Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

يحب المؤلفون أن يعترفوا بمارك يوليس وصوفين كمون وسيلفستر ماريلونيه لجعل أجزاء استنساخ البوابة الذهبية متاحة من خلال قاعدة بيانات أدجين. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر إ. جيمس، ب. هادوباس، وت. ج. هيغينز على بذور P. andersonii. وقد دعمت هذا العمل المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (منحة NWO-VICI 865.13.001؛ منحة المنافسة المفتوحة 819.01.007) ووزارة البحوث والتكنولوجيا والتعليم العالي في جمهورية إندونيسيا (منحة RISET-PRO 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تمثل البقوليات وجنس القنب البعيد الصلة باراسبونيا اثنين فقط من الأنواع النباتية القادرة على إقامة علاقة بطانة الرحم مع جذوبية تحديد النيتروجين وتشكيل العقيدات الجذرية. الدراسات المقارنة بين الأنواع من كلا الكلدس هي ذات صلة للغاية لتوفير رؤى في الشبكات الوراثية الأساسية مما يسمح بهذا التكافل. وفي الوقت الراهن، تُجر الدراسات الجينية أساساً في البقوليات؛ خصوصا النوعين نموذج M. truncatula و L. japonicus. لتوفير منصة تجريبية إضافية وتسهيل الدراسات المقارنة مع عدم البقول، ونحن نصف هنا بروتوكول مفصل للتحول مستقرة والتحليلات الوراثية العكسية في P. andersonii. يستخدم البروتوكول المعروض الانتشار في المختبر لخطوط T0 المعدلة وراثياً P. andersonii، مما يسمح ببدء التحليل الفينوتي في غضون 4 أشهر بعد زراعة A. tumefaciens المشتركة. هذا هو أسرع بكثير من البروتوكولات الحالية التي تم وضعها لتحويل مستقر من البقوليات33. وهذا يجعل P. andersonii نموذج بحث جذاب.
يحتوي البروتوكول الموضح هنا على عدة خطوات هامة. الأول يتعلق بإنبات البذور. لإعداد بذور P. andersonii للإنبات، تحتاج البذور إلى أن تكون معزولة عن التوت. ويتم ذلك عن طريق فرك التوت على قطعة من ورق الأنسجة أو ضد داخل غربال الشاي. هذا الإجراء يحتاج إلى تنفيذ بلطف من أجل منع الأضرار التي لحقت معطف البذور. إذا كان معطف البذور يحصل التالفة، التبييض يمكن أن تدخل البذور أثناء التعقيم، مما يقلل من جدوى البذور. لكسر البذور الخاملة، تخضع البذور لدورة درجة حرارة لمدة 10 أيام. ومع ذلك ، على الرغم من هذا العلاج ، لا يتم مزامنة الإنبات تماما. عموما، تظهر البذور الأولى ظهور الراديوكل بعد 7 أيام، ولكن البعض الآخر قد يستغرق عدة أيام أطول لإنبات.
