Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii at JoVE.com

De auteurs erkennen Mark Youles, Sophien Kamoun en Sylvestre Marillonnet voor het maken van Golden Gate kloon onderdelen beschikbaar via de Addgene database. Daarnaast willen we E. James, P. Hadobas en T. J. Higgens bedanken voor p. andersonii zaden. Dit werk werd gesteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-open Competition Grant 819.01.007) en het ministerie van onderzoek, technologie en hoger onderwijs van de Republiek Indonesië (RISET-PRO Grant 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Peulvruchten en het verre-gerelateerde Cannabaceae-geslacht Parasponia representeren de enige twee clades van plantensoorten die een endosymbiotische relatie met stikstoffixatie van Rhizobia kunnen vestigen en wortel knobbeltjes vormen. Vergelijkende studies tussen soorten van beide clades zijn zeer relevant om inzicht te geven in de belangrijkste genetische netwerken die deze symbiose mogelijk maken. Momenteel worden genetische studies voornamelijk gedaan in peulvruchten; vooral de twee model soorten M. truncatula en L. japonicus. Om een aanvullend experimenteel platform te bieden en vergelijkende studies te faciliteren met een nodulating non-legume, beschrijven we hier een gedetailleerd protocol voor stabiele transformatie en omgekeerde genetische analyses in P. andersonii. Het gepresenteerde protocol gebruikt in vitro vermeerdering van T0 transgene P. andersonii lijnen, waardoor fenotypische analyse kan worden gestart binnen 4 maanden na A. tumefaciens co-teelt. Dit is aanzienlijk sneller dan de huidige protocollen die zijn vastgesteld voor stabiele transformatie van peulvruchten33. Dit maakt P. andersonii een aantrekkelijk onderzoeksmodel.
Het hier beschreven protocol bevat verschillende kritieke stappen. Het eerste betreft zaadkieming. Om P. andersonii zaden voor kieming voor te bereiden, moeten zaden worden geïsoleerd van de bessen. Dit wordt gedaan door de bessen op een stukje tissuepapier te wrijven of tegen de binnenkant van een theezeef. Deze procedure moet voorzichtig worden uitgevoerd om beschadiging van de zaadmantel te voorkomen. Als de zaadmantel beschadigd raakt, kan bleekmiddel het zaad binnengaan tijdens sterilisatie, wat de levensvatbaarheid van het zaad vermindert. Om zaad Kiemrust te breken, zaden worden onderworpen aan een 10-daagse temperatuur cyclus. Ondanks deze behandeling wordt de kiemkracht echter niet volledig gesynchroniseerd. Over het algemeen tonen de eerste zaden uitstulping opkomst na 7 dagen, maar anderen kunnen enkele dagen langer duren om te ontkiemen.
Kritische punten in de transformatie procedure betreffen de keuze van het uitgangsmateriaal en de duur van de co-teelt stap. Om een efficiënte transformatie te bereiken, is het het beste om gezonde en jonge stengels of petiolen van niet-steriele kas-gekweekte planten als uitgangsmateriaal te gebruiken. Om de groei van jonge takken te stimuleren, is het raadzaam om de Parasponia bomen elke 2-3 maanden te trimmen en de bomen een keer per jaar te verversen. Bovendien moet de co-teelt stap alleen worden uitgevoerd voor 2 dagen. Langdurige co-teelt bevordert de overkolonisatie van weefsel explantaten door A. tumefaciens en vermindert over het algemeen de efficiëntie van de transformatie. Om te voorkomen dat overkolonisatie door A. tumefaciens is het ook belangrijk om regelmatig de platen waarop de explantaten worden geteeld vernieuwen. In het geval dat overkolonisatie optreedt, kunnen weefsel explantaten worden gewassen (zie paragraaf 3,8) om een. tumefaciens cellen te verwijderen. Wij adviseren het toevoegen van bleekwater aan de SH-10 oplossing die wordt gebruikt voor het wassen (uiteindelijke concentratie: ~ 2% hypochloriet). Het is belangrijk op te merken dat deze extra wasstap mogelijk niet werkt op zwaar geïnfecteerde explantaten (Figuur 2b). In het geval dat een transformatie met een CRISPR/Cas9-constructie slechts een beperkt aantal van putge-getransformeerde scheuten oplevert of als mutagenese van een bepaald gen naar verwachting problemen in de regeneratie veroorzaakt, is het raadzaam om een lege Vector controle constructie op te nemen als de positieve controle. Tot slot is het belangrijk ervoor te zorgen dat alle geselecteerde transgene lijnen voortvloeien uit onafhankelijke T-DNA-integratie gebeurtenissen. Daarom geven we opdracht om slechts één putatief-transgene shoot van elke kant van een explant te nemen. We beseffen echter dat dit het potentiële aantal onafhankelijke lijnen vermindert. Als er veel lijnen nodig zijn, kunnen onderzoekers besluiten om putatief getransformeerde Calli van de oorspronkelijke explantaten te scheiden wanneer deze Calli ≥ 2 mm groot zijn en deze Calli onafhankelijk van elkaar. Op deze manier kunnen meerdere lijnen worden geïsoleerd van elke explant, wat het aantal potentiële transgene lijnen verhoogt.
