Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
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Gli autori amano riconoscere Mark Youles, Sophien Kamoun e Sylvestre Marillonnet per aver reso disponibili le parti di clonazione di Golden Gate attraverso il database Addgene. Inoltre, vorremmo ringraziare E. James, P. Hadobas e T. J. Higgens per i semi di P. andersonii. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-VICI grant 865.13.001; NWO-Open Competition grant 819.01.007) e il Ministero della Ricerca, tecnologia e istruzione superiore della Repubblica d'Indonesia (riSET-PRO grant 8245-ID).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I legumi e il genere Cannabaceae Parasponia rappresentano gli unici due cladi di specie vegetali in grado di stabilire una relazione endosimbiotica con rizobia che fissa l'azoto e formare noduli di radice. Gli studi comparativi tra specie di entrambi i cladi sono altamente rilevanti per fornire informazioni sulle reti genetiche di base che consentono questa simbiosi. Attualmente, gli studi genetici sono fatti principalmente nei legumi; specialmente le due specie modello M. truncatula e L. japonicus. Per fornire una piattaforma sperimentale aggiuntiva e facilitare gli studi comparativi con un nodulante non legume, descriviamo qui un protocollo dettagliato per la trasformazione stabile e le analisi genetiche inverse in P. andersonii. Il protocollo presentato utilizza la propagazione in vitro delle linee T0 transgeniche P. andersonii, consentendo l'avvio dell'analisi fenotipica entro 4 mesi dalla co-coltivazione A. tumefaciens. Questo è sostanzialmente più veloce rispetto ai protocolli attuali che sono stati stabiliti per la trasformazione stabile dei legumi33. Questo rende P. andersonii un modello di ricerca attraente.
Il protocollo descritto di seguito contiene diversi passaggi critici. Il primo dei quali riguarda la germinazione dei semi. Per preparare i semi di P. andersonii per la germinazione, i semi devono essere isolati dalle bacche. Questo viene fatto strofinando le bacche su un pezzo di carta velina o contro l'interno di un setaccio di tè. Questa procedura deve essere eseguita delicatamente per evitare danni al cappotto di semi. Se il mantello del seme viene danneggiato, la candeggina potrebbe entrare nel seme durante la sterilizzazione, riducendo la vitalità del seme. Per rompere la dormancy dei semi, i semi sono sottoposti a un ciclo di temperatura di 10 giorni. Tuttavia, nonostante questo trattamento, la germinazione non è completamente sincronizzata. Generalmente, i primi semi mostrano l'emergere del radicolo dopo 7 giorni, ma altri potrebbero richiedere diversi giorni in più per germinare.
I punti critici della procedura di trasformazione riguardano la scelta del materiale di partenza e la durata della fase di co-coltivazione. Per raggiungere una trasformazione efficiente, è meglio utilizzare steli sani e giovani o piccioli di piante coltivate in serra non sterili come materiale di partenza. Al fine di indurre la crescita di rami giovani, si consiglia di tagliare gli alberi Parasponia ogni 2-3 mesi e rinfrescare gli alberi una volta all'anno. Inoltre, la fase di co-coltivazione deve essere eseguita solo per 2 giorni. La co-coltivazione prolungata promuove l'eccessiva colonizzazione degli espianti tissutali da parte di A. tumefaciens e generalmente riduce l'efficienza di trasformazione. Per evitare l'eccessiva colonizzazione di A. tumefaciens è anche importante aggiornare regolarmente le piastre su cui vengono coltivati gli espianti. Nel caso in cui si verifichi una colonizzazione eccessiva, gli espianti tissutali potrebbero essere lavati (vedi Sezione 3.8) per rimuovere le cellule A. tumefaciens. Si consiglia di aggiungere candeggina alla soluzione SH-10 utilizzata per il lavaggio (concentrazione finale: ipocloreto del 2%). È importante notare che questa fase di lavaggio aggiuntiva potrebbe non funzionare su espianti fortemente infetti (Figura 2B). Nel caso in cui una trasformazione con un costrutto CRISPR/Cas9 produca solo un numero limitato di germogli con trasformazione putativa o se si prevede che la mutagenesi di un particolare gene causi problemi di rigenerazione, si consiglia di includere un costrutto di controllo vettoriale vuoto come il controllo positivo. Infine, è importante assicurarsi che tutte le linee transgeniche selezionate siano risultanti da eventi indipendenti di integrazione T-DNA. Pertanto, istruiamo a prendere solo un singolo germoglio putativamente transgenico da ogni lato di un eximpianto. Tuttavia, ci rendiamo conto che questo riduce il numero potenziale di linee indipendenti. Se sono necessarie molte linee, i ricercatori potrebbero decidere di separare calli formati in modo putativo dagli espianti originali quando questi calli hanno dimensioni e coltura di 2 mm in modo indipendente. In questo modo, più linee potrebbero essere isolate da ogni espianto, il che aumenta il numero di potenziali linee transgeniche.