وتتعلق النقاط الحرجة في إجراء التحويل باختيار المواد الأولية ومدة خطوة الزراعة المشتركة. للوصول إلى التحول الفعال، فمن الأفضل استخدام ينبع صحية والشباب أو petioles من النباتات غير المعقمة التي تزرع في الدفيئة كمادة البداية. من أجل الحث على نمو الفروع الشابة، فمن المستحسن لتقليم أشجار باراسبونيا كل 2-3 أشهر وتحديث الأشجار مرة واحدة في السنة. بالإضافة إلى ذلك، يجب تنفيذ خطوة الزراعة المشتركة لمدة يومين فقط. الزراعة المشتركة لفترات طويلة تشجع الإفراط في استعمار الأنسجة explants من قبل A. tumefaciens ويقلل عموما من كفاءة التحول. لمنع الإفراط في الاستعمار من قبل A. tumefaciens من المهم أيضا لتحديث لوحات بانتظام التي تزرع explants. في حالة حدوث إفراط في الاستعمار، يمكن غسل الأنسجة المنفية (انظر القسم 3.8) لإزالة خلايا A. tumefaciens. ننصح بإضافة التبييض إلى الحل SH-10 المستخدمة لغسل (التركيز النهائي: ~ 2٪ هيبوكلوريت). من المهم أن نلاحظ أن هذه الخطوة الغسيل إضافية قد لا تعمل على explants المصابين بشدة (الشكل2B). في حالة التحول مع بناء كريسبر / Cas9 تسفر فقط عن عدد محدود من يطلق النار تحول المفترض أو إذا كان من المتوقع أن يسبب تحول جين معين مشاكل في التجديد، فإنه من المستحسن أن تشمل بناء مكافحة ناقلات فارغة كما السيطرة الإيجابية. وأخيراً، من المهم ضمان أن تكون جميع الخطوط المحورة وراثياً التي يتم اختيارها ناتجة عن أحداث تكامل الحمض النووي T المستقلة. لذلك، نحن تعليمات لاتخاذ واحد فقط من نوع واحد من النباتات. ومع ذلك، فإننا ندرك أن هذا يقلل من العدد المحتمل للخطوط المستقلة. إذا كانت هناك حاجة إلى العديد من الخطوط، يمكن للباحثين أن يقرروا فصل كالي تحويلها بشكل مفترض من explants الأصلي عندما تكون هذه كالي ≥ 2 ملم في الحجم والثقافة هذه كالي بشكل مستقل. وبهذه الطريقة، يمكن عزل خطوط متعددة عن كل مصنع سابق، مما يزيد من عدد الخطوط المعدلة وراثيا المحتملة.
في البروتوكول الحالي، يتم نشر خطوط المعدلة وراثيا من P. andersonii نباتيا من خلال الانتشار في المختبر. وميزة ذلك هي أن العديد من النباتات المعدلة وراثيا يمكن أن تولد في فترة زمنية قصيرة نسبيا. ومع ذلك، يحتوي هذا الأسلوب أيضاً على عدة قيود. أولا، الحفاظ على خطوط T0 المعدلة وراثيا من خلال الانتشار في المختبر هو كثيف العمالة ويمكن أن يؤدي إلى تغييرات وراثية غير مرغوب فيها أو الجيني34،35. ثانيا، خطوط T0 لا تزال تحتوي على نسخة من T-DNA، بما في ذلك كاسيت مقاومة المضادات الحيوية. وهذا يحد من عدد عمليات إعادة التحويل المحتملة، حيث أن علامات التحديد المختلفة مطلوبة لكل عملية إعادة تحويل. حاليا، لقد اختبرنا فقط التحول باستخدام اختيار كانامايسين أو هيغرومايسين (البيانات غير المعروضة). وعلاوة على ذلك، فإن وجود تسلسل ترميز Cas9 وsgRNAs في خطوط T0 المعدلة وراثيا يعقد دراسات التكملة. يمكن إجراء الاختبارات التكميلية ولكنها تتطلب تغيير الموقع (المواقع) المستهدفة لـ sgRNA على هذا النحو بحيث يتم منع تحرير الجينات من بناء التكملة. ثالثا، عيب في العمل مع خطوط T0 هو أن متحولين CRISPR / Cas9 قد يكون chimeric. لمنع التحليل الفينوتي للخطوط المتحولة الشميرية، نوصي بتكرار تحليل النماذج الجينية بعد الانتشار في المختبر على ما لا يقل عن 3 لقطات مختلفة. على الرغم من أن عدد المتحولين chimeric التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكول الموضح هنا محدود، لوحظ في بعض الأحيان10. للتغلب على قيود العمل مع خطوط T 0، P. أندرسوني خطوط متحولة يمكن نشرها توليديا. P. أشجار أندرسون هي dioecious والرياح الملقحة2. وهذا يعني أن كل خط المعدلة وراثيا يحتاج إلى التلاعب على هذا النحو أن يتم إنتاج الزهور الذكور والإناث على فرد واحد، وتنمو في وقت لاحق على هذا النحو أن التلقيح عبر لا يحدث. كما P. andersonii هو شجرة سريعة النمو فإنه يتطلب كمية كبيرة من الفضاء في الدفيئة الاستوائية (28 درجة مئوية، ~ 85٪ الرطوبة النسبية). ولذلك، على الرغم من أن الانتشار التوليدي للخطوط المعدلة وراثياP. andersonii ممكن من الناحية التقنية، فهو يشكل تحديا لوجستيا.
