till tre kirurgiska häftklamrar över limmet. Placera sedan musen i en ren bur på en uppvärmd pad med övervakning tills full recumbency. Fyra till sex månader efter operationen, placera en täckt bägare innehållande 200 milliliter 2-metylbutan i en låda med torris i minst 30 minuter före xenograftskörden.När 2-metylbutan har svalnat, bekräfta en brist på svar på tå nypa, och ta bort håret överliggande tibialis anterior från vristen till knäet med en trimmer och depilatory grädde. Suturerna som håller xenograften på plats ska observeras genom huden. Säkra benet med tejp, och använd sax och iris-forceps för att öppna huden över xenograft tills båda suturerna är avtäckta.Använd en skalpell för att skära mellan xenograft och skenbenet för att frigöra ena sidan av xenograft innan du skär mellan peroneus longusmuskeln och gastrocnemiusmuskeln. Skär under den distala suturen och genom peroneus longus distala sena, och använd iris-forceps för att greppa och avleda suturen mot knäet medan du använder sax för att skära bort xenograft från den underliggande muskelvävnaden. Använd sedan sax för att skära ovanför den proximala suturen för att ta bort xenograft och peroneus longus, och placera det skördade exemplaret på en liten bit kartong.Nåla fast vävnaden så nära suturerna som möjligt samtidigt som muskeln försiktigt sträcks för att fiberorienteringen skall bibehållas under snap-frysningsprocessen. När stiften sitter säkert på plats skjuter du muskeln upp i stiften så att vävnaden vilar precis ovanför kartongen och snäppfryser xenograft i den förkylda 2-metylbutan för minus 80-grader Celsius lagring. En framgångsrik xenograft visar en robust regenerering av mänskliga myofibers som identifieras med human-specifika antikroppar.Positiv embryonal myosinfärgning inom en andel av myofibrerna indikerar att regenereringsprocessen fortfarande pågår. Däremot kan dålig kirurgisk teknik eller ett otillräckligt exemplar leda till en dålig regenerering av muskelfibrerna. Xenografts utförs från en patient som diagnostiserats med en idiopatisk inflammatoriska myopati uppvisar måttlig antal regenererade mänskliga myofibers på fyra och sex månader samlingar, och embryonala myosin färgning kvarstår vid sex månader.Inflammatoriska celler är också närvarande inom xenograft, som observerats av H och E färgning. Enskilda myofiber storlekar är liknande mellan fyra och sex månader i idiopatisk inflammatoriska myopati xenografts. Sällsynta fibrer som visar ett tvärsnittsarea större än 3, 500 mikrometer i kvadrat observeras inom xenografts men inte i idiopatisk inflammatoriska myopati tarmbiopsier, vilket tyder på att vissa av de myofibers i xenografts kan regenerera till ett tvärsnitt område som liknar i storlek friska myofibers.De viktigaste delarna av detta förfarande är att identifiera alla senor i fotleden efter det inledande snittet görs och framgångsrikt skär genom epimysium. Den funktionella kompetensen hos xenografts kan bedömas genom enzymatically isolera enda myofibers och testa kalcium transienter eller genom att utföra framkallat tvångsmätningar efter elektrisk stimulering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Utvärdering av nervskade-inducerad åldras och In Vivo omprogrammering i skelettmuskulaturen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Tillämpningen av kronisk stimulering att studera kontraktila aktivitet-inducerad råtta skelettmuskulaturen fenotypiska anpassningar

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolering, kultur, karakterisering, och differentiering av humana muskelstamceller från skelettmuskulaturen biopsi förfarande

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Isolering och differentiering av primära myoblasts från mus skelettmuskel Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...