Nel protocollo attuale, le linee transgeniche di P. andersonii vengono propagate vegetativamente attraverso la propagazione in vitro. Il vantaggio di questo è che molte pitole transgeniche possono essere generate in un periodo di tempo relativamente breve. Tuttavia, questo metodo ha anche diverse limitazioni. In primo luogo, il mantenimento delle linee transgeniche T0 attraverso la propagazione in vitro è laborioso e potrebbe provocare alterazioni genetiche o epigenetiche indesiderate34,35. In secondo luogo, le linee T0 contengono ancora una copia del T-DNA, compresa la cassetta di resistenza agli antibiotici. Questo limita il numero di possibili ritrasformazioni, poiché sono necessari marcatori di selezione diversi per ogni ritrasformazione. Attualmente, abbiamo testato la trasformazione solo utilizzando la kanamycin o la selezione dell'igromicina (dati non mostrati). Inoltre, la presenza della sequenza di codifica Cas9 e degli sgRNA nelle linee transgeniche T0 complica gli studi di complemento. I saggi di complemento sono possibili, ma richiedono che i siti di destinazione dello sgRNA siano mutati in quanto tale che sia impedito l'editing genico del costrutto di complemento. In terzo luogo, uno svantaggio di lavorare con le linee T0 è che i mutanti CRISPR/Cas9 potrebbero essere chimerici. Per prevenire l'analisi fenotipica delle linee mutanti chimetriche, si consiglia di ripetere l'analisi della genotipizzazione dopo la propagazione in vitro su almeno 3 diversi germogli. Anche se, il numero di mutanti chimerici ottenuti utilizzando il protocollo qui descritto è limitato, sono occasionalmente osservati10. Per superare i limiti di lavoro con le linee T 0, le linee mutanti P. andersonii potrebbero essere propagate generativamente. P. andersonii alberi sono dioecious e vento impollinato2. Ciò significa che ogni linea transgenica deve essere manipolata in modo tale che i fiori maschili e femminili siano prodotti su un singolo individuo e successivamente coltivati come tali che l'impollinazione incrociata non si verifichi. Poiché P. andersonii è un albero in rapida crescita, richiede una notevole quantità di spazio in una serra tropicale (28 , 85% di umidità relativa). Pertanto, anche se tecnicamente possibile, la propagazione generativa delle linee transgeniche P. andersonii è logisticamente impegnativa.
Nella sezione protocollo, abbiamo descritto 3 metodi per annuificare P. andersonii. Il vantaggio dei sistemi a piastre e sacca è che le radici sono facilmente accessibili, il che può consentire l'inoculazione spot dei batteri e seguire la formazione di noduli nel tempo. Tuttavia, il sistema di piastre è piuttosto laborioso, il che lo rende meno adatto per esperimenti di nodulation su larga scala. Uno svantaggio del sistema della sacca è che è difficile prevenire la contaminazione fungina. I sacchetti non sono sterili, e quindi la crescita fungina è spesso osservata nella metà superiore della sacca. Tuttavia, questo non influisce sulla crescita di P. andersonii, e quindi non interferisce con i saggi di annuizione. Inoltre, il sistema della sacca è adatto solo per piantine. Nonostante diversi tentativi, non siamo stati in grado di coltivare le piantine ottenute attraverso la propagazione in vitro nelle sacche.