في قسم البروتوكول، وصفنا 3 طرق لإيماءة من P. andersonii. وميزة نظم الصفائح والحقيبة هي أن الجذور يمكن الوصول إليها بسهولة، مما قد يسمح بتلقيح البكتيريا على الفور وبعد تكوين العقيدات مع مرور الوقت. ومع ذلك، فإن نظام لوحة كثيفة العمالة تماما، مما يجعلها أقل ملاءمة لتجارب الإيماء على نطاق واسع. عيب في نظام الحقيبة هو أنه من الصعب منع التلوث الفطري. الحقائب ليست معقمة، وبالتالي غالبا ما لوحظ النمو الفطري في النصف العلوي من الحقيبة. ومع ذلك، هذا لا يؤثر على نمو P. andersonii، وبالتالي لا تتداخل مع الاختبارات التموجات. بالإضافة إلى ذلك، فإن نظام الحقيبة هو مناسبة فقط للشتلات. على الرغم من العديد من المحاولات، لم نتمكن من زراعة النباتات التي تم الحصول عليها من خلال الانتشار في المختبر في الحقائب.
خط أنابيب P. andersonii عكس علم الوراثة الموصوفة هنا يقدم تحسنا كبيرا بالمقارنة مع طريقة تحويل الجذر القائمة A. rhizogenesالقائمة11. وباستخدام الإجراءات الموصوفة، يمكن توليد خطوط مستقرة جينياً بكفاءة ويمكن الحفاظ عليها عن طريق الانتشار في المختبر. وعلى النقيض من ذلك، فإن تحويل الجينات الجذمورية A. عابر ولا يؤدي إلا إلى تكوين جذور جينية. لأن كل جذر المعدل وراثيا ينتج عن تحول مستقل، A. الاختبارات القائمة على التحول rhizogenes تعاني من اختلاف الفينوتيبيك كبيرة. وهذا التباين أقل بكثير في حالة وجود خطوط مستقرة، على الرغم من أن الانتشار في المختبر يخلق أيضاً مستوى ما من التباين. وبسبب هذا الاختلاف المنخفض وحقيقة أن النباتات المتعددة يمكن أن تكون فينوليت لكل خط مستقر، وخطوط مستقرة هي أكثر ملاءمة للتجارب الكمية مقارنة A. جذور rhizogenes-تحول. بالإضافة إلى ذلك، فإن التحول المستقر لا يعتمد على إدخال جذر الريزوجين A. تحفيز موضع (رول) الذي يؤثر على توازن هرمون الذاتية15. ولذلك، خطوط مستقرة هي الأنسب للتحليل الجيني العكسي للجينات المشاركة في التوازن الهرموني مقارنة A. جذور rhizogenes-تحول. ميزة أكثر عمومية من P. andersonii كنموذج البحوث هو أنه لم يواجه ازدواجية الجينوم كله مؤخرا (WGD). عائلة البابيليونوئية الفرعية البلينومة، والتي تشمل نموذج البقوليات M. truncatula و L. japonicus، فضلا عن Salicaceae (ترتيب Malpighiales) التي تشمل شجرة نموذج Populus trichocarpa من ذوي الخبرة WGDs ~ 65 مليون سنة مضت36،37. يتم الاحتفاظ بالعديد من نسخ الجينات paralogous الناتجة عن هذه WGDs في الجينوم من M. truncatula، L. japonicus و P. trichocarpa37،38،39، مما يخلق التكرار الذي قد يعقد التحليلات الوراثية العكسية. وبما أن P. andersonii لم يواجه الفريق العامل الأخير، فإن التحليلات الوراثية العكسية على P. andersonii قد تكون أقل تأثراً بالأداء الزائد للنسخ الجينية البارالوغوية.