In het huidige protocol worden transgene lijnen van P. andersonii vegetatief vermeerderd door middel van in vitro vermeerdering. Het voordeel hiervan is dat veel transgene plantlets in een relatief korte tijdsperiode kunnen worden gegenereerd. Deze methode heeft echter ook een aantal beperkingen. Ten eerste, het onderhoud van T0 transgene lijnen door in vitro propagatie is arbeidsintensief en kan resulteren in ongewenste genetische of epigenetische wijzigingen34,35. Ten tweede bevatten T0 -lijnen nog steeds een kopie van het T-DNA, inclusief de antibioticaresistentie cassette. Dit beperkt het aantal mogelijke hertransformaties, omdat er voor elke hertransformatie verschillende selectiemarkeringen nodig zijn. Momenteel hebben we alleen transformatie getest met behulp van kanamycine of hygromycine selectie (gegevens niet weergegeven). Bovendien compliceert de aanwezigheid van de Cas9-encoding sequentie en sgRNAs in de T0 transgene lijnen complementatie studies. Complementatie testen zijn mogelijk, maar vereisen dat de sgRNA doelsite (s) als zodanig worden gemuleerd dat genbewerking van de complementatie constructie wordt voorkomen. Ten derde, een nadeel van het werken met T0 lijnen is dat crispr/Cas9 mutanten misschien Chimeric. Om fenotypische analyse van chimeer Mutant Lines te voorkomen, raden we aan om de genotypering te herhalen na in vitro vermeerdering op minstens 3 verschillende scheuten. Hoewel, het aantal chimeer mutanten verkregen met behulp van het protocol hier beschreven is beperkt, ze worden soms waargenomen10. Om de beperkingen van het werken met T0 lijnen te overwinnen, konden P. andersonii mutanten lijnen generatief worden vermeerderd. P. andersonii bomen zijn tweehuizig en wind-bestuikte2. Dit betekent dat elke transgene lijn zo moet worden gemanipuleerd dat mannelijke en vrouwelijke bloemen worden geproduceerd op één individu, en vervolgens als zodanig worden gekweekt dat kruisbestuiving niet optreedt. Aangezien P. andersonii een snel groeiende boom is, is er een aanzienlijke hoeveelheid ruimte nodig in een tropische kas (28 °c, ~ 85% relatieve vochtigheid). Daarom, hoewel technisch mogelijk, generatieve voortplanting van P. andersonii transgene lijnen is logistisch uitdagend.