La pipeline di genetica inversa P. andersonii descritta qui offre un miglioramento sostanzialerispetto al metodo di trasformazione delle radici basato su A. rhizogenes11 . Utilizzando le procedure descritte, le linee transgeniche stabili possono essere generate in modo efficiente e possono essere mantenute tramite la propagazione in vitro. Al contrario, la trasformazione di A. rhizogenes è transitoria e si traduce solo nella formazione di radici transgeniche. Poiché ogni radice transgenica deriva da una trasformazione indipendente, i saggi basati sulla trasformazione di A. rhizogenes soffrono di una sostanziale variazione fenotipica. Questa variazione è molto meno in caso di linee stabili, anche se la propagazione in vitro crea anche un certo livello di variazione. A causa di questa variazione ridotta e del fatto che più piastrine potrebbero essere fenotitizzate per ogni linea stabile, le linee stabili sono più adatte per i saggi quantitativi rispetto alle radici trasformate da A. rhizogenes. Inoltre, la trasformazione stabile non dipende dall'introduzione del locus che induce la radice di A. rhizogenes (rol) che colpisce l'equilibrio ormonale endogeno15. Pertanto, linee stabili sono più adatte per l'analisi genetica inversa dei geni coinvolti nell'omeostasi ormonale rispetto alle radici trasformate da A. rhizogenes. Un vantaggio più generale di P. andersonii come modello di ricerca è che non ha sperimentato una recente duplicazione dell'intero genoma (WGD). La sottofamiglia legume Papilionobiasi, che comprende il modello legumi M. truncatula e L. japonicus, così come il Salicaceae (ordine Malpighiales) che comprende l'albero modello Populus trichocarpa sperimentato WGDs 65 milioni di anni fa36,37. Molte copie geniche paralose risultanti da questi WGD sono conservate nei genomi di M. truncatula, L. japonicus e P. trichocarpa37,38,39, che crea ridondanza che potrebbe complicare le analisi genetiche inverse. Poiché P. andersonii non ha sperimentato un recente WGD, le analisi genetiche inverse su P. andersonii potrebbero essere meno influenzate dal funzionamento ridondante delle copie del gene paraloso.
Nel loro insieme, forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi genetica inversa in P. andersonii. Utilizzando questo protocollo, singole linee mutanti possono essere generate in modo efficiente in un lasso di tempo di 2-3 mesi10. Questo protocollo può essere esteso per creare mutanti di ordine superiore attraverso il multiplexing di sgRNA che prendono di mira diversi geni contemporaneamente, come mostrato per altre specie vegetali40,41,42. Inoltre, la procedura di trasformazione stabile qui descritta non si limita al targeting genico CRISPR/Cas9, ma potrebbe anche essere utilizzata per introdurre altri tipi di costrutti (ad esempio, per i saggi promotore-reporter, espressione ectopica o trans- complementari). Abbiamo stabilito P. andersonii come un modello di ricerca comparativa per studiare simbiosi mutualistici con rizobia che fissa l'azoto o funghi endomycorrizal. Tuttavia, i protocolli qui descritti forniscono anche strumenti per studiare altri aspetti della biologia di questo albero tropicale, come la formazione del legno, lo sviluppo di fiori bisessuali o la biosintesi dei metaboliti secondari specifici di Cannabaceae.

Parasponia andersonii è un albero tropicale appartenente alla famiglia Cannabis (Cannabaceae) ed è nativo di Papua Nuova Guinea e diverse isole del Pacifico1,2,3. Insieme ad altre 4 specie di Parasponia, rappresenta l'unico lignaggio non legume in grado di stabilire una simbiosi nodule che fissa l'azoto con la rizobia. Questa simbiosi è ben studiata nei modelli di legume (Fabaceae) Medicago truncatula e Lotus japonicus, che ha portato all'acquisizione di una conoscenza dettagliata della natura genetica molecolare della formazione dei noduli e del funzionamento4. Inoltre, è stato dimostrato che la simbiosi nodule radice nei legumi si basa sulla simbiosi micorrizica molto più antica e diffusa5 . I confronti filogenomici suggeriscono che le simbiosi noduli che fissano l'azoto dei legumi, Parasponia, così come le cosiddette specie di piante actinorhizal che ospitano batteri Frankia diazotrofica che ospitano, hanno un'origine evolutiva condivisa 6,7,8. Per determinare se i geni identificati per essere coinvolti nella formazione del nodulo legume sono parte di una base genetica conservata, gli studi sulle specie non legumi sono essenziali. A tal fine, proponiamo di utilizzare P. andersonii come modello di ricerca comparativa, insieme ai legumi, per identificare le reti genetiche fondamentali alla base della formazione e del funzionamento dei noduli delle radici.
