Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Mark youles, Sophien Kamoun og Sylvestre Marillonnet for at gøre Golden Gate klonings dele tilgængelige via Addgene-databasen. Derudover vil vi gerne takke E. James, P. Hadobas og T. J. Higgens for p. andersonii Seeds. Dette arbejde blev støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-åben konkurrence tilskud 819.01.007) og ministeriet for forskning, teknologi og videregående uddannelse i Republikken Indonesien (RISET-PRO Grant 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Bælgplanter og den distantly-relaterede cannabaceae slægten parasponia repræsenterer de eneste to clader af plantearter, der er i stand til at etablere et endosymbiotisk forhold til kvælstofbindende rhizobia og danne rodknuder. Sammenlignende undersøgelser mellem arter af begge clader er yderst relevante for at give indsigt i de centrale genetiske netværk, der muliggør denne symbiose. I øjeblikket udføres genetiske undersøgelser hovedsagelig i bælgplanter; især de to model arter M. truncatula og L. japonicus. For at give en ekstra eksperimentel platform og lette sammenlignende undersøgelser med en nodulating ikke-bælgfrugter, vi beskriver her en detaljeret protokol for stabil omdannelse og omvendte genetiske analyser i P. andersonii. Den præsenterede protokol bruger in vitro-formering af T0 transgene P. andersonii linjer, så fænotypiske analyse skal påbegyndes inden for 4 måneder efter en. tumefaciens Co-dyrkning. Dette er væsentligt hurtigere end de nuværende protokoller, der er blevet etableret for stabil omdannelse af bælgplanter33. Dette gør P. andersonii en attraktiv forskningsmodel.
Den protokol, der er beskrevet her, indeholder flere kritiske trin. Det første vedrører frøspire evnen. For at forberede P. andersonii frø til spiring, frø skal isoleres fra bærrene. Dette gøres ved at gnide bærrene på et stykke silkepapir eller mod indersiden af en te sigte. Denne procedure skal udføres forsigtigt for at forhindre beskadigelse af frøfrakke. Hvis frøbelægningen bliver beskadiget, kan blegemiddel trænge ind i frøet under steriliseringen, hvilket reducerer frøenes levedygtighed. For at bryde frø dormancy, frø er udsat for en 10-dages temperaturcyklus. Men på trods af denne behandling, spiring er ikke helt synkroniseret. Generelt, de første frø viser af fremkomsten efter 7 dage, men andre kan tage flere dage længere tid at spire.
Kritiske punkter i Transformations proceduren vedrører valget af udgangsmaterialet og varigheden af det fælles dyrknings trin. For at opnå en effektiv transformation er det bedst at bruge sunde og unge stilke eller petioler af ikke-sterile væksthusplanter som udgangsmateriale. For at inducere væksten af unge grene, er det tilrådeligt at trimme Parasponia træer hver 2-3 måneder og genopfriske træer en gang om året. Derudover skal Co-dyrkning trin kun udføres i 2 dage. Forlænget Co-dyrkning fremmer over kolonisering af vævs bruskeksplantater af A. tumefaciens og reducerer generelt Transformations effektiviteten. For at forhindre over kolonisering af A. tumefaciens er det også vigtigt regelmæssigt at opdatere de plader, som explanterne dyrkes på. Hvis der forekommer over kolonisering, kan vævs bruskeksplantater vaskes (Se afsnit 3,8) for at fjerne en. tumefaciens -celler. Vi anbefaler at tilføje blegemiddel til SH-10 opløsning, der anvendes til vask (endelig koncentration: ~ 2% hypochlorit). Det er vigtigt at bemærke, at dette ekstra vaske trin måske ikke virker på stærkt inficerede bruskeksplantater (figur 2b). Hvis en omdannelse med en CRISPR/Cas9-konstruktion kun giver et begrænset antal putativt transformerede skud, eller hvis mutagenese af et bestemt gen forventes at give problemer i regenerering, tilrådes det at inkludere en tom vektorkontrol konstruktion som den positive kontrol. Endelig er det vigtigt at sikre, at alle transgene linjer, der udvælges, er et resultat af uafhængige T-DNA-integrations hændelser. Derfor, vi instruere til at tage kun en enkelt putativt-transgene skyde fra hver side af en explant. Men vi indser, at dette reducerer det potentielle antal uafhængige linjer. Hvis mange linjer er nødvendige, forskerne kunne beslutte at adskille putativt forvandlet Calli fra de oprindelige bruskeksplantater, når disse Calli er ≥ 2 mm i størrelse og kultur disse Calli selvstændigt. På denne måde kan flere linjer isoleres fra hver explant, hvilket øger antallet af potentielle transgene linjer.