إذا ما أخذنا معا، نقدم بروتوكول مفصل للتحليل الوراثي العكسي في P. andersonii. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إنشاء خطوط متحولة واحدة بكفاءة في إطار زمني من 2-3 أشهر10. ويمكن توسيع هذا البروتوكول لخلق أعلى ترتيب المسوخ من خلال تعدد الإرسال وsgRNAs استهداف جينات مختلفة في وقت واحد، كما هو مبين لأنواع النباتات الأخرى40،41،42. بالإضافة إلى ذلك، فإن إجراء التحول المستقر الموضح هنا لا يقتصر على استهداف الجينات CRISPR/Cas9 ولكن يمكن استخدامه أيضًا لإدخال أنواع أخرى من المنشآت (على سبيل المثال، لتجارب المروج والمراسل، أو التعبير خارج الرحم أو التحويل - التكامل). أنشأنا P. andersonii كنموذج بحثي مقارن لدراسة التكافل المتبادل مع جذوبية تحديد النيتروجين أو الفطريات endomycorrhizal. ومع ذلك، فإن البروتوكولات الموصوفة هنا توفر أيضا أدوات لدراسة جوانب أخرى من بيولوجيا هذه الشجرة الاستوائية، مثل تكوين الخشب، وتطوير الزهور ثنائية الجنس أو التركيب البيولوجي للأيض الثانوية الخاصة بالقنب.

Parasponia andersonii هي شجرة استوائية تنتمي إلى عائلة القنب (كاناباسيا) وهي أصليةفي بابوا غينيا الجديدة والعديد من جزر المحيط الهادئ 1،2،3. جنبا إلى جنب مع 4 أنواع باراسبونيا إضافية، فإنه يمثل النسب الوحيد غير البقوليات التي يمكن أن تنشئ تكافل العقيدات تثبيت النيتروجين مع جذمور. ويدرس هذا التكافل بشكل جيد في البقول (Fabaceae) نماذج Medicago truncatula ولوتس جابونيكونكوس، مما أدى إلى الحصول على معرفة مفصلة من الطبيعة الوراثية الجزيئية لتكوين العقيدات وتعمل4. بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن التعايش العقيدات الجذرية في البقوليات يقوم على التكافل mycorrhizal arbuscular على نطاق واسع5. تشير المقارنات الفيوجينية إلى أن التكافل بين العقيدات المثبتة للنيتروجين من البقوليات، باراسبونيا،وكذلك، ما يسمى بأنواع النباتات الأكتينوريزال التي تستضيف بكتيريا الفرانكويا الديازوجينية، لها أصل تطوري مشترك 6و7و8. ولتحديد ما إذا كانت الجينات التي تم تحديدها للمشاركة في تكوين العقيدات البقولية هي جزء من أساس وراثي محفوظ، فإن الدراسات المتعلقة بالأنواع غير البقولية ضرورية. ولهذا الغرض، نقترح استخدام P. andersonii كنموذج بحثي مقارن، إلى جانب البقوليات، لتحديد الشبكات الوراثية الأساسية التي يقوم عليها تكوين العقيدات الجذرية وأدائها.
P. andersonii هو رائد التي يمكن العثور عليها على منحدرات التلال البركانية. يمكن أن تلبي سرعات النمو من 45 سم شهريا وتصل إلى أطوال تصل إلى 10 متر9. P. أندرسوني الأشجار هي الرياح الملقحة، والتي يسهلها تشكيل الزهور الذكور والإناث منفصلة3،10. قمنا مؤخرًا بتسلسل وتعليق الجينوم الديبلويد (2n = 20؛ 560 Mb/1C) من P. andersonii، وتجميع ناصية تسلسل الجينوم من نوعين إضافيين من Parasponia؛ ب. rigida و P. rugosa6. هذا كشف ~ 35,000 P. أندرسوننماذج الجينات التي يمكن تجميعها في > 20,000 orthogroups جنبا إلى جنب مع الجينات من M. اقتطاعولا,فول الصويا (Glycineماكس), أرابيدوبيس ثاليانا,الغابات الفراولة ( فراجاريا فيسكا)، تريما أورينتاليس ، الحور القطن الأسود (بوبولوس تريتشوكاربا) والكافور (الكافور جرانديس)6. بالإضافة إلى ذلك، حددت مقارنات النسخ بين M. truncatula و P. andersonii مجموعة من 290 تقويم اكتية المفترضة التي تظهر نمط التعبير المعززة العقيدات في كلا النوعين6. وهذا يوفر موردا ممتازا للدراسات المقارنة.
