Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
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Die Autoren würdigen gerne Mark Youles, Sophien Kamoun und Sylvestre Marillonnet dafür, dass sie Golden Gate-Klonteile über die Addgene-Datenbank verfügbar gemacht haben. Darüber hinaus möchten wir E. James, P. Hadobas und T. J. Higgens für P. andersonii Samen danken. Diese Arbeit wurde von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-VICI-Stipendium 865.13.001; NWO-Open Competition Grant 819.01.007) und das Ministerium für Forschung, Technologie und Hochschulbildung der Republik Indonesien (RISET-PRO Grant 8245-ID).

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hülsenfrüchte und die entfernt verwandte Cannabaceae-Gattung Parasponia stellen die einzigen beiden Klades von Pflanzenarten dar, die in der Lage sind, eine endosymbiotische Beziehung zu stickstofffixierenden Rhizobia herzustellen und Wurzelknollen zu bilden. Vergleichende Studien zwischen Arten beider Klades sind hoch relevant, um Einblicke in die genetischen Kernnetzwerke zu geben, die diese Symbiose ermöglichen. Derzeit werden genetische Studien hauptsächlich in Hülsenfrüchte durchgeführt; insbesondere die beiden Modellarten M. truncatula und L. japonicus. Um eine zusätzliche experimentelle Plattform zu schaffen und vergleichende Studien mit einer nickenden Nicht-Legume zu ermöglichen, beschreiben wir hier ein detailliertes Protokoll für stabile Transformation und umgekehrte genetische Analysen in P. andersonii. Das vorgestellte Protokoll verwendet die In-vitro-Vermehrung von T0 transgenen P. andersonii-Linien, so dass die phänotypische Analyse innerhalb von 4 Monaten nach der Kokultivierung von A. tumefaciens eingeleitet werden kann. Dies ist wesentlich schneller als aktuelle Protokolle, die für eine stabile Transformation von Hülsenfrüchte33eingerichtet wurden. Das macht P. andersonii zu einem attraktiven Forschungsmodell.
Das hier beschriebene Protokoll enthält mehrere kritische Schritte. Die erste betrifft die Keimung von Samen. Um P. andersonii Samen für die Keimung vorzubereiten, müssen die Samen von den Beeren isoliert werden. Dies geschieht durch Reiben der Beeren auf einem Stück Tissuepapier oder gegen das Innere eines Teesiebes. Dieses Verfahren muss schonend durchgeführt werden, um Schäden an der Samenschicht zu vermeiden. Wenn die Samenschicht beschädigt wird, könnte Bleichmittel während der Sterilisation in das Saatgut gelangen, was die Samenlebensfähigkeit verringert. Um die Saatruhe zu durchbrechen, werden die Samen einem Temperaturzyklus von 10 Tagen unterzogen. Trotz dieser Behandlung ist die Keimung jedoch nicht vollständig synchronisiert. Im Allgemeinen zeigen die ersten Samen Radicle-Emergence nach 7 Tagen, aber andere können mehrere Tage länger dauern, um zu keimen.