I den nuværende protokol, transgene linjer af P. andersonii er formeret vegetativt gennem in vitro-formering. Fordelen ved dette er, at mange transgene plantlets kan genereres i en relativt kort tidsperiode. Men, denne metode har også flere begrænsninger. For det første er vedligeholdelsen af T0 transgene linjer gennem in vitro-formering arbejdskraftintensiv og kan resultere i uønskede genetiske eller epigenetiske ændringer34,35. For det andet indeholder T0 linjer stadig en kopi af t-DNA, herunder antibiotikaresistens kassetten. Dette begrænser antallet af mulige re-transformationer, da der kræves forskellige markerings markører for hver re-transformation. I øjeblikket har vi kun testet transformation ved hjælp af kanamycin eller hygromycin udvælgelse (data ikke vist). Desuden komplicerer tilstedeværelsen af Cas9-kodnings sekvensen og sgRNAs i T0 transgene Lines komplementerings undersøgelser. Komplementerings analyser er mulige, men kræver, at sgRNA-målstedet (-erne) muterer som sådan, at genredigering af komplementerings konstruktionen forhindres. For det tredje er en ulempe ved at arbejde med T0 linjer, at crispr/Cas9 mutanter kan være chimerisk. For at forhindre fænotypisk analyse af chimeriske mutante linjer anbefaler vi at gentage genotypebestemmelse analysen efter in vitro-formering på mindst 3 forskellige skud. Selv om antallet af kimerisk mutanter opnået ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, er begrænset, er de lejlighedsvis observeret10. For at overvinde begrænsningerne ved at arbejde med T0 linjer, kan P. andersonii mutant linjer formes generativt. P. andersonii træer er Tvebo og vind-Bestøvlede2. Det betyder, at hver transgene linje skal manipuleres som sådan, at de mandlige og kvindelige blomster produceres på en enkelt person, og efterfølgende dyrkes som sådan, at krydsbestøvning ikke forekommer. Da P. andersonii er et hurtigtvoksende træ, kræver det en betydelig mængde plads i et tropisk drivhus (28 °c, ~ 85% relativ luftfugtighed). Selv om det er teknisk muligt, er generativ formering af P. andersonii transgene linjer derfor logistisk udfordrende.
I afsnittet protokol, vi beskrev 3 metoder til nodulation af P. andersonii. Fordelen ved pladen og pose systemer er, at rødderne er let tilgængelige, hvilket kan tillade spot-inokulering af bakterier og efter knudedannelse over tid. Men pladesystemet er ganske arbejdskraftintensivt, hvilket gør det mindre velegnet til store nodulation eksperimenter. En ulempe ved pose systemet er, at det er vanskeligt at forhindre svampe kontaminering. Poser er ikke sterile, og derfor observeres svampevækst ofte på den øverste halvdel af posen. Men, dette påvirker ikke P. andersonii vækst, og derfor ikke interferere med nodulation assays. Desuden er pose systemet kun egnet til frøplanter. Trods flere forsøg, har vi været i stand til at dyrke plantlets opnået gennem in vitro-formering i poser.
Den P. andersonii reverse genetik pipeline beskrevet her tilbyder en væsentlig forbedring i forhold til den eksisterende a. rhizogenes-baserede root transformation metode11. Ved hjælp af de beskrevne procedurer kan stabile transgene linjer genereres effektivt og kan vedligeholdes via in vitro-formering. I modsætning hertil er A. rhizogenes transformation forbigående og resulterer kun i dannelsen af transgene rødder. Fordi hver transgene rod resultater fra en uafhængig transformation, A. rhizogenes transformation-baserede assays lider af betydelig fænotypiske variation. Denne variation er meget mindre i tilfælde af stabile linjer, selv om in vitro-formering også skaber en vis grad af variation. På grund af denne reducerede variation og det faktum, at flere plantlets kunne fænoskrives for hver stabil linje, er stabile linjer mere velegnede til kvantitative assays sammenlignet med A. rhizogenes-transformerede rødder. Desuden er den stabile transformation ikke afhænger af indførelsen af a. rhizogenes root inducerende locus (ROL), der påvirker den endogene hormon balance15. Derfor er stabile linjer bedre egnet til omvendt genetisk analyse af gener, der er involveret i hormon homøostase sammenlignet med A. rhizogenes-transformerede rødder. En mere generel fordel ved P. andersonii som forskningsmodel er, at det ikke oplevede en nylig hel genom duplikering (wgd). Bælgplanter papilionoideae subfamily, som omfatter modellen bælgfrugter M. truncatula og L. japonicus, samt Salicaceae (Order malpighiales), der omfatter modeltræet Populus Balsampoppel erfarne wgds ~ 65 millioner år siden36,37. Mange parallogous geneksemplarer som følge af disse wgd'er bevares i genomer af M. truncatula, L. japonicus og P. Balsampoppel37,38,39, som skaber redundans, der kan komplicere omvendte genetiske analyser. Da p. andersonii ikke oplevede en nylig wgd, omvendte genetiske analyser på P. andersonii kan være mindre påvirket af overflødig funktion af paralogous genkopier.