لدراسة وظيفة الجينات في جذور P. andersonii والعقيدات، تم إنشاء بروتوكول لتحويل جذور جذور Agrobacteriumبوساطة11. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن توليد النباتات المركبة التي تحمل جذوراً معدلة وراثياً في إطار زمني قصير نسبياً. هذه الطريقة هي أيضا، تطبق على نطاق واسع في بحوث التكافل البقوليات12،13،14. ومع ذلك، فإن العيب في هذه الطريقة هو أن الجذور فقط يتم تحويلها وأن كل جذر المعدلة وراثيا يمثل حدث تحويل مستقل، مما أدى إلى اختلاف كبير. كما أن التحول عابر ولا يمكن الحفاظ على الخطوط المعدلة وراثيا. وهذا يجعل تحويل الجذر القائم على A. rhizogenesأقل ملاءمة لتحرير الجينوم كريسبر/ Cas9 بوساطة. بالإضافة إلى ذلك، A. rhizogenes ينقل جذرها تحفيز locus (رول) الجينات إلى الجينوم النبات، والتي أعرب مرة واحدة تتداخل مع هرمون التوازن15. وهذا يجعل دراسة دور الهرمونات النباتية في A. جذور جذورتحول تحديا. للتغلب على هذه القيود، وضعنا مؤخرا بروتوكول للتحول القائم على Tumefaciens AgrobacteriumوCRISPR / Cas9 بوساطة الطفرات من P. andersonii10.
هنا، نقدم وصفا مفصلا لعملية التحول المستندة إلى A. tumefaciensوخط أنابيب علم الوراثة العكسي وضعت لP. andersonii. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم بروتوكولات للتعامل مع المصب من النباتات المعدلة وراثيا، بما في ذلك الاختبارات لدراسة التفاعلات التكافلية. باستخدام البروتوكول الموضح هنا، يمكن إنشاء خطوط متعددة المعدلة وراثيا في فترة 2-3 أشهر. في تركيبة مع الطفرات كريسبر/ كاس9 بوساطة، وهذا يسمح جيل فعال من خطوط متحولة بالضربة القاضية. هذه الخطوط المتحولة يمكن أن تنتشر نباتيا في المختبر10،16،17، والذي يسمح ما يكفي من المواد التي سيتم إنشاؤها لبدء توصيف phenotypic في 4 أشهر بعد إجراء التحول قد بدأت10. معا، هذه المجموعة من الإجراءات ينبغي أن تسمح لأي مختبر لاعتماد P. andersonii كنموذج بحثي للدراسات التي تهدف إلى فهم الجمعيات جذوبية وmycorrhizal، فضلا عن جوانب أخرى محتملة من بيولوجيا هذه الشجرة الاستوائية.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii هي شجرة استوائية سريعة النمو تنتمي إلى عائلة القنب (Cannabaceae). وإلى جانب 4 أنواع إضافية، يشكل هذا النوع النسب الوحيد غير البقول المعروف القادر على إقامة تكافل بين عقيدات تثبيت النيتروجين مع الريزوبيوم. ويمكن أن توفر الدراسات المقارنة بين البقوليات وP. andersonii نظرة ثاقبة قيّمة في الشبكات الوراثية الكامنة وراء تكوين العقيدات الجذرية. لتسهيل الدراسات المقارنة، قمنا مؤخرا تسلسل الجينوم P. andersonii وأنشئت Agrobacterium tumefaciens- بوساطة التحول مستقرة وتحرير الجينوم القائم على كريسبر / Cas9. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا للتحول والجينوم تحرير الإجراءات التي وضعت لP. andersonii. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نصف إجراءات لإنبات البذور وتوصيف الأنماط الظاهرية التكافلية. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إنشاء خطوط متحولة مستقرة جينيا في فترة 2-3 أشهر. يسمح الانتشار الخضري في المختبر للخطوط المعدلة وراثيا ً T0 ببدء تجارب النماذج الظاهرية في غضون 4 أشهر بعد زراعة A. tumefaciens المشتركة. ولذلك، فإن هذا البروتوكول يستغرق فقط وقتا أطول هامشيا من طريقة تحويل الجذر التي تعتمد على البكتيريا الزراعيةالعابرة المتاحة لP. andersonii، على الرغم من أنه يقدم العديد من المزايا الواضحة. معا، والإجراءات الموصوفة هنا تسمح P. andersonii لاستخدامها كنموذج بحثي للدراسات التي تهدف إلى فهم الجمعيات التكافلية، فضلا عن الجوانب الأخرى المحتملة من بيولوجيا هذه الشجرة الاستوائية.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii هي شجرة استوائية سريعة النمو تنتمي إلى عائلة القنب (Cannabaceae) ويمكن أن تشكل العقيدات الجذرية المثبتة للنيتروجين بالاشتراك مع الريزوبيوم. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل للتحليلات الوراثية العكسية في P. أندرسوني على أساس Agrobacterium tumefaciens- بوساطة التحول مستقرة وتحرير الجينوم القائم على كريسبر / Cas9.