P. andersonii è un pioniere che si può trovare sulle pendici delle colline vulcaniche. Può soddisfare velocità di crescita di 45 cm al mese e raggiungere lunghezze fino a 10 metri9. P. andersonii alberi sono impollinati dal vento, che è facilitato dalla formazione di fiori maschili e femminili separati3,10. Recentemente abbiamo sequenziato e annotato il genoma diploide (2n - 20; 560 Mb/1C) di P. andersonii, e assemblato sequenze di genoma di progetto di 2 specie aggiuntive di Parasponia; P. rigida e P. rugosa6. Questo ha rivelato 35.000 dollari modelli genici P. andersonii che possono essere raggruppati in >20,000 ortogruppi insieme ageni da M. truncatula, soybean (Glycine max), Arabidopsis thaliana, fragola bosco ( Fragaria vesca), Trema orientalis, pioppo di cotone nero (Populus trichocarpa) e eucalipto (Eucalyptus grandis)6. Inoltre, i confronti tratrascrittomi tra M. truncatula e P. andersonii hanno identificato una serie di 290 ortologhi putativi che mostrano un modello di espressione con valori nodulo in entrambe le specie6. Ciò costituisce un'eccellente risorsa per gli studi comparativi.
Per studiare la funzione genica nelle radici e nei noduli di P. andersonii, è stato stabilito un protocollo per la trasformazione della radice mediata Agrobacterium -mediata11. Utilizzando questo protocollo, le piante composte che portano radici transgeniche possono essere generate in un lasso di tempo relativamente breve. Questo metodo è, inoltre, ampiamente applicato nella ricerca legume-simbiosi12,13,14. Tuttavia, lo svantaggio di questo metodo è che solo le radici vengono trasformate e che ogni radice transgenica rappresenta un evento di trasformazione indipendente, con conseguente variazione sostanziale. Inoltre, la trasformazione è transitoria e le linee transgeniche non possono essere mantenute. Questo rende la trasformazione della radice basata su A. rhizogenesmeno adatta per l'editing genomico mediato da CRISPR/Cas9. Inoltre, A. rhizogenes trasferisce i suoi geni locus (rol) che inducevano la radice al genoma della pianta, che una volta esprimeva interferiscono con l'omeostasi dell'ormone15. Questo rende difficile studiare il ruolo degli ormoni vegetali nelle radici trasformate da A. rhizogenes. Per superare questi limiti, abbiamo recentemente sviluppato un protocollo per la trasformazione basata su Agrobacterium tumefaciense la mutagenesi mediata CRISPR/Cas9 di P. andersonii10.