Kritische Punkte im Transformationsverfahren betreffen die Wahl des Ausgangsmaterials und die Dauer des Kokultivierungsschritts. Um eine effiziente Transformation zu erreichen, ist es am besten, gesunde und junge Stiele oder Blütenvon nicht sterilen Gewächshauspflanzen als Ausgangsmaterial zu verwenden. Um das Wachstum junger Zweige zu induzieren, ist es ratsam, Parasponia-Bäume alle 2-3 Monate zu trimmen und bäume einmal im Jahr zu erfrischen. Zusätzlich muss der Kokulturschritt nur für 2 Tage durchgeführt werden. Die verlängerte Kokultivierung fördert die Überkolonialisierung von Gewebeexpflanzen durch A. tumefaciens und reduziert in der Regel die Transformationseffizienz. Um eine Überkolonialisierung durch A. tumefaciens zu verhindern, ist es auch wichtig, die Platten, auf denen die Expflanzen angebaut werden, regelmäßig aufzufrischen. Im Falle einer Überbesiedlung könnten Gewebeexplanten gewaschen werden (siehe Abschnitt 3.8), um A. tumefaciens-Zellen zu entfernen. Wir empfehlen, der zum Waschen verwendeten SH-10-Lösung Bleichmittel hinzuzufügen (Endkonzentration: 2 % Hypochlorit). Es ist wichtig zu beachten, dass dieser zusätzliche Waschschritt bei stark infizierten Explanten möglicherweise nicht funktioniert (Abbildung 2B). Ergibt eine Transformation mit einem CRISPR/Cas9-Konstrukt nur eine begrenzte Anzahl von vermeintlich transformierten Trieben oder wenn die Mutagenese eines bestimmten Gens Probleme bei der Regeneration verursachen dürfte, ist es ratsam, ein leeres Vektorkontrollkonstrukt als die positive Kontrolle. Schließlich ist es wichtig sicherzustellen, dass alle ausgewählten transgenen Linien aus unabhängigen T-DNA-Integrationsereignissen resultieren. Daher weisen wir an, nur einen einzigen vermeintlich transgenen Trieb von jeder Seite einer Explantation zu nehmen. Wir sind uns jedoch bewusst, dass dies die potenzielle Anzahl unabhängiger Linien reduziert. Wenn viele Leitungen benötigt werden, könnten die Forscher entscheiden, vermeintlich transformierte Calli von den ursprünglichen Explants zu trennen, wenn diese Calli 2 mm groß sind und diese Calli unabhängig voneinander bebauen. Auf diese Weise könnten mehrere Linien von jeder Explantation isoliert werden, was die Anzahl potenzieller transgener Linien erhöht.
Im aktuellen Protokoll werden transgene Linien von P. andersonii vegetativ durch In-vitro-Vermehrung vermehrt. Der Vorteil dabei ist, dass viele transgene Pflanzen in relativ kurzer Zeit erzeugt werden können. Diese Methode hat jedoch auch mehrere Einschränkungen. Erstens ist die Aufrechterhaltung von T0 transgenen Linien durch In-vitro-Vermehrung arbeitsintensiv und könnte zu unerwünschten genetischen oder epigenetischen Veränderungen 34,35führen. Zweitens enthalten T 0-Linien noch eine Kopie der T-DNA, einschließlich der Antibiotika-Resistenzkassette. Dadurch wird die Anzahl möglicher Umtransformationen begrenzt, da für jede Neutransformation unterschiedliche Auswahlmarkierungen erforderlich sind. Derzeit haben wir die Transformation nur mit Kanamycin- oder Hygromycin-Auswahl getestet (Daten werden nicht angezeigt). Darüber hinaus erschwert das Vorhandensein der Cas9-Kodierungssequenz und der sgRNAs in den transgenen T 0-Linien Komplementierungsstudien. Komplementierungs-Assays sind möglich, erfordern aber, dass die sgRNA-Ziel-Site(n) als solche mutiert wird, damit die Genbearbeitung des Komplementierungskonstrukts verhindert wird. Drittens ist ein Nachteil der Arbeit mit T 0-Linien, dass CRISPR/Cas9-Mutanten chimerisch sein könnten. Um eine phänotypische Analyse von chimermutierten Linien zu verhindern, empfehlen wir, die Genotypisierungsanalyse nach In-vitro-Vermehrung an mindestens 3 verschiedenen Trieben zu wiederholen. Obwohl die Anzahl der chimarischen Mutanten, die mit demhier beschriebenen Protokoll erhalten wurden, begrenzt ist, werden sie gelegentlich 10 beobachtet. Um die Grenzen der Arbeit mit T 0-Linien zu überwinden, könnten P. andersonii mutierte Linien generativ propagiert werden. P. andersonii Bäume sind dioecious und windbefruchtet2. Das bedeutet, dass jede transgene Linie als solche manipuliert werden muss, dass männliche und weibliche Blüten auf einer einzigen Person produziert werden und anschließend als solche angebaut werden, dass eine Kreuzbestäubung nicht auftritt. Da P. andersonii ein schnell wüchsender Baum ist, benötigt er viel Platz in einem tropischen Gewächshaus (28 °C, 85 % relative Luftfeuchtigkeit). Daher ist die generative Vermehrung von transgenen P. andersonii-Linien, obwohl technisch möglich, logistisch anspruchsvoll.