تحويل، تحرير الجينوم والفينولات في نتروجين تحديد شجرة كاناباسيا الاستوائية Parasponia أندرسوني

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia هي شجرة استوائية من عائلة القنب التي هي قادرة على إنشاء تكافل النيتروجين تحديد مع رهيزوبيوم. يمكن أن توفر الدراسات المقارنة بين Parasponia والبقوليات نظرة ثاقبة على الشبكات الوراثية الأساسية الكامنة في تكافل رهيزوبيوم. مع هذا البروتوكول، يمكن إنشاء خطوط طفرات مستقرة في اِلَرَسِرُنِية أندرسوني في فترة من شهرين إلى ثلاثة أشهر.ويمكن نشر هذه الخطوط بكفاءة من خلال الانتشار في المختبر. يوفر هذا البروتوكول منصة تجريبية لدراسة التكافل رهوبيال فضلا عن جوانب أخرى من بيولوجيا هذه الشجرة الاستوائية. والمهارات الأساسية في زراعة الأنسجة والاستنساخ الجزيئي كافية لتنفيذ هذا البروتوكول.وهذا يسمح لأي مختبر لتكييف بارابونيا كنموذج للبحوث. وسوف يكون هذا الإجراء الطالبين الدكتوراه تيتس وردهاني ويودا Roswanjaya جنبا إلى جنب مع هارتوغ ماريكي، وهو فني في مختبرنا. لزراعة الأشجار أندرسوني Parasponia، تبدأ من خلال الإنبات البذور.إزالة البذور من التوت Parasponia عن طريق فرك ضد داخل منخل الشاي أو سحق لهم على قطعة من الورق الأنسجة. تطهير البذور باستخدام 4٪ تبييض هيبوكلوريت لمدة 15 إلى 20 دقيقة، ثم غسل البذور ست مرات مع المياه المعقمة. نقل البذور إلى العقيمة 200 ميكرولتر أنابيب PCR، وملء الأنابيب مع تعقيم المياه لغمر البذور.احتضان الأنابيب لمدة 10 أيام في ثيرموسايرتر وفقا لاتجاهات المخطوطات. بعد الحضانة لمدة 10 أيام، ونقل البذور إلى لوحات SH-0، وإغلاقها مع طبقتين من رقائق ختم مرنة لمنع التجفيف. احتضان في 28 درجة مئوية مع 16 ساعة في اليوم، ودورة ثماني ساعات ليلا لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع.بمجرد أن تطور الشتلات أول مجموعة من الأوراق الحقيقية ، ونقلها إلى الأواني المليئة بتربة بوتينغ التجارية ، وتغطيتها بكأس بلاستيكي شفاف لمنع جفافها. وضع الأواني في 28 درجة مئوية، 85٪ غرفة مناخ الرطوبة النسبية أو الدفيئة تحت نظام 16 ساعة في اليوم، ثماني ساعات ليلا. بعد أسبوع واحد، وإزالة كوب من البلاستيك.بانتظام المياه الأواني، وتكملة مع الأسمدة للحفاظ على نمو الأشجار. الاستعداد للتحول من خلال حصاد فروع الشباب من خمسة إلى ثمانية سنتيمترات من الأشجار المزروعة في الدفيئة، مع التأكد من استخدام فروع صحية فقط غير مصابة. قطع الأوراق، وترك سنتيمتر واحد مربع من الأنسجة ورقة في نهاية كل petiole.تطهير الأنسجة لمدة 15 دقيقة مع 2٪ تبييض هيبوكلوريت تحتوي على بضع قطرات من البوليsorbate 20، ومن ثم شطفه ثماني مرات بالماء autoclaved. إعادة تعليق الخلايا الجرثومية في 25 ملليلتر من التسلل المتوسطة إلى كثافة بصرية من حوالي خمسة. قطع الجذعية والأنسجة petiole إلى قطعة سنتيمتر واحد داخل تعليق الخلية.