In het protocol sectie, we beschreven 3 methoden voor is van P. andersonii. Het voordeel van de plaat-en Pouch-systemen is dat de wortels gemakkelijk toegankelijk zijn, wat de spot-inoculatie van bacteriën mogelijk maakt en de knobbel vorming na verloop van tijd kan volgen. Het plaat systeem is echter vrij arbeidsintensief, waardoor het minder geschikt is voor grootschalige is experimenten. Een nadeel van het buidel systeem is dat het moeilijk is om schimmel besmetting te voorkomen. Zakjes zijn niet steriel en daarom wordt schimmelgroei vaak waargenomen op de bovenste helft van het opvangzakje. Echter, dit heeft geen invloed op P. andersonii groei, en daarom niet interfereren met is testen. Bovendien is het opvangsysteem alleen geschikt voor zaailingen. Ondanks verschillende pogingen hebben we geen plantlets kunnen kweken die verkregen zijn door in vitro voortplanting in zakjes.
De P. andersonii reverse genetica pijpleiding beschreven hier biedt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de bestaande a. rhizogenesgebaseerde root transformatie methode11. Met behulp van de beschreven procedures kunnen stabiele transgene lijnen efficiënt worden gegenereerd en kunnen worden gehandhaafd via in-vitro vermeerdering. Daarentegen, A. rhizogenes transformatie is van voorbijgaande aard en resulteert alleen in de vorming van transgene wortels. Omdat elke transgene wortel voortvloeit uit een onafhankelijke transformatie, lijden A. op transformatie gebaseerde assays van rhizogenes aan een aanzienlijke fenotypische variatie. Deze variatie is veel minder in het geval van stabiele lijnen, hoewel in vitro propagatie ook een zekere mate van variatie creëert. Vanwege deze verminderde variatie en het feit dat meerdere plantlets voor elke stabiele lijn fenogetypt kunnen worden, zijn stabiele lijnen geschikter voor kwantitatieve testen in vergelijking met A. rhizogenes-getransformeerde wortels. Bovendien is de stabiele transformatie niet afhankelijk van de introductie van de A. rhizogenes wortel inducerende Locus (rol) die van invloed is op de endogene hormoonbalans15. Daarom zijn stabiele lijnen beter geschikt voor omgekeerde genetische analyse van genen die betrokken zijn bij hormoon homeostase in vergelijking met A. rhizogenes-getransformeerde wortels. Een meer algemeen voordeel van P. andersonii als onderzoeksmodel is dat het niet een recente hele genoom duplicatie (wgd) ervaren. De subfamilie van de Vlinderbloemigen Papilionoideae, met het model peulvruchten M. truncatula en L. japonicus, evenals de Salicaceae (orde Malpighiales) met de model boom Populus balsem ervaren wgds ~ 65 miljoen jaar geleden36,37. Veel van de door deze wgds resulterende paralogous gen kopieën worden bewaard in de genomen van M. truncatula, L. japonicus en P. balsem37,38,39, die redundantie die omgekeerde genetische analyses mogelijk compliceren. Aangezien p. andersonii een recente wgd niet heeft ervaren, zou een omgekeerde genetische analyse op P. andersonii mogelijk minder worden beïnvloed door de redundante werking van de kopieën van paralogous gen.
Samen bieden we een gedetailleerd protocol voor omgekeerde genetische analyse in P. andersonii. Met dit protocol kunnen enkelvoudige mutanten lijnen efficiënt worden gegenereerd in een tijdsbestek van 2-3 maanden10. Dit protocol kan worden uitgebreid om hogere orde mutanten te creëren door multiplexing van sgrna's die zich richten op verschillende genen tegelijk, zoals getoond voor andere plantensoorten40,41,42. Bovendien is de hier beschreven stabiele transformatie procedure niet beperkt tot het gebruik van CRISPR/Cas9 gentargeting, maar kan ook worden gebruikt om andere soorten constructies te introduceren (bijv. voor promotor-reporter assays, ectopische expressie of trans- complementatie). We hebben P. andersonii opgericht als een vergelijkend onderzoeksmodel om mutualistische symbiose te bestuderen met stikstoffixatie van Rhizobia of endomycorrhizaschimmels fungi. De hier beschreven protocollen bieden echter ook hulpmiddelen om andere aspecten van de biologie van deze tropische boom te bestuderen, zoals houtvorming, de ontwikkeling van bi-seksuele bloemen of de biosynthese van Cannabaceae-specifieke secundaire metabolieten.