Im Protokollabschnitt haben wir 3 Methoden zur Nodulation von P. andersoniibeschrieben. Der Vorteil der Platten- und Beutelsysteme ist, dass die Wurzeln leicht zugänglich sind, was eine Spot-Impfung von Bakterien und die anschließende Knötulation im Laufe der Zeit ermöglichen kann. Das Plattensystem ist jedoch recht arbeitsintensiv, was es weniger geeignet für groß angelegte Nodulationsexperimente macht. Ein Nachteil des Beutelsystems ist, dass es schwierig ist, Pilzkontaminationen zu verhindern. Beutel sind nicht steril, und daher wird Pilzwachstum oft auf der oberen Hälfte des Beutels beobachtet. Dies wirkt sich jedoch nicht auf das Wachstum von P. andersonii aus und stört daher nicht die Nodulationstests. Zusätzlich ist das Beutelsystem nur für Sämlinge geeignet. Trotz mehrerer Versuche konnten wir keine Pflanzen, die durch In-vitro-Vermehrung in Beuteln gewonnen wurden, anbauen.
Die hier beschriebene P. andersonii Reverse Genetics Pipeline bietet eine wesentliche Verbesserung gegenüber der bestehenden A. rhizogenes-basiertenWurzeltransformationsmethode11. Mit den beschriebenen Verfahren können stabile transgene Leitungen effizient erzeugt und durch In-vitro-Vermehrung aufrechterhalten werden. Im Gegensatz dazu ist die Umwandlung von A. rhizogenes vorübergehend und führt nur zur Bildung transgener Wurzeln. Da jede transgene Wurzel aus einer unabhängigen Transformation resultiert, leiden A. rhizogenes transformationsbasierte Assays unter erheblichen phänotypischen Variationen. Bei stabilen Linien ist diese Streuung viel geringer, obwohl die In-vitro-Vermehrung auch eine gewisse Streuung erzeugt. Aufgrund dieser reduzierten Variation und der Tatsache, dass mehrere Pflanzenfürst für jede stabile Linie phänotypisiert werden konnten, eignen sich stabile Linien besser für quantitative Assays als a. rhizogenes-transformierteWurzeln. Darüber hinaus hängt die stabile Transformation nicht von der Einführung der A. rhizogenes Wurzel induzierenden Lokus (rol) ab, die den endogenen Hormonhaushalt15beeinflusst. Daher eignen sich stabile Linien besser für die umgekehrte genetische Analyse von Genen, die an der Hormonhomöostase beteiligt sind, im Vergleich zu A. rhizogenes-transformierten Wurzeln. Ein allgemeinerer Vorteil von P. andersonii als Forschungsmodell ist, dass es keine kürzliche ganze Genomduplizierung (WGD) erfahren hat. Die Legume Papilionoideae Unterfamilie, die das Modell Hülsenfrüchte M. truncatula und L. japonicusumfasst, sowie die Salicaceae (Ordnung Malpighiales), die den Modellbaum Populus trichocarpa erfahrene WGDs umfasst 65 vor 1million Jahren36,37. Viele paralogische Genkopien, die sich aus diesen WGDs ergeben, werden in den Genomen von M. truncatula, L. japonicus und P. trichocarpa37,38,39, beibehalten, was Redundanz, die umgekehrte genetische Analysen erschweren könnte. Da P. andersonii vor kurzem keine WGD erlebt hat, könnten umgekehrte genetische Analysen auf P. andersonii weniger durch redundante Funktion paralogusischer Genkopien beeinflusst werden.