إزالة الأنسجة ورقة واحتضان قطع الجذعية وpetiole في تعليق الخلية لمدة 10 إلى 30 دقيقة. جفف قطع الأنسجة على قطعة معقمة من ورق التصفية ووضعها على وسط التأصيل المعد وفقًا لاتجاهات المخطوطات. احتضان لوحات في الظلام في 21 درجة مئوية لمدة يومين.بعد اليومين ، تفقد لوحات للتلوث الفطري أو البكتيري والتخلص من اللوحات الملوثة. نقل قطع الأنسجة إلى 10 ملليلتر من المتوسط SH-10 أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات. اترك النسيج في الوسط لمدة 10 دقائق على الأقل، واثاره بلطف كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق للاغتسال.إعداد التسميد مع cefotaxime وkanamycin وفقا لتوجيهات المخطوطة، وصب لوحات. جفف الأنسجة على قطع معقمة من ورق التصفية، ونقلها إلى الأطباق. احتضنت الصفائح لمدة سبعة أيام على حرارة 28 درجة مئوية تحت نظام مدته 16 ساعة، وثماني ساعات.تحقق من اللوحات للتلوث الفطري أو البكتيري كل يومين. إذا حدث تلوث، نقل قطع الأنسجة غير المصابة إلى لوحة جديدة. بعد سبعة أيام، قم بنقل قطع الأنسجة إلى وسيطة نشر أعدت وفقا لاتجاهات المخطوطات واحتضان في 28 درجة مئوية تحت نظام 16 ساعة، ثماني ساعات ليلا.تحديث لوحات مرة واحدة في الأسبوع حتى يطلق النار على المعدلة وراثيا تطوير، مع التأكد من نقل فقط قطع الأنسجة غير المصابة إلى لوحات جديدة. مرة واحدة يطلق النار المعدلة وراثيا المفترضة هي ما لا يقل عن سنتيمتر واحد طويلة، وقطع يطلق النار وثقافتها بشكل مستقل في متوسطة الانتشار مع المضادات الحيوية. لضمان أن يطلق النار تمثل محولات مستقلة، تأخذ فقط تبادل لاطلاق النار واحد من كل جانب من explant.نشر الأنسجة عن طريق وضع حوالي 10 يطلق النار على لوحة جديدة من انتشار المتوسطة وإغلاق لوحة مع طبقتين من رقائق ختم مرنة. احتضان لوحات في 28 درجة مئوية تحت نظام 16 ساعة في اليوم، ثماني ساعات ليلا، وتكرار هذه الخطوة كل أربعة أسابيع. عندما يطلق النار تصل إلى سنتيمتر واحد في الطول، وقطع لهم في قاعدتهم ووضعها على وسيط التأصيل.ضع البراعم منتصبة عن طريق إدراج الطرف القاعدي من تبادل لاطلاق النار في الوسط. ويمكن وضع حوالي 10 يطلق النار على لوحة واحدة. ابدأ بإعداد ريزوبيوم إنوكولوم.تلقيح 10 ملليلتر من السائل YEM المتوسطة من مستعمرة واحدة من مسورثيوزوبيوم متعدد الفاترونوم BOR2، واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة يومين. استخدم هذه الثقافة لتطعيم حجم أكبر من الوسيطة YEM السائلة. مرة واحدة نمت، الطرد المركزي الثقافة البكتيرية لمدة 10 دقائق في 3،500 مرات ز لحصاد الخلايا.إعادة تعليق بيليه بكتيرية في السائل EKM المتوسطة، وتحديد الكثافة البصرية. إعداد ثلاثة لترات من EKM المتوسطة، وهو ما يكفي لحوالي 20 الأواني، وتطعيم مع تعليق rhizobial. اخلطي الوسط مع 1.25 كيلوغرام من البيرلايت، وأضيفي 210 جرام من هذا الخليط إلى أواني البولي بروبلين شفافة معقمة.زرع واحد إلى ثلاثة Plantlets Parasponia أندرسوني لكل وعاء، وإعداد عدة الأواني مع بلانتليتات تحولت مع بناء السيطرة. تزن العديد من الأواني، وتغطي الجزء السفلي من كل وعاء لحماية الجذور من التعرض للضوء. احتضان الأواني في غرفة النمو المناخية في 28 درجة مئوية تحت نظام 16 ساعة، ثماني ساعات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع.مرة واحدة في الأسبوع، تزن عدة الأواني لتحديد فقدان المياه. إذا كان فقدان المياه يتجاوز 10 ملليلتر، تكملة مع المياه النقية جدا للتعويض عن الخسارة. بعد الحضانة، وتنظيف الجذور من البيرلايت، وتحديد أعداد العقيدات باستخدام منظار.وقد استخدمت هذه التقنية لتحويل بنجاح petioles وشرائح من سيقان أندرسوني Parasponia مع سلالة AGL1 Agrobacterium. أولاً، يتم زراعة الأنسجة مع البكتيريا الزراعية لمدة يومين. وينبغي منع الزراعة المشتركة لفترات طويلة من الإفراط في الاستعمار البكتيري.وبعد بضعة أسابيع، لوحظ صغيرة صغيرة كالي على طول سطح الجرح الأصلي. تستمر هذه الـ calli في النمو وتطوير واحد أو أكثر من يطلق النار على نحو مُنُحوَل بشكل مُنَمَنِي بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من بداية التحوّل. تتفاوت كفاءة التحول من 10 إلى 30٪ بالنسبة لتكذُر الأنسجة من الفروع الناضجة إلى 65 إلى 75٪ لتكلات الأنسجة من الفروع الصغيرة والسريعة النمو.يمكن ضرب البراعم المعدلة وراثيا من خلال الانتشار في المختبر، مما يؤدي إلى عشرات من يطلق النار في غضون شهر. ويمكن وضع هذه البراعم على التوسط التأصيل التي من شأنها أن تحفز تشكيل الجذر في حوالي أسبوعين والنباتات التي يمكن أن تنتج يمكن استخدامها للتجريب. عند بدء تجربة التحول مستقرة، من المهم تحديد فروع صحية كمادة المصدر.يتم نشر خطوط باراسبونيا T0 المعدلة وراثيا في المختبر. ولذلك، فمن الضروري أن شامل الجينوم خطوط بارابونيا المعدلة وراثيا. ويتيح إنشاء باراسبونيا كنموذج تجريبي إجراء تحليل مقارن بين نسبين ذيي صلة بعيدة، هما باراسبونيا والبقوليات.وهذا يمكن أن يحدد الحفاظ على الشبكات الوراثية الكامنة في تكافل رهيزوبيوم. يمكن أن يكون Parasponia أيضا نموذجا قيما لدراسة مواضيع بحثية أخرى مثل تكوين الخشب، وتطوير الزهور المخنثين، أو التركيب الحيوي من المستقلبات الثانوية الخاصة Cannabaceae.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

رسم الخرائط التفاعلات رنا-رنا على الصعيد العالمي باستخدام السورالين البيروكسيديز

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

الجينوم التحرير وإخراج تمايز hPSCs عن التحقيق مع محددات النسب في تنمية البنكرياس الإنسان

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

عكس التحليل التضخيم متحاور حلقة تتوسط النسخ (RT-مصباح) للفيروس Zika والجينات التدبير المنزلي في البول والمصل، وعينات البعوض

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

كريسبر بوساطة "تحرير الجينوم" "البشري مسببات الأمراض الفطرية" المبيضات البيض

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

إدخال طفرات نقطية في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام تحرير الجينوم السلس

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...