Tilsammen giver vi en detaljeret protokol for omvendt genetisk analyse i P. andersonii. Ved hjælp af denne protokol, enkelt mutant linjer kan genereres effektivt i en tidsramme på 2-3 måneder10. Denne protokol kan udvides til at skabe højere orden mutanter gennem multiplexing af sgrnas målretning forskellige gener samtidigt, som vist for andre plantearter40,41,42. Desuden er den stabile Transformations procedure, der er beskrevet her, ikke begrænset til CRISPR/Cas9-genmålretning, men kan også bruges til at introducere andre typer konstruktioner (f. eks. til promotor-reporter-assays, Ektopisk udtryk eller Trans- komplementering). Vi etablerede P. andersonii som en komparativ forskningsmodel til at studere gensidige symbioser med kvælstof bindingen rhizobia eller endomycorrhizal svampe. Men de protokoller, der er beskrevet her, indeholder også værktøjer til at studere andre aspekter af biologien i dette tropiske træ, såsom trædannelse, udvikling af biseksuelle blomster eller biosyntesen af Cannabaceae-specifikke sekundære metabolitter.

Parasponia andersonii er et tropisk træ, der tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og er hjemmehørende i Papua Ny Guinea og flere Stillehavs øer1,2,3. Sammen med 4 yderligere parasponia arter, det repræsenterer den eneste ikke-bælgfrugter afstamning, der kan etablere en nitrogen-Fixing knude symbiose med rhizobia. Denne symbiose er godt undersøgt i bælgplanter (Fabaceae) modeller Medicago truncatula og Lotus japonicus, hvilket har resulteret i at erhverve detaljeret viden om den molekylære genetiske karakter af knudedannelse og fungerende4. Desuden, det blev påvist, at roden knude symbiose i bælgplanter er baseret på den meget ældre, og udbredt arbuskulær mykorrhizal symbiose5. Phylogenomic sammenligninger tyder på, at kvælstof-fastsættelse knude symbioser af bælgfrugter, parasponia, samt, de såkaldte actinorhizal plantearter, der er vært diazotrofe Frankia bakterier, har en fælles evolutionær oprindelse 6,7,8. For at afgøre, om de gener, der identificeres for at være involveret i dannelsen af bælgplanter, er den del af et bevaret genetisk grundlag, er undersøgelser af ikke-bælgplanter afgørende. Til dette formål foreslår vi at bruge P. andersonii som en komparativ forskningsmodel, sammen med bælgplanter, for at identificere de centrale genetiske netværk underliggende rod knuder dannelse og funktion.
P. andersonii er en pioner, der kan findes på skråningerne af vulkanske bakker. Det kan opfylde væksthastigheder på 45 cm pr. måned og nå længder på op til 10 meter9. P. andersonii træer er vind-Bestøvlede, som lettes ved dannelsen af separate mandlige og kvindelige blomster3,10. Vi har for nylig sekvenseret og kommenteret diploide genom (2n = 20; 560 MB/1C) af P. andersonii, og samlet udkast genom sekvenser af 2 yderligere parasponia arter; P. Rigida og p. af6. Dette afslørede ~ 35.000 P. andersonii gene modeller, der kan grupperes i > 20000 ortogrupper sammen med gener fra M. truncatula, sojabønner (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Skovjordbær ( Af Fragaria vesca), trema orientalis, sort bomulds poppel (Populus Balsampoppel) og eucalypt (Eucalyptus Grandis)6. Derudover identificerede transkriptomsammenligninger mellem M. truncatula og P. andersonii et sæt 290 formodede orthologues, der viser et nodule-forstærket udtryks mønster i begge arter6. Dette giver en glimrende ressource til sammenlignende undersøgelser.
