Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

作者们感谢马克·尤尔斯、索菲恩·卡蒙和西尔维斯特·马里隆内特通过Addgene数据库提供金门克隆部件。此外，我们要感谢E.詹姆斯，P.哈多巴和T.J.希根斯为P.安德森尼种子。这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO-VICI赠款865.13.001;865.13.001;荷兰科学研究组织，第865.13.001年，第3001次，第3次，第3次，第300000名，荷兰科学研究组织，第310000名，NWO-开放竞赛补助金819.01.007）和印度尼西亚共和国研究、技术和高等教育部（RISET-PRO赠款8245-ID）。

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

豆类和远亲的大麻素属帕拉斯波尼亚是植物物种中仅有的两种，能够与固氮的根瘤建立内共生关系，形成根结节。两种包层之间的比较研究与提供对允许这种共生的核心遗传网络的见解高度相关。目前，基因研究主要在豆类中进行;特别是两个模型物种M.截管卡图拉和L.japonicus。为了提供一个额外的实验平台，并方便比较研究与点缀非豆类，我们在这里描述了一个详细的协议，在P.andersonii的稳定转化和反向遗传分析。提出的方案使用T0转基因P.安德森尼线的体外繁殖，允许在A.tumefaciens共同培养后4个月内开始体型分析。这比目前为稳定转化豆类33而建立的协议要快得多。这使得P.安德森ii成为一个有吸引力的研究模型。
此处描述的协议包含几个关键步骤。第一个问题涉及种子发芽。为了准备P.安德森子种子发芽，种子需要从浆果中分离出来。这是通过在一张纸巾上或茶筛内部摩擦浆果来完成的。需要轻轻地执行此步骤，以防止损坏种子涂层。如果种子涂层损坏，漂白剂可能在灭菌过程中进入种子，从而降低种子的生存能力。为了打破种子休眠状态，种子要经过10天的温度循环。然而，尽管这种治疗，发芽不完全同步。一般来说，第一批种子在7天后出现，但其他种子可能需要几天时间才能发芽。
改造过程中的关键点涉及起始材料的选择和共栽培步骤的持续时间。为了达到有效的转化，最好使用非无菌温室种植植物的健康和年轻的茎或小瓣作为起始材料。为了诱导幼枝的生长，建议每2-3个月修剪一次寄生虫树，每年更新一次树木。此外，共同培养步骤只需执行 2 天。长期共同栽培可促进A.tumefaciens对组织外植的过度殖民化，并普遍降低转化效率。为了防止A.tumefaciens的过度殖民化，定期刷新种植外植植物的盘子也很重要。如果确实发生过度殖民化，可以清洗组织外植（见第3.8节），以去除A.tumefaciens细胞。我们建议在用于洗涤的SH-10溶液中加入漂白剂（最终浓度：+2%次氯酸盐）。需要注意的是，这个额外的洗涤步骤可能不适用于严重感染的外植（图2B）。如果使用CRISPR/Cas9构造的转化只产生有限数量的假定转化芽，或者如果特定基因的突变会导致再生问题，则建议将空载体控制结构作为正控制。最后，必须确保选择的所有转基因线都是由独立的T-DNA整合事件产生的。因此，我们指示只从植物的两侧只采取一个单一的假定转基因射击。但是，我们意识到这减少了独立行的潜在数量。如果需要许多线，研究人员可以决定从原始外植分离假定变换的卡利，当这些卡里是+2毫米的大小和培养这些卡利独立。这样，可以从每个外植株中分离出多条线，从而增加潜在的转基因线数。