Parasponia andersonii is een tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae) en is inheems in Papoea-Nieuw-Guinea en verschillende Pacifische eilanden1,2,3. Samen met 4 extra parasponia -soorten vertegenwoordigt het de enige Lineage van niet-peulvruchten die een stikstoffixatie van knobbel-symbiose met Rhizobia kan instellen. Deze symbiose is goed bestudeerd in de peulvruchten (Fabaceae) modellen Medicago truncatula en Lotus japonicus, die heeft geresulteerd in het verwerven van gedetailleerde kennis van de moleculaire genetische aard van knobbel vorming en functioneren4. Bovendien werd aangetoond dat de wortel knokkel symbiose in peulvruchten wordt gebaseerd op de veel oudere en wijdverbreide arbusculaire behorend symbiose5. Fylogenomische vergelijkingen suggereren dat de stikstof-Fixing knobbel symbiose van peulvruchten, parasponia, evenals, de zogenaamde actinorhizal plantensoorten die gastheer diazotrofische frankia bacteriën, hebben een gedeelde evolutionaire oorsprong 6,7,8. Om te bepalen of de genen die zijn geïdentificeerd om te worden betrokken bij de vorming van peulvruchten zijn het deel van een gediende genetische basis, studies over niet-peulvruchten soorten zijn essentieel. Daarom stellen wij voor om P. andersonii te gebruiken als vergelijkend onderzoeksmodel, naast peulvruchten, om de belangrijkste genetische netwerken te identificeren die de onderliggende knobbel-vorming en-werking vormen.
P. andersonii is een pionier die kan worden gevonden op de hellingen van vulkanische heuvels. Het kan voldoen aan de groeisnelheden van 45 cm per maand en bereik lengtes tot 10 meter9. P. andersonii bomen zijn wind-bestuikte, die wordt vergemakkelijkt door de vorming van aparte mannelijke en vrouwelijke bloemen3,10. We hebben onlangs het diploïde genoom (2n = 20; 560 MB/1C) van P. andersoniigesequenced en geannoteerd en een concept genoomsequenties van 2 extra parasponia -soorten samengesteld; P. rigida en p. rugosa6. Dit onthulde ~ 35.000 P. andersonii Gene modellen die kunnen worden geclusterd in > 20000 orthogroepen samen met genen van m. truncatula, sojabonen (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Woodland aardbei ( Fragaria russula), trema orientalis, Black Cotton populier (Populus balsem) en eucalyptueuze (eucalyptus grandis)6. Bovendien identificeerden transcriptome vergelijkingen tussen M. truncatula en P. andersonii een set van 290 putatieve orthologues die een nodule-verbeterd expressie patroon in beide soorten6vertonen. Dit biedt een uitstekende bron voor vergelijkende studies.
Om de genfunctie in P. andersonii wortels en knobbeltjes te bestuderen, is een protocol voor Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde wortel transformatie vastgesteld11. Met dit protocol kunnen samengestelde planten die transgene wortels dragen in een relatief kort tijdsbestek worden opgewekt. Deze methode is, ook, op grote schaal toegepast in het onderzoek van de leguaan-symbiose12,13,14. Het nadeel van deze methode is echter dat alleen wortels worden getransformeerd en dat elke transgene wortel een onafhankelijk transformatie evenement vormt, wat resulteert in substantiële variatie. De transformatie is ook van voorbijgaande aard en transgene lijnen kunnen niet worden gehandhaafd. Dit maakt A. rhizogenesgebaseerde wortel transformatie minder geschikt voor crispr/Cas9-gemedieerde genoom bewerking. Bovendien, A. rhizogenes draagt zijn wortel inducerende Locus (rol) genen naar de plant genoom, die eenmaal uitgedrukt interfereren met hormoon homeostase15. Dit maakt het bestuderen van de rol van plantenhormonen in A. rhizogenes-getransformeerde wortels uitdagend. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we recentelijk een protocol ontwikkeld voor de transformatie van Agrobacterium tumefaciensen crispr/Cas9-gemedieerde mutagenese van P. andersonii10.
Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van de a. tumefaciens-gebaseerde transformatie procedure en reverse genetics pipeline ontwikkeld voor P. andersonii. Daarnaast bieden we protocollen voor de downstream behandeling van transgene plantlets, inclusief assays om symbiotische interacties te bestuderen. Met behulp van het protocol dat hier wordt beschreven, kunnen meerdere transgene lijnen worden gegenereerd in een periode van 2-3 maanden. In combinatie met CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese, maakt dit een efficiënte generatie van afdek gemuteerde lijnen mogelijk. Deze gemuteerde lijnen kunnen vegetatief worden gekweekt in vitro10,16,17, waardoor voldoende materiaal kan worden gegenereerd om fenotypische karakterisering te starten na 4 maanden nadat de transformatie procedure 10is geïnitieerd. Dit geheel van procedures moet een laboratorium in staat stellen om P. andersonii te adopteren als een onderzoeksmodel voor studies gericht op het begrijpen van de verenigingen van rhizobial en behorend, evenals mogelijk andere aspecten van de biologie van deze tropische boom.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii is een snelgroeiende tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae). Samen met 4 extra soorten vormt het de enige bekende niet-peulvrucht Lineage die een stikstoffixatie van knobbel-symbiose met Rhizobium tot stand kan brengen. Vergelijkende studies tussen peulvruchten en P. andersonii kunnen waardevol inzicht geven in de genetische netwerken die de onderliggende knobbel-formatie vormen. Om vergelijkende studies te faciliteren, hebben we onlangs het P. andersonii genoom en de gevestigde Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde stabiele transformatie en crispr/Cas9 gebaseerde genoom Editing gesequenced. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van de transformatie-en genoom bewerkingsprocedures die zijn ontwikkeld voor P. andersonii. Daarnaast beschrijven we procedures voor de kiem ontkieming en karakterisering van symbiotische fenotypes. Met dit protocol kunnen stabiele transgene Mutant lijnen worden gegenereerd in een periode van 2-3 maanden. Vegetatieve in vitro vermeerdering van T0 transgene lijnen maakt het mogelijk fenotyping experimenten uit te voeren na 4 maanden na de co-teelt van A. tumefaciens . Daarom is dit protocol slechts marginaal langer dan de voorbijgaande Agrobacterium rhizogenesgebaseerde wortel transformatie methode die beschikbaar is voor P. andersonii, maar biedt een aantal duidelijke voordelen. Samen staan de hier beschreven procedures toe om P. andersonii te gebruiken als een onderzoeksmodel voor studies gericht op het begrijpen van symbiotische associaties en mogelijk andere aspecten van de biologie van deze tropische boom.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is een snelgroeiende tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae) en kan stikstof fixerende wortel knobbeltjes vormen in samenwerking met de Rhizobium. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor omgekeerde genetische analyses in P. andersonii op basis van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde stabiele transformatie en op crispr/Cas9 gebaseerde genoom bewerking.