For at studere genet funktion i P. andersonii rødder og knuder, en protokol for Agrobacterium rhizogenes-medieret root transformation er blevet etableret11. Ved hjælp af denne protokol, sammensatte planter, der bærer transgene rødder kan genereres i en relativt kort tidsramme. Denne metode anvendes også i vid udstrækning i bælgfrugter-Symbiosis forskning12,13,14. Ulempen ved denne metode er imidlertid, at kun rødder omdannes, og at hver transgene rod repræsenterer en uafhængig transformationsbegivenhed, hvilket resulterer i betydelige variationer. Omdannelsen er også forbigående, og transgene linjer kan ikke opretholdes. Dette gør en. rhizogenes-baserede root transformation mindre VELEGNET til crispr/Cas9-mediated genomredigering. Desuden, A. rhizogenes overfører sin root inducerende locus (ROL) gener til planten genom, som engang udtrykte interferere med hormon homøostase15. Dette gør at studere rollen som plante hormoner i en. rhizogenes-forvandlet rødder udfordrende. For at overvinde disse begrænsninger, har vi for nylig udviklet en protokol for Agrobacterium tumefaciens-baseret transformation og Crispr/Cas9-medieret mutagenese af P. andersonii10.
Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den a. tumefaciens-baserede Transformations procedure og reverse Genetics pipeline udviklet til P. andersonii. Derudover tilbyder vi protokoller for downstream håndtering af transgene plantlets, herunder analyser til at studere symbiotiske interaktioner. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, kan der genereres flere transgene linjer i en 2-3 måneders periode. I kombination med CRISPR/Cas9-medieret mutagenese, dette giver en effektiv generation af knockout mutant linjer. Disse mutante linjer kan være vegetativt formeret in vitro10,16,17, hvilket gør det muligt at fremføre tilstrækkeligt materiale til at starte fænotypisk karakterisering 4 måneder efter, at Transformations proceduren har påbegyndt10. Sammen, dette sæt af procedurer bør tillade enhver Lab til at vedtage P. andersonii som en forskningsmodel for undersøgelser med henblik på at forstå rhizobial og mykorrhizasvampene foreninger, samt potentielt andre aspekter af biologi af dette tropiske træ.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii er et hurtigtvoksende tropisk træ, der tilhører cannabis familien (Cannabaceae). Sammen med 4 yderligere arter, det danner den eneste kendte ikke-bælg sig afstamning i stand til at etablere en kvælstof-fastsættelse knude symbiose med Rhizobium. Sammenlignende undersøgelser mellem bælgplanter og P. andersonii kunne give værdifuld indsigt i de genetiske netværk underliggende rod knudedannelse. For at lette sammenlignende undersøgelser, vi for nylig sekvenseret P. andersonii genom og etablerede Agrobacterium tumefaciens-mediated stabil transformation og crispr/Cas9-baserede genomredigering. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af transformations-og genomredigeringsprocedurerne, der er udviklet til P. andersonii. Derudover beskriver vi procedurer for frøspire evne og karakterisering af symbiotiske fænotyper. Ved hjælp af denne protokol kan stabile transgene mutant linjer genereres i en periode på 2-3 måneder. Vegetativ in vitro-formering af T0 transgene linjer gør det muligt at initiere fænotypebestemmelse-eksperimenter 4 måneder efter Co-dyrkning af en. tumefaciens . Derfor, denne protokol tager kun marginalt længere end den forbigående Agrobacterium rhizogenes-baserede root transformation metode til rådighed for P. andersonii, men tilbyder flere klare fordele. Sammen, de procedurer, der er beskrevet her tillader P. andersonii at blive brugt som en forskningsmodel for undersøgelser med henblik på at forstå symbiotiske foreninger samt potentielt andre aspekter af biologi af dette tropiske træ.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii er et hurtigtvoksende tropisk træ, der tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og kan danne kvælstofbindende rodknuder i forbindelse med Rhizobium. Her beskriver vi en detaljeret protokol for omvendte genetiske analyser i P. andersonii baseret på Agrobacterium tumefaciens-mediated stabil transformation og crispr/Cas9-baseret genomredigering.

Omdanne, genomredigering og Phenotyping kvælstofbindende tropisk Cannabaceae træ Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia er et tropisk træ fra Cannabis familien, der er i stand til at etablere en kvælstof-fastsættelse symbiose med rhizobium. Sammenlignende undersøgelser mellem Parasponia og bælgfrugter kunne give indsigt i de centrale genetiske netværk, der ligger til grund for rhizobium symbiose. Med denne protokol kan Parasponia andersonii stabile transgene mutant linjer genereres i en periode på to til tre måneder.Disse linjer kan effektivt formeres gennem in vitro formering. Denne protokol giver en eksperimentel platform til at studere rhizobial symbiose samt andre aspekter af biologi af dette tropiske træ. Grundlæggende færdigheder i vævskultur og molekylær kloning er tilstrækkelige til at gennemføre denne protokol.Dette gør det muligt for ethvert laboratorium at tilpasse Parasponia som forskningsmodel. Demonstration af proceduren vil være ph.d.-studerende Titis Wardhani og Yuda Roswanjaya sammen med Marijke Hartog, en tekniker i vores laboratorium. At vokse Parasponia andersonii træer, begynde med at spire frøene.Fjern frøene fra Parasponia bær ved at gnide mod indersiden af en te sigte eller squashing dem på et stykke silkepapir. Desinficere frø ved hjælp af 4% hypochlorit blegemiddel i 15 til 20 minutter, og derefter vaske frøene seks gange med steriliseret vand. Overfør frøene til sterile 200 microliter PCR rør, og fyld rørene med steriliseret vand for at nedsænke frøene.Slangerne inkuberes i 10 dage i en termocyman i henhold til manuskriptretninger. Efter 10-dages inkubation overføres frøene til SH-0-plader, og de lukkes med to lag elastisk tætningsfolie for at undgå tørring. Inkubere ved 28 grader Celsius med en 16-timers-dag, otte-timers-nat cyklus i tre til fire uger.Når planterne udvikle deres første sæt af sande blade, overføre dem til potter fyldt med kommercielle potteplanter jord, og dække dem med en gennemsigtig plastik kop for at forhindre udsnømelse. Placer potterne i en 28-graders Celsius, 85% relativ luftfugtighed klimarum eller drivhus under en 16-timers-dag, otte-timers-nat regime. Efter en uge skal du fjerne plastikkoppen.Regelmæssigt vand potterne, og supplere med gødning til at opretholde trævækst. Forbered dig på transformation ved at høste unge fem til otte centimeter grene fra drivhusdyrkede træer, og sørg for kun at bruge sunde, ikke-inficerede grene. Skær bladene, forlader en centimeter kvadreret af bladvæv i slutningen af hver stilk.Desinficere vævet i 15 minutter med 2% hypochlorit blegemiddel indeholder et par dråber polysorbat 20, og derefter skylles det otte gange med autoklaveret vand. Re-suspendere Agrobacterium celler i 25 milliliter infiltration medium til en optisk tæthed på omkring fem. Skær stilken og stilken væv i en centimeter stykker inde i cellen suspension.Fjern bladvævet og inkuber stilken og stilken stykker i cellen suspension i 10 til 30 minutter. Tør væv stykker på et sterilt stykke filterpapir og læg dem på rode medium udarbejdet i henhold til manuskript retninger. Inkuber pladerne i mørke ved 21 grader Celsius i to dage.Efter de to dage, inspicere pladerne for svampe-eller bakteriel forurening og kassér forurenede plader. Vævsstykkerne overføres til 10 milliliter SH-10-medium, der er fremstillet efter håndskriftsretninger. Lad vævet blive i mediet i mindst 10 minutter, og agit forsigtigt hver to til tre minutter for at vaske.Forbered rode medium med cefotaxime og kanamycin i henhold til manuskriptet retninger, og hæld plader. Tør vævet på sterile stykker filterpapir, og overføre dem til pladerne. Inkuber plader i syv dage ved 28 grader Celsius under en 16-timers-dag, otte-timers-nat regime.Kontroller plader for svampe- eller bakteriekontaminering hver anden dag. Hvis der opstår kontaminering, overføres de ikke-inficerede vævsstykker til en ny plade. Efter syv dage, overføre væv stykker til formering medium udarbejdet i henhold til manuskript retninger og inkubere ved 28 grader Celsius under en 16-timers-dag, otte-timers-nat regime.Genopfriske pladerne en gang om ugen, indtil transgene skud udvikle sig, og sørg for kun at overføre ikke-inficerede væv stykker til nye plader. Når de formodede transgene skud er mindst en centimeter lang, skære skud og kultur dem uafhængigt i formeringsmedium med antibiotika. For at sikre, at skuddene repræsenterer uafhængige transformanter, tage kun en enkelt skyde fra hver side af en explant.Udbrede væv ved at placere omkring 10 skud på en frisk plade af formeringsmedium og lukke pladen med to lag af elastisk forsegling folie. Inkuber pladerne ved 28 grader Celsius under en 16-timers-dag, otte-timers-nat regime, og gentag dette trin hver fjerde uge. Når skuddene nå en centimeter i længden, skære dem på deres base og placere dem på rode medium.Placer skuddene oprejst ved at sætte den basale spids af skuddet ind i mediet. Omkring 10 skud kan placeres på en enkelt plade. Start med at forberede rhizobium inoculum.Inokuler 10 milliliter flydende YEM-medium fra en enkelt koloni af Mesorhizobium plurifarium BOR2, og inkuberes ved 28 grader Celsius i to dage. Brug denne kultur til at vaccinere en større mængde flydende YEM-medium. Når dyrket, centrifuge den bakterielle kultur i 10 minutter ved 3, 500 gange g for at høste cellerne.Re-suspendere bakteriel pellet i flydende EKM medium, og bestemme den optiske tæthed. Forbered tre liter EKM medium, hvilket er nok til omkring 20 potter, og inokulere det med rhizobial suspension. Bland mediet med 1,25 kg perlite, og tilsæt 210 gram af denne blanding til sterile gennemskinnelige polypropylen potter.Plant en til tre Parasponia andersonii plantlets til hver gryde, og forberede flere potter med plantlets omdannet med kontrol konstruktion. Vej flere af potterne, og dække bunden af hver gryde for at beskytte rødderne fra lyseksponering. Inkuber potterne i et klimatiseret vækstrum ved 28 grader Celsius under en 16-timers-dag, otte timers nat regime i fire til seks uger.En gang om ugen, vejer flere potter til at bestemme vandtab. Hvis vandtabet overstiger 10 milliliter, supplere med ultra-rent vand for at kompensere for tabet. Efter inkubationen, rense rødderne fra perlite, og bestemme nodule tal ved hjælp af en kikkert.Denne teknik er blevet brugt til at omdanne stilke og segmenter af Parasponia andersonii stængler med Agrobacterium stamme AGL1. For det første dyrkes vævsudbringningerne sammen med Agrobacterium i to dage. Langvarig co-dyrkning resulterer i bakteriel overkolonisering og bør forebygges.Et par uger senere, små grønne mikro-calli er observeret langs den oprindelige såroverflade. Disse calli fortsætte med at vokse og udvikle en eller flere angiveligt transformeret skud på seks til otte uger efter starten af transformation. Transformation effektivitet varierer fra 10 til 30% for væv explants fra modne grene til 65 til 75% for væv explants fra unge og hurtigt voksende grene.Transgene skud kan ganges gennem in vitro formering, hvilket giver anledning til snesevis af skud inden for en måned. Disse skud kan placeres på rode medium, der vil fremkalde roddannelse i omkring to uger og udbytte planter, der kan bruges til eksperimenter. Når du starter et stabilt transformationseksperiment, er det vigtigt at vælge sunde grene som kildemateriale.Parasponia T0 transgene linjer er formeret in vitro. Derfor er det vigtigt at grundigt genotype Parasponia transgene linjer. Etableringen af Parasponia som en eksperimentel model giver mulighed for sammenlignende analyse mellem to fjernt beslægtede nikkende slægter, Parasponia og bælgfrugter.Dette kunne identificere bevare genetiske netværk underliggende rhizobium symbiose. Parasponia kan også være en værdifuld model til at studere andre forskningsemner såsom trædannelse, udvikling af biseksuelle blomster, eller biosyntesen af Cannabaceae-specifikke sekundære metabolitter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

Genom-dækkende Bestemmelse af pattedyr Replication Timing ved DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

Forbedret genom-redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i forskellige celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

Reverse transkription-Loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) Assay for Zika Virus og husholdning gener i urin, Serum og myg prøver

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

CRISPR-medieret genom-redigering af menneskelige svampe patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

Introduktion af punktmutationer i humane pluripotente stamceller ved hjælp af problemfri genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...