在目前的协议中，P.安德森的转基因线通过体外繁殖以植物方式繁殖。这样做的好处是，许多转基因植物可以在相对较短的时间段内产生。但是，此方法也有几个限制。首先，通过体外繁殖维持T0转基因线是劳动密集型的，可能导致不必要的遗传或表观遗传改变34，35。其次，T0线仍然包含T-DNA的副本，包括抗生素耐药性盒。这将限制可能的重新转换的数量，因为每次重新转换都需要不同的选择标记。目前，我们只测试了使用卡那霉素或湿霉素选择的转化（未显示数据）。此外，在T0转基因线中存在Cas9编码序列和sgRNA使补充研究复杂化。补充性检测是可能的，但需要sgRNA靶点突变，以便防止补体结构的基因编辑。第三，使用 T0线的缺点是 CRISPR/Cas9 突变体可能是嵌合体。为了防止对嵌合突变系进行型板分析，我们建议在至少3种不同的芽体外繁殖后重复基因分型分析。虽然，使用此处描述的协议获得的嵌合突变体的数量是有限的，它们偶尔被观察到10。为了克服使用T0线的局限性，P.安德森二突变线可以生成传播。P. 安德森尼的树木是有毒的和风授2。这意味着，每个转基因线需要纵，这样，男性和女性的花朵产生在一个个人，并随后种植，这样，交叉授粉不会发生。由于P.andersonii是一种快速生长的树，它需要大量的空间在热带温室（28°C，约85%的相对湿度）。因此，尽管在技术上是可能的，但P.安德森尼转基因线的生成传播在后勤上具有挑战性。
在协议部分，我们描述了P.安德森一的3种点缀方法。板和袋系统的优点是，根很容易获得，这可能允许细菌的点接种和随后结核的形成随着时间的推移。然而，板材系统相当劳动密集型，因此不太适合进行大规模的结点实验。袋系统的一个缺点是很难防止真菌污染。袋不是无菌的，因此真菌生长经常在袋的上半部分观察到。然而，这不会影响P.安德森生长，因此不会干扰结结测定。此外，袋系统仅适用于幼苗。尽管进行了几次尝试，我们还是无法种植通过体外繁殖在袋中获得的植物。
与现有的基于根系的根转化方法11相比，这里描述的P.andersonii反向遗传学管道提供了实质性的改进。使用所述程序，可以有效地生成稳定的转基因线，并通过体外繁殖保持。相反，根茎转化是短暂的，只会导致转基因根的形成。由于每个转基因根由独立转化产生，基于根系基因转化的A.根基因转化具有大量型型变异。这种变化在稳定线的情况下要小得多，尽管体外传播也会产生某种程度的变异。由于这种减少的变异和每个稳定线可以表型的多个植物，与A.根茎转化根相比，稳定线更适合定量测定。此外，稳定的转化不依赖于A.根诱导位点（罗尔）的引入，影响内源激素平衡15。因此，与A.根系转化根相比，稳定线更适合对参与激素平衡的基因进行反向遗传分析。P. andersonii作为研究模型的一个更普遍的优势是，它最近没有经历全基因组复制（WGD）。豆类帕皮利奥尼亚亚家族，其中包括模型豆类M.truncatula和L.japonicus，以及萨拉卡凯（订单马尔皮希亚莱斯），其中包括模型树波普卢斯三乔卡帕经验丰富的WGDs#65百万年前36，37。这些WGD产生的许多寄生基因拷贝被保存在M.truncatula，L.japonicus和P.trichocarpa37，38，39的基因组中，这创造了冗余，这可能会使反向遗传分析复杂化。由于P.安德森未经历最近的WGD，对P.安德森尼的反向基因分析可能较少受到寄生基因副本冗余功能的影响。
综合起来，我们提供了一个详细的方案，反向遗传分析在P.安德森ii。使用该协议，可以在2-3个月的10的时间内有效地生成单突变线。该协议可以扩展，通过同时针对不同基因的sgRNA的多路复用来产生更高阶的突变体，如其他植物物种40、41、42所示。此外，此处描述的稳定转换过程不仅限于 CRISPR/Cas9 基因靶向，但也可用于引入其他类型的构造（例如，用于启动器-报告器检测、异位表达或转-补充）。我们建立了P.andersonii作为一种比较研究模型，以研究与固氮性rhizobia或内霉菌的共生共生。然而，这里描述的协议也提供了工具，研究该热带树的生物学的其他方面，如木材形成，双性花的发展或卡纳巴塞特异性二次代谢物的生物合成。