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia is een tropische boom uit de cannabisfamilie die in staat is om een stikstofbindende symbiose met rhizobium vast te stellen. Vergelijkende studies tussen Parasponia en peulvruchten kunnen inzicht geven in de kerngeneeskundige netwerken die ten grondslag liggen aan rhizobiumsympiose. Met dit protocol kunnen Parasponia andersonii stabiele transgene mutantlijnen worden gegenereerd in een periode van twee tot drie maanden.Deze lijnen kunnen efficiënt worden gepropageerd door middel van in vitro propagatie. Dit protocol biedt een experimenteel platform om wortelmoïde symbiose te bestuderen, evenals andere aspecten van de biologie van deze tropische boom. Basisvaardigheden in weefselkweek en moleculair klonen zijn voldoende om dit protocol uit te voeren.Hierdoor kan elk laboratorium Parasponia aanpassen als onderzoeksmodel. De promovendi Titis Wardhani en Yuda Roswanjaya demonstreren samen met Marijke Hartog, een technicus in ons lab. Om parasponia andersonii bomen te kweken, begin met het ontkiemen van de zaden.Verwijder de zaden van Parasponia bessen door te wrijven tegen de binnenkant van een theezeef of pletten ze op een stuk tissue papier. Desinfecteren zaden met behulp van 4%hypochloriet bleekmiddel gedurende 15 tot 20 minuten, en dan was de zaden zes keer met gesteriliseerd water. Breng de zaden naar steriele 200 microliter PCR buizen, en vul de buizen met gesteriliseerd water om de zaden onder te dompelen.Broed de buizen gedurende 10 dagen in een thermocycler volgens de hand van het manuscript. Na de 10-daagse incubatie, breng de zaden naar SH-0 platen, en sluit ze met twee lagen elastische afdichting folie om te voorkomen dat drogen. Broed op 28 graden Celsius met een 16-uur-dag, acht uur-nacht cyclus voor drie tot vier weken.Zodra de zaailingen ontwikkelen hun eerste set van echte bladeren, breng ze naar potten gevuld met commerciële potgrond, en bedek ze met een doorschijnende plastic beker om uitdroging te voorkomen. Plaats de potten in een 28-graden Celsius, 85% relatieve vochtigheid klimaat kamer of kas onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime. Na een week, verwijder de plastic beker.Regelmatig water de potten, en aan te vullen met kunstmest te ondersteunen boomgroei. Bereid je voor op transformatie door jonge takken van vijf tot acht centimeter uit de kasgegroeide bomen te oogsten, om ervoor te zorgen dat alleen gezonde, niet-geïnfecteerde takken worden gebruikt. Snijd de bladeren, waardoor een centimeter in het kwadraat van bladweefsel aan het einde van elke petiole.Desinfecteer het weefsel gedurende 15 minuten met 2%hypochloriet bleekmiddel met een paar druppels polysorbaat 20 en spoel het vervolgens acht keer af met autoclaved water. Re-suspend Agrobacterium cellen in 25 milliliter van infiltratie medium tot een optische dichtheid van ongeveer vijf. Snijd de steel en het petioleweefsel in stukken van één centimeter in de celsuspensie.Verwijder de bladweefsels en ontcubeer de stengel en petiole stukken in de cel suspensie gedurende 10 tot 30 minuten. Droog de weefsels stukken op een steriel stuk filter papier en leg ze op beworteling medium bereid volgens manuscript richtingen. Broed de platen in het donker op 21 graden Celsius voor twee dagen.Inspecteer na de twee dagen de platen op schimmel- of bacteriële besmetting en gooi verontreinigde platen weg. Breng de weefselstukken over op 10 milliliter SH-10 medium bereid volgens de handschriftaanwijzing. Laat het weefsel in het medium voor ten minste 10 minuten, en zachtjes roeren om de twee tot drie minuten te wassen.Bereid beworteling medium met cefotaxime en kanamycine volgens het manuscript richtingen, en giet platen. Droog de weefsels op steriele stukken filterpapier en breng ze over naar de platen. Zeven dagen lang incubeerplaten bij 28 graden Celsius onder een 16-uurs-dag, acht uur-nacht regime.Controleer platen op schimmel of bacteriële besmetting om de twee dagen. Als er besmetting optreedt, breng de niet-geïnfecteerde weefselstukken over op een verse plaat. Na zeven dagen, breng de weefselstukken naar vermeerdering medium bereid volgens manuscript richtingen en uitbroeden op 28 graden Celsius onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime.Verfris de platen eenmaal per week tot transgene scheuten zich ontwikkelen, zodat niet-geïnfecteerde weefselstukken alleen naar nieuwe platen worden overgebracht. Zodra de vermeende transgene