Zusammen stellen wir ein detailliertes Protokoll für die umgekehrte genetische Analyse in P. andersoniizur Verfügung. Mit diesem Protokoll können einzelne mutierte Leitungen effizient in einem Zeitrahmen von 2-3 Monaten10erzeugt werden. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um Mutanten höherer Ordnung durch Multiplexing von sgRNAs zu erzeugen, die auf verschiedene Gene gleichzeitig abzielen, wie für andere Pflanzenarten40,41,42gezeigt. Darüber hinaus beschränkt sich das hier beschriebene stabile Transformationsverfahren nicht auf CRISPR/Cas9-Gen-Targeting, sondern könnte auch zur Einführung anderer Arten von Konstrukten (z.B. für Promoter-Reporter-Assays, ektopische Expression oder Trans- Ergänzung). Wir haben P. andersonii als vergleichendes Forschungsmodell etabliert, um mutualistische Symbiosen mit stickstofffixierenden Rhizobia oder Endomykorrhizapilzen zu untersuchen. Die hier beschriebenen Protokolle bieten jedoch auch Werkzeuge, um andere Aspekte der Biologie dieses tropischen Baumes zu untersuchen, wie die Holzbildung, die Entwicklung von bisexuellen Blüten oder die Biosynthese von Cannabaceae-spezifischen sekundären Metaboliten.

Parasponia andersonii ist ein tropischer Baum aus der Familie der Cannabis (Cannabaceae) und stammt aus Papua-Neuguinea und mehreren Pazifischen Inseln1,2,3. Zusammen mit 4 zusätzlichen Parasponia-Arten stellt sie die einzige nicht-legume-Linie dar, die eine stickstofffixende Knötchensymbiose mit Rhizobia herstellen kann. Diese Symbiose ist gut in den Hülsenfrüchte (Fabaceae) Modellen Medicago truncatula und Lotus japonicusuntersucht, was zu detaillierten Kenntnissen über die molekulargenetische Natur der Knötselbildung undFunktionsweise4 geführt hat. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Wurzelknötsymbiose in Hülsenfrüchten auf der viel älteren und weit verbreiteten arbuskulären Mykorrhizasymbiose5beruht. Phylogenomische Vergleiche deuten darauf hin, dass die stickstofffixierenden Knötchensymbiosen von Hülsenfrüchte, Parasponia, sowie die sogenannten actinorhizal Pflanzenarten, die diazotrophe Frankienbakterien beherbergen, einen gemeinsamen evolutionären Ursprung haben. 6,7,8. Um festzustellen, ob die Gene, die als an der Legume-Knötichbildung beteiligt identifiziert werden, Teil einer konservierten genetischen Grundlage sind, sind Studien an Nicht-Legume-Arten unerlässlich. Zu diesem Zweck schlagen wir vor, P. andersonii als vergleichendes Forschungsmodell neben Hülsenfrüchten zu verwenden, um die genetischen Kernnetzwerke zu identifizieren, die der Wurzelknötbildung und -funktion zugrunde liegen.
P. andersonii ist ein Pionier, der an den Hängen vulkanischer Hügel zu finden ist. Es kann Wachstumsgeschwindigkeiten von 45 cm pro Monat erfüllen und Längen von bis zu 10 Metern9erreichen. P. andersonii Bäume sind windbefruchtet, was durch die Bildung von getrennten männlichen und weiblichen Blüten erleichtert wird3,10. Wir haben vor kurzem das diploide Genom (2n = 20; 560 Mb/1C) von P. andersoniisequenziert und mit Anmerkungen bezeichnet und Entwürfe von Genomsequenzen von 2 zusätzlichen Parasponia-Arten zusammengestellt; P. rigida und P. rugosa6. Dies ergab 35.000 P. andersonii Genmodelle, die in >20.000 Orthogruppen zusammen mit Genen aus M. truncatula, Sojabohnen (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Wald Erdbeere ( gruppiert werden können Fragaria vesca), Trema orientalis, schwarze Baumwollpappel (Populus trichocarpa) und Eukalyptus (Eukalyptus grandis)6. Zusätzlich identifizierten Transkriptomvergleiche zwischen M. truncatula und P. andersonii eine Reihe von 290 vermeintlichen Orthologen, die ein knöchernverstärktes Expressionsmuster bei beiden Arten anzeigen6. Dies bietet eine ausgezeichnete Ressource für vergleichende Studien.