帕拉斯波尼亚安德森尼是属于大麻家族（大麻）的热带树，原产于巴布亚新几内亚和几个太平洋岛屿1，2，3。连同另外4个寄生虫物种，它代表了唯一能与根瘤建立固氮结核共生的非豆类血统。这种共生症在豆类（Fabaceae）模型中得到了很好的研究，即Medicago截断和莲花的黄斑，从而获得了关于结核形成和功能4的分子遗传特性的详细知识。此外，据证明，根结核共生在豆类是建立在更古老，和广泛的眼膜霉菌共生5。植物基因组比较表明，豆类、帕拉斯波尼亚以及寄生菌的固氮结核共生，以及所谓的含有二氮营养法兰卡细菌的actininhizal植物物种，具有共同的进化起源6，7，8.为了确定被确定为与豆类结核形成有关的基因是否是保守遗传基础的一部分，对非豆类物种的研究是必不可少的。为此，我们建议利用P.andersonii作为比较研究模型，与豆类一起，确定根结核形成和功能背后的核心遗传网络。
P. 安德森尼是一个先驱，可以在火山山的山坡上找到。它每月可以达到45厘米的生长速度，达到10米9的长度。P. 安德森尼树是风授，这是由形成单独的男性和女性花3，10。我们最近对P.andersonii的二倍体基因组（2n = 20;560 Mb/1C）进行了测序和批选，并收集了另外2个寄生虫物种的基因组序列草案;P. 硬地加和P.鲁戈萨6。这揭示了#35，000 P. 安德森尼基因模型，可以聚集在 >20，000 正交组与基因一起从M. 截管，大豆 （甘氨酸最大），阿拉伯拟丽多普西斯 thaliana，林地草莓 （弗拉加里亚维斯卡），特雷马东方，黑棉杨树 （波普斯三乔卡帕） 和紫杉树 （紫杉树大）6。此外，M.truncatula和P.Andersonii之间的转录组比较确定了一组290个假定矫形器，显示两个物种6的结节增强表达模式。这为比较研究提供了极好的资源。
为了研究P.安德森基根和结核的基因功能，建立了11个农业细菌根系介根转化方案。利用该协议，在较短的时间内生成具有转基因根的复合植物。该方法在豆类共生研究12、13、14中也得到了广泛的应用。然而，这种方法的缺点是，只有根被转换，并且每个转基因根代表一个独立的转化事件，导致大量变化。此外，变换是瞬态的，转基因线无法维持。这使得基于根系的根转化不太适合CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。此外，Rhizo基因将其根诱导位点（rol）基因转移到植物基因组，该基因组曾经表示干扰激素平衡15。这使得研究植物激素在A.根系转化根中的作用具有挑战性。为了克服这些限制，我们最近开发了一种基于农业细菌的基于肿瘤的转化和P.andersonii10的CRISPR/Cas9介导诱变的突变的规程。
在这里，我们提供了一个详细的描述，基于A.tumefaciens的转换过程和反向遗传学管道开发的P.安德森。此外，我们还为转基因植物的下游处理提供方案，包括研究共生相互作用的测定。使用此处描述的协议，可在 2-3 个月内生成多条转基因线。结合CRISPR/Cas9介导的诱变，这允许高效生成敲除突变线。这些突变线可以在体外10、16、17中植物性繁殖，这允许在转化过程后4个月内生成足够的物质，以开始表型表征特征已启动10。总之，这套程序应该允许任何实验室采用P.andersonii作为研究模型，旨在了解根索比菌和霉菌的关联，以及这种热带树生物学的潜在其他方面。