scheuten zijn ten minste een centimeter lang, snijd de scheuten en cultuur ze onafhankelijk in vermeerdering medium met antibiotica. Om ervoor te zorgen dat de scheuten onafhankelijke transformanten vertegenwoordigen, neem slechts een enkele shoot van elke kant van een explant.Propager het weefsel door het plaatsen van ongeveer 10 scheuten op een verse plaat van vermeerdering medium en het sluiten van de plaat met twee lagen elastische afdichting folie. Broed de platen op 28 graden Celsius onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime, en herhaal deze stap om de vier weken. Wanneer de scheuten bereiken een centimeter in lengte, snijd ze op hun basis en plaats ze op het beworteling medium.Plaats de scheuten rechtop door het inbrengen van de basale punt van de shoot in het medium. Ongeveer 10 scheuten kunnen op één plaat worden geplaatst. Begin met het bereiden van rhizobium entmateriaal.Inoculeren 10 milliliter vloeibaar YEM-medium uit een enkele kolonie Mesorhizobium plurifarium BOR2 en twee dagen lang incubeer bij 28 graden Celsius. Gebruik deze cultuur om een groter volume vloeibaar YEM-medium in te enten. Eenmaal gegroeid, centrifugeren de bacteriële cultuur gedurende 10 minuten op 3, 500 keer g om de cellen te oogsten.Schort de bacteriële pellet opnieuw op in vloeibaar EKM-medium en bepaal de optische dichtheid. Bereid drie liter EKM medium, dat is genoeg voor ongeveer 20 potten, en inenten met de wortelvwinnende suspensie. Meng het medium met 1,25 kilogram perliet en voeg 210 gram van dit mengsel toe aan steriele doorschijnende polypropyleenpotten.Plant een tot drie Parasponia andersonii plantenbakken aan elke pot, en bereiden verschillende potten met plantenvormen getransformeerd met de controle construeren. Weeg een aantal van de potten, en bedek de onderkant van elke pot om de wortels te beschermen tegen blootstelling aan licht. Broed de potten in een geklimatiseerde groeiruimte bij 28 graden Celsius onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime voor vier tot zes weken.Een keer per week, wegen verschillende potten om waterverlies te bepalen. Als het waterverlies meer dan 10 milliliter bedraagt, vul dan aan met ultrazuiver water om het verlies te compenseren. Na de incubatie, reinig de wortels van perliet, en bepalen knobbelnummers met behulp van een verrekijker.Deze techniek is gebruikt om bloemblaadjes en segmenten van Parasponia andersonii stengels succesvol te transformeren met Agrobacterium stam AGL1. Ten eerste worden de weefselexplants gedurende twee dagen samen met Agrobacterium gecultiveerd. Langdurige co-teelt resulteert in bacteriële overkolonisatie en moet worden voorkomen.Een paar weken later worden kleine groene micro-calli waargenomen langs het oorspronkelijke wondoppervlak. Deze calli blijven groeien en ontwikkelen een of meer putatief getransformeerde scheuten op zes tot acht weken na het begin van de transformatie. Transformatie-efficiëntie varieert van 10 tot 30% voor weefselexplants van volwassen takken tot 65 tot 75% voor weefselexplants uit jonge en snel groeiende takken.Transgene scheuten kunnen worden vermenigvuldigd door middel van in vitro propagatie, die binnen een maand tot tientallen scheuten leidt. Deze scheuten kunnen worden geplaatst op beworteling medium dat wortelvorming zal induceren in ongeveer twee weken en opbrengst planten die kunnen worden gebruikt voor experimenten. Bij het starten van een stabiel transformatie-experiment is het belangrijk om gezonde takken als bronmateriaal te selecteren.Parasponia T0 transgene lijnen worden in vitro gepropageerd. Daarom is het essentieel om grondig genotype Parasponia transgene lijnen. De oprichting van Parasponia als experimenteel model maakt vergelijkende analyse mogelijk tussen twee verre verwante nodulating lineages, Parasponia en peulvruchten.Dit zou kunnen identificeren behouden genetische netwerken die ten grondslag liggen aan rhizobium symbiose. Parasponia kan ook een waardevol model zijn om andere onderzoeksonderwerpen te bestuderen, zoals houtvorming, de ontwikkeling van biseksuele bloemen of de biosynthese van Cannabaceae-specifieke secundaire metabolieten.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) Assay voor Zika-Virus en huishouden genen in Urine, Serum en Mosquito monsters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-gemedieerde genoom uitgeven van het menselijke schimmel pathogeen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...