Um die Genfunktion in P. andersonii Wurzeln und Knötchen zu untersuchen, wurde ein Protokoll für Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Wurzeltransformation 11 etabliert. Mit diesem Protokoll können Verbundpflanzen mit transgenen Wurzeln in relativ kurzer Zeit erzeugt werden. Diese Methode ist auch in der Hülsenfrüchte-Symbiose-Forschung weit verbreitet12,13,14. Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch darin, dass nur Wurzeln transformiert werden und dass jede transgene Wurzel ein unabhängiges Transformationsereignis darstellt, was zu erheblichen Variationen führt. Außerdem ist die Transformation transient und transgene Linien können nicht aufrechterhalten werden. Dadurch ist die A. rhizogenes-basierteWurzeltransformation weniger geeignet für die CRISPR/Cas9-vermittelte Genombearbeitung. Zusätzlich überträgt A. rhizogenes seine Wurzel induzierenden Lokus -rol) Gene auf das Pflanzengenom, das einmal mit dem Hormon Homöostase15stören. Dies macht das Studium der Rolle von Pflanzenhormonen in A. rhizogenes-transformierten Wurzeln herausfordernd. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir vor kurzem ein Protokoll für Agrobacterium tumefaciens-basierteTransformation und CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese von P. andersonii10entwickelt.
Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des A. tumefaciens-basiertenTransformationsverfahrens und der Reverse-Genetik-Pipeline, die für P. andersoniientwickelt wurde. Darüber hinaus bieten wir Protokolle für den nachgelagerten Umgang mit transgenen Pflanzen, einschließlich Assays zur Untersuchung symbiotischer Wechselwirkungen. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können mehrere transgene Leitungen in einem Zeitraum von 2-3 Monaten erzeugt werden. In Kombination mit CRISPR/Cas9-vermittelter Mutagenese ermöglicht dies eine effiziente Erzeugung von Knockout-Mutantenlinien. Diese mutierten Linien können in vitro 10,16,17vegetativ vermehrt werden, wodurch genügend Material erzeugt werden kann, um 4 Monate nach dem Transformationsverfahren mit der phänotien Charakterisierung zu beginnen. initiiert wurde10. Zusammen sollte diese Reihe von Verfahren jedem Labor erlauben, P. andersonii als Forschungsmodell für Studien zu übernehmen, die auf das Verständnis von rhizobialen und mykorrhizalen Assoziationen sowie möglicherweise anderen Aspekten der Biologie dieses tropischen Baumes abzielen.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii ist ein tropischer Baum, der zur Familie der Cannabis (Cannabaceae) gehört. Zusammen mit 4 weiteren Arten bildet es die einzige bekannte nicht-legume Linie, die in der Lage ist, eine stickstofffixende Knötchensymbiose mit Rhizobium herzustellen. Vergleichende Studien zwischen Hülsenfrüchten und P. andersonii könnten wertvolle Einblicke in die genetischen Netzwerke liefern, die der Wurzelknötbildung zugrunde liegen. Um vergleichende Studien zu erleichtern, haben wir vor kurzem das Genom von P. andersonii sequenziert und Agrobacterium tumefaciens- vermittelte stabile Transformation und CRISPR/Cas9-basierte Genombearbeitung etabliert. Hier finden Sie eine detaillierte Beschreibung der Transformations- und Genombearbeitungsverfahren, die für P. andersoniientwickelt wurden. Darüber hinaus beschreiben wir Verfahren zur Keimung und Charakterisierung symbiotischer Phänotypen. Mit diesem Protokoll können stabile transgene mutierte Leitungen in einem Zeitraum von 2-3 Monaten erzeugt werden. Die vegetative In-vitro-Vermehrung von Transgenlinien T0 ermöglicht die Einleitung von Phänotypisierungsexperimenten 4 Monate nach der Kokultivierung von A. tumefaciens. Daher dauert dieses Protokoll nur geringfügig länger als die transiente Agrobacterium rhizogenes-basierteWurzeltransformationsmethode, die für P. andersoniiverfügbar ist, obwohl es mehrere klare Vorteile bietet. Zusammen erlauben die hier beschriebenen Verfahren P. andersonii als Forschungsmodell für Studien zum Verständnis symbiotischer Assoziationen sowie potenziell anderer Aspekte der Biologie dieses tropischen Baumes zu verwenden.

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Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii ist ein schnell wachsender tropischer Baum, der zur Cannabis-Familie (Cannabaceae) gehört und in Verbindung mit dem Rhizobium stickstofffixende Wurzelknollen bilden kann. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für reverse genetische Analysen in P. andersonii basierend auf Agrobacterium tumefaciens-vermittelte stabile Transformation und CRISPR/Cas9-basierte Genombearbeitung.

Transforming, GenomEditing und Phenotypisierung der Stickstoff-fixierenden tropischen Cannabaceae Baum Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia ist ein tropischer Baum aus der Cannabis-Familie, der in der Lage ist, eine stickstofffixende Symbiose mit Rhizobium herzustellen. Vergleichende Studien zwischen Parasponia und Hülsenfrüchte könnten Einen Einblick in die genetischen Kernnetzwerke der Rhizobiumsymbiose geben. Mit diesem Protokoll können Parasponia andersonii stabile transgene mutierte Linien in einem Zeitraum von zwei bis drei Monaten erzeugt werden.Diese Linien können effizient durch In-vitro-Vermehrung vermehrt werden. Dieses Protokoll bietet eine experimentelle Plattform, um rhizobiale Symbiose sowie andere Aspekte der Biologie dieses tropischen Baumes zu studieren. Grundkenntnisse in Gewebekultur und molekularem Klonen reichen aus, um dieses Protokoll umzusetzen.Dies ermöglicht es jedem Labor, Parasponia als Forschungsmodell anzupassen. Die Doktoranden Titis Wardhani und Yuda Roswanjaya werden zusammen mit Marijke Hartog, einer Technikerin in unserem Labor, das Verfahren demonstrieren. Um Parasponia andersonii Bäume anzubauen, beginnen Sie mit dem Keimen der Samen.Entfernen Sie die Samen von Parasponia Beeren, indem Sie an der Innenseite eines Teesiebes reiben oder sie auf ein Stück Tissuepapier zerquetschen. Desinfizieren Sie Die Samen mit 4% Hypochlorit-Bleichmittel für 15 bis 20 Minuten, und waschen Sie die Samen dann sechsmal mit sterilisiertem Wasser. Übertragen Sie die Samen in sterile 200 Mikroliter PCR-Röhren und füllen Sie die Rohre mit sterilisiertem Wasser, um die Samen zu untertauchen.Inkubieren Sie die Rohre für 10 Tage in einem Thermocycler nach Manuskriptanweisungen. Nach der 10-tägigen Inkubation die Samen auf SH-0-Platten übertragen und mit zwei Schichten elastischer Dichtfolie schließen, um ein Trocknen zu verhindern. Inkubieren Bei 28 Grad Celsius mit einem 16-Stunden-Tag, acht-Stunden-Nacht-Zyklus für drei bis vier Wochen.Sobald die Sämlinge ihre ersten echten Blätter entwickeln, übertragen Sie sie in Töpfe, die mit kommerziellen Blumenerde gefüllt sind, und bedecken Sie sie mit einem durchscheinenden Plastikbecher, um ausweichenzu vermeiden. Legen Sie die Töpfe in einem 28-Grad-Celsius, 85% relative Luftfeuchtigkeit Klimaraum oder Gewächshaus unter einem 16-Stunden-Tag, acht-Stunden-Nacht-Regime. Nach einer Woche den Plastikbecher entfernen.Regelmäßig die Töpfe gießen und mit Dünger ergänzen, um das Baumwachstum zu erhalten. Bereiten Sie sich auf die Transformation vor, indem Sie junge Fünf- bis Achtzentimeter-Zweige von den gewächseigenen Bäumen ernten und sicherstellen, dass nur gesunde, nicht infizierte Zweige verwendet werden. Schneiden Sie die Blätter ab und lassen Sie einen Zentimeter Blattgewebe am Ende jeder Blatthaut.Desinfizieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang mit 2% Hypochloritbleichmittel, die ein paar Tropfen Polysorbat 20 enthalten, und spülen Sie es dann achtmal mit autoklaviertem Wasser ab. Agrobacterium-Zellen in 25 Milliliter infiltrationsmedium auf eine optische Dichte von etwa fünf zurücksetzen. Schneiden Sie den Stiel und das Blattgewebe in ein Zentimeter große Stücke innerhalb der Zellsuspension.Entfernen Sie das Blattgewebe und inkubieren Sie den Stamm und die Blattstücke in der Zellsuspension für 10 bis 30 Minuten. Trocknen Sie die Gewebestücke auf einem sterilen Stück Filterpapier und legen Sie sie auf ein Verwurzelmedium, das nach Manuskriptanweisungen zubereitet wird. Bebrüte die Platten im Dunkeln zwei Tage lang bei 21 Grad Celsius.Nach den zwei Tagen die Platten auf Pilz- oder Bakterienkontamination untersuchen und kontaminierte Platten entsorgen. Übertragen Sie die Gewebestücke auf 10 Milliliter SH-10 Medium, die nach Manuskriptanweisungen hergestellt werden. Lassen Sie das Gewebe im Medium für mindestens 10 Minuten, und sanft alle zwei bis drei Minuten zum Waschen rühren.Bereiten Sie Verwurzelungsmedium mit Cefotaxaund und Kanamycin nach den Manuskriptrichtungen vor und gießen Sie Platten. Trocknen Sie das Gewebe auf sterilen Stücken Filterpapier und geben Sie es auf die Platten. Inkubieren Sie Teller für sieben Tage bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime.Überprüfen Sie die Platten alle zwei Tage auf Pilz- oder Bakterienkontamination. Wenn eine Kontamination auftritt, übertragen Sie die nicht infizierten Gewebestücke auf eine frische Platte. Nach sieben Tagen die Gewebestücke auf das nach Manuskriptanweisungen vorbereitete Vermehrungsmedium übertragen und bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime brüten.Erfrischen Sie die Platten einmal pro Woche, bis sich transgene Triebe entwickeln, und stellen Sie sicher, dass sie nur nicht infizierte Gewebestücke auf neue Platten übertragen. Sobald die vermeintlichen transgenen Triebe mindestens einen Zentimeter lang sind, schneiden Sie die Triebe und kultivieren sie unabhängig voneinander im Vermehrungsmedium mit Antibiotika. Um sicherzustellen, dass die Triebe unabhängige Transformanten darstellen, nehmen Sie nur einen einzigen Trieb von jeder Seite einer Explantation.Vermehren Sie das Gewebe, indem Sie etwa 10 Triebe auf eine frische Platte aus Vermehrungsmedium legen und die Platte mit zwei Schichten elastischer Dichtfolie verschließen. Inkubieren Sie die Platten bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime, und wiederholen Sie diesen Schritt alle vier Wochen. Wenn die Triebe einen Zentimeter lang werden, schneiden Sie sie an ihrer Basis und legen Sie sie auf das Wurzelmedium.Positionieren Sie die Triebe aufrecht, indem Sie die Basalspitze des Triebes in das Medium einfügen. Etwa 10 Triebe können auf eine einzelne Platte gelegt werden. Beginnen Sie mit der Zubereitung von Rhizobium inoculum.Impfen Sie 10 Milliliter flüssiges YEM-Medium aus einer einzigen Kolonie von Mesorhizobium plurifarium BOR2 und brüten Sie zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius. Verwenden Sie diese Kultur, um ein größeres Volumen an flüssigem YEM-Medium zu impfen. Einmal angebaut, zentrifugieren Sie die Bakterienkultur für 10 Minuten bei 3, 500 mal g, um die Zellen zu ernten.Setzen Sie das bakterielle Pellet in flüssigem EKM-Medium wieder auf und bestimmen Sie die optische Dichte. Bereiten Sie drei Liter EKM Medium, das reicht für etwa 20 Töpfe, und impfen Sie es mit der rhizobialsuspension. Mischen Sie das Medium mit 1,25 Kilogramm Perlit und fügen Sie 210 Gramm dieser Mischung zu sterilen transluzenten Polypropylen-Töpfen hinzu.Pflanzen Sie ein bis drei Parasponia andersonii Pflanzen in jeden Topf und bereiten Sie mehrere Töpfe mit Pflanzen, die mit dem Kontrollkonstrukt umgewandelt wurden. Wiegen Sie mehrere der Töpfe und bedecken Sie den Boden jedes Topfes, um die Wurzeln vor Lichteinwirkung zu schützen. Inkubieren Sie die Töpfe in einem klimatisierten Wachstumsraum bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime für vier bis sechs Wochen.Einmal pro Woche mehrere Töpfe wiegen, um Wasserverlust zu bestimmen. Wenn der Wasserverlust 10 Milliliter übersteigt, ergänzen Sie mit reinem reinem Wasser, um den Verlust zu kompensieren. Reinigen Sie nach der Inkubation die Wurzeln von Perlit und bestimmen Sie die Knöttelzahlen mit einem Fernglas.Diese Technik wurde verwendet, um Petioles und Segmente von Parasponia andersonii Stielen mit Agrobacterium-Stamm AGL1 erfolgreich zu transformieren. Zunächst werden die Gewebeexplantationen zwei Tage lang mit Agrobacterium kokultiviert. Längere Kokultivierung führt zu einer bakteriellen Überbesiedlung und sollte verhindert werden.Ein paar Wochen später werden entlang der ursprünglichen Wundoberfläche kleine grüne Mikro-Calli beobachtet. Diese Calli wachsen weiter und entwickeln sechs bis acht Wochen nach Beginn der Transformation einen oder mehrere vermeintlich transformierte Triebe. Die Transformationseffizienz schwankt zwischen 10 und 30 % bei Gewebeexpflanzen aus reifen Zweigen bis zu 65 bis 75 % bei Gewebeexplanten aus jungen und schnell wachsenden Zweigen.Transgene Triebe können durch In-vitro-Vermehrung multipliziert werden, was innerhalb eines Monats zu Dutzenden von Trieben führt. Diese Triebe können auf Wurzelmedium platziert werden, die Wurzelbildung in etwa zwei Wochen induzieren und pflanzen ergeben, die für Experimente verwendet werden können. Beim Starten eines stabilen Transformationsexperiments ist es wichtig, gesunde Zweige als Ausgangsmaterial auszuwählen.Transgene Parasponia T0-Linien werden in vitro vermehrt. Daher ist es wichtig, den Parasponia-Transgenen gründlich zu genotypisieren. Die Etablierung von Parasponia als experimentelles Modell ermöglicht eine vergleichende Analyse zwischen zwei entfernt verwandten nodulating Lineages, Parasponia und Hülsenfrüchte.Dies könnte konservieren genetische Netzwerke zugrunde Rhizobium Symbiose identifizieren. Parasponia kann auch ein wertvolles Modell sein, um andere Forschungsthemen wie Holzbildung, die Entwicklung von bisexuellen Blüten oder die Biosynthese von Cannabaceae-spezifischen sekundären Metaboliten zu studieren.

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Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Forschung

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

Verbesserte Genom Bearbeitung mit Cas9 Ribonucleoprotein in verschiedenen Zellen und Organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

Reverse Transkription-Loop-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) Assay für Zika-Virus und Housekeeping-Gene in Urin, Serum und Moskito-Proben

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung von menschlichen pilzliche Erreger Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...