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

帕拉斯波尼亚安德森是一种快速生长的热带树，属于大麻家族（大麻）。与另外4个物种一起，它形成了唯一已知的非豆类血统，能够建立氮固定结核共生与rhizobium。豆类和P.安德森尼之间的比较研究可以为根结核形成背后的遗传网络提供有价值的见解。为了便于比较研究，我们最近对P.andersonii基因组进行了测序，并建立了以肿瘤为介导的农业细菌，以及基于CRISPR/Cas9的基因组编辑。在这里，我们提供了一个详细的描述，为P.安德森ii开发的转换和基因组编辑程序。此外，我们描述了种子发芽和共生表型表型表征的过程。使用该协议，可在2-3个月内生成稳定的转基因突变线。T0转基因系的植物体外繁殖允许在A.tumefaciens共同培养后4个月开始出型化实验。因此，该协议只比P.andersonii可用的基于根基因的瞬态农业细菌根转化方法稍长，尽管提供了几个明显的优点。总之，这里描述的程序允许P.andersonii被用作研究模型，旨在了解共生结系以及这种热带树生物学的潜在其他方面。

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

寄生虫树是一种快速生长的热带树，属于大麻家族（大麻），可以形成固氮根结节与rhizobium。在这里，我们描述了基于农业细菌-肿瘤介导的稳定转化和CRISPR/Cas9基于基因组编辑的P.andersonii中反向遗传分析的详细方案。

转化、基因组编辑和拟合氮的热带大麻树帕拉斯波尼亚安德森

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

帕拉斯波尼亚是一种热带树从大麻家族，能够建立一个氮固定共生与rhizobium。帕拉斯波尼亚和豆类之间的比较研究可以为研究根共生的核心遗传网络提供见解。有了这个协议，帕拉斯帕尼亚安德森尼稳定的转基因突变线可以在两到三个月内产生。这些线可以通过体外传播有效地传播。该协议提供了一个实验平台，研究根系共生以及该热带树生物学的其他方面。组织培养和分子克隆的基本技能足以实施此协议。这使得任何实验室都能够将帕拉斯波尼亚作为研究模型。演示该程序将由博士生蒂蒂斯·瓦尔达尼和尤达·罗斯万贾亚以及我们实验室的技术人员玛丽克·哈托格一起演示。要种植帕拉斯波尼亚安德森树，首先发芽的种子。通过摩擦茶筛内部或压在一张纸巾上，从帕拉斯波尼亚浆果中去除种子。使用4%次氯酸盐漂白剂消毒种子15至20分钟，然后用消毒水清洗种子6次。将种子转移到无菌的200微升PCR管中，用消毒水填充管子以淹没种子。根据手稿指示，在热循环器中孵育管10天。经过10天的孵育，将种子转移到SH-0板，并关闭他们两层弹性密封箔，以防止干燥。在28摄氏度下孵育，白天16小时，夜间周期为3至4周。一旦幼苗发展出第一组真叶，将它们转移到装满商业盆栽的盆栽，并覆盖他们一个半透明的塑料杯，以防止干燥。将锅放在28摄氏度、85%的相对湿度气候室或温室中，在16小时白天，8小时夜间的气候下。一周后，取出塑料杯。定期给锅浇水，补充肥料来维持树木的生长。通过从温室种植的树木中收获五到八厘米的年轻树枝来准备改造，确保只使用健康的、未受感染的树枝。切掉叶子，在每个小动物的末尾留下一厘米平方的叶子组织。用含有几滴多糖酸酯20的2%次氯酸盐漂白剂对组织进行15分钟的消毒，然后用自洗水冲洗8次。将25毫升的渗透介质中再悬浮的农业细菌细胞的光学密度约为5。将茎和宠物组织切成细胞悬浮液内的一厘米碎片。取出叶组织，孵育细胞悬浮液中的茎和小片，10至30分钟。将纸巾片擦干无菌滤纸，并放在根据手稿指示准备的生根介质上。在黑暗中孵育板在21摄氏度，两天。两天后，检查板材有无真菌或细菌污染，并丢弃受污染的板材。将组织片段转移到10毫升SH-10培养的根据手稿指示准备。将组织留在培养器中至少10分钟，每两到三分钟轻轻搅拌一次进行清洗。根据手稿指示准备用 cefotaxime 和 kanamycin 的根介质， 并倒板。干燥无菌滤纸上的组织，然后转移到板上。在16小时白天，8小时夜间的方案下，在28摄氏度下孵育7天。每两天检查一次真菌或细菌污染的板。如果发生污染，将未受感染的组织件转移到新鲜板中。七天后，将组织片段转移到根据手稿指示准备的传播介质，并在28摄氏度下在16小时白天、8小时夜间的培养下孵育。每周刷新一次板，直到转基因芽发展，确保只将未受感染的组织片转移到新的盘子。一旦放生转基因芽至少一厘米长，切开芽，并在抗生素的传播媒介中独立培养。为了确保拍摄代表独立的变换者，仅从外植的每一侧拍摄一次。通过将大约 10 个芽放在新的传播介质板上，用两层弹性密封箔关闭板来传播组织。在16小时白天，8小时夜间的方案下，在28摄氏度下孵育盘子，每四周重复一次这一步骤。当芽达到一厘米长时，切开它们在基地，并把它们放在根介质上。通过将射片的基底尖端插入介质，将射片竖直放置。一个板上可以放置大约 10 个芽。首先准备铀。从一个多发性BOR2的单一群落中接种10毫升的液体YEM介质，并在28摄氏度下孵育两天。使用此培养剂为较大体积的液体 YEM 介质接种。一旦生长，将细菌培养在3，500倍g下离心10分钟，以收获细胞。将细菌颗粒重新悬浮在液体EKM介质中，并确定光学密度。准备三升EKM介质，这足以约20盆，并接种与rhizobial悬浮液。将介质与 1.25 千克微石混合，并将 210 克这种混合物加入无菌半透明聚丙烯罐中。将一到三个帕拉斯波尼亚安德森植物植物种植到每个盆中，并准备几个盆，用控制结构进行转化。称重几个锅，并覆盖每个锅的底部，以保护根免受光照射。在16小时、8小时夜间的高温下，在28摄氏度的气候生长室中孵育盆，为期4至6周。每周一次，称几壶来确定水损失。如果水损失超过10毫升，补充超纯水，以弥补损失。孵育后，从白石中清洁根部，并使用双筒望远镜确定结核数。该技术已被用来成功地转化了帕拉斯波尼亚安德森茎与农业细菌株AGL1的皮奥耳和部分。首先，组织外植与农业细菌共同培养两天。长时间的共培养会导致细菌过度殖民化，应防止这种过度培养。几周后，沿着原来的伤口表面观察到小的绿色微卡利。这些卡利继续增长和开发一个或多个经过改造的芽，在六到八周后开始转换。从成熟分支的组织外植到 65 到 75% 的年轻和快速增长的分支的组织外植，转化效率从 10% 到 30% 不等。转基因芽可以通过体外繁殖成倍增加，在一个月内产生数十种芽。这些芽可以放在根介质上，在两周内诱导根的形成，并产生可用于实验的植物。在开始稳定的变换实验时，选择健康的分支作为源材料非常重要。帕拉斯波尼亚T0转基因线在体外传播。因此，必须彻底基因型帕拉斯波尼亚转基因线。建立帕拉斯波尼亚作为实验模型允许比较分析两个遥远的相关的结点血统，帕拉斯波尼亚和豆类。这可以识别保存遗传网络的基础rhizobium共生。帕拉斯波尼亚也可以是研究其他研究课题的宝贵模型，如木材形成、双性恋花卉的发展，或卡纳巴西特异性二次代谢物的生物合成。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

通过DNA含量测定的哺乳动物复制时序的全基因组的测定

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

科研

遗传学

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

使用生物素化补骨脂素全球定位RNA-RNA相互作用

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

基因组编辑和hPSCs定向分化为胰腺癌发展讯问谱系行列式

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 和 SsODN 在人细胞中催化点突变修复功能的标准方法研究

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

增强基因组编辑与 Cas9 Ribonucleoprotein 在不同的细胞和有机体

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 基因编辑制作人类疟疾寄生虫的条件突变体

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

反向转录-环介导的等温放大 (RT 灯) 测定尿液、血清和蚊子标本中的 Zika 病毒和管家基因

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

crispr 介导的人类真菌病原体白色念珠菌基因组编辑

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

利用 Crispr-ca 在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

使用无缝基因组编辑将点突变引入人类多能干细胞

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...