Qui, forniamo una descrizione dettagliata della procedura di trasformazione a. tumefaciense della pipeline di genetica inversa sviluppata per P. andersonii. Inoltre, forniamo protocolli per la gestione a valle delle piastrine transgeniche, inclusi i saggi per studiare le interazioni simbiotiche. Utilizzando il protocollo qui descritto, possono essere generate più linee transgeniche in un periodo di 2-3 mesi. In combinazione con la mutagenesi mediata DA CRISPR/Cas9, questo permette una generazione efficiente di linee mutanti ad eliminazione diretta. Queste linee mutanti possono essere propagate in vitro10,16,17, il che consente di generare materiale sufficiente per iniziare la caratterizzazione fenotipica a 4 mesi dopo che la procedura di trasformazione è stata stato avviato10. Insieme, questa serie di procedure dovrebbe consentire a qualsiasi laboratorio di adottare P. andersonii come modello di ricerca per studi volti a comprendere le associazioni rizobiali e micorriche, nonché potenzialmente altri aspetti della biologia di questo albero tropicale.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii è un albero tropicale in rapida crescita che appartiene alla famiglia Cannabis (Cannabaceae). Insieme a 4 specie aggiuntive, forma l'unico lignaggio non legume conosciuto in grado di stabilire una simbiosi nodule che fissa l'azoto con il rizobio. Studi comparativi tra legumi e P. andersonii potrebbero fornire preziose informazioni sulle reti genetiche alla base della formazione dei noduli delle radici. Per facilitare gli studi comparativi, abbiamo recentemente sequenziato il genoma di P. andersonii e stabilito Agrobacterium tumefaciens- mediato trasformazione stabile e editing del genoma basato su CRISPR/Cas9. Qui, forniamo una descrizione dettagliata delle procedure di trasformazione e di editing del genoma sviluppate per P. andersonii. Inoltre, descriviamo le procedure per la germinazione dei semi e la caratterizzazione dei fenotipi simbiotici. Utilizzando questo protocollo, possono essere generate linee mutanti transgeniche stabili in un periodo di 2-3 mesi. La propagazione vegetativa nella propagazione in vitro delle linee transgeniche T0 consente di avviare esperimenti di fenotipizzazione a 4 mesi dopo la co-coltivazione di A. tumefaciens. Pertanto, questo protocollo richiede solo marginalmente più tempo del metodo transitorio di trasformazione della radice basato su Agrobacterium rhizogenesdisponibile per P. andersonii, anche se offre diversi vantaggi chiari. Insieme, le procedure qui descritte permettono a P. andersonii di essere utilizzato come modello di ricerca per studi volti a comprendere le associazioni simbiotiche e potenzialmente altri aspetti della biologia di questo albero tropicale.

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Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii è un albero tropicale in rapida crescita che appartiene alla famiglia Cannabis (Cannabaceae) e può formare noduli di radice che fissano l'azoto in associazione con il rizobium. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per le analisi genetiche inverse in P. andersonii basato su Agrobacterium tumefaciens- mediato trasformazione stabile e modifica del genoma CRISPR/Cas9.

Trasformazione, editing del genoma e fenotipizzazione dell'azoto-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia è un albero tropicale della famiglia cannabis che è in grado di stabilire una simbiosi azotofissante con il rizobio. Studi comparativi tra Parasponia e legumi potrebbero fornire informazioni sulle reti genetiche principali alla base della simbiosi del rizobio. Con questo protocollo, le linee mutanti transgeniche stabili parasponia andersonii possono essere generate in un periodo di due o tre mesi.Queste linee possono essere propagate in modo efficiente attraverso la propagazione in vitro. Questo protocollo fornisce una piattaforma sperimentale per studiare la simbiosi rizobiale così come altri aspetti della biologia di questo albero tropicale. Le competenze di base nella coltura tissutale e nella clonazione molecolare sono sufficienti per implementare questo protocollo.Ciò consente a qualsiasi laboratorio di adattare Parasponia come modello di ricerca. A dimostrare la procedura saranno i dottorandi Titis Wardhani e Yuda Roswanjaya insieme a Marijke Hartog, un tecnico del nostro laboratorio. Per coltivare gli alberi di Parasponia andersonii, inizia germogliando i semi.Rimuovere i semi dalle bacche di Parasponia strofinandoli contro l'interno di un setaccio del tè o schiacciandoli su un pezzo di carta velina. Disinfettare i semi usando il 4% di candeggina di ipoclorito per 15-20 minuti, quindi lavare i semi sei volte con acqua sterilizzata. Trasferire i semi in tubi PCR sterili da 200 microliter e riempire i tubi con acqua sterilizzata per immergere i semi.Incubare i tubi per 10 giorni in un termociclo secondo le indicazioni manoscritte. Dopo l'incubazione di 10 giorni, trasferire i semi su piastre SH-0 e chiuderli con due strati di foglio di tenuta elastico per evitare l'essiccazione. Incubare a 28 gradi Celsius con un ciclo di 16 ore al giorno, otto ore-notte per tre o quattro settimane.Una volta che le piantine sviluppano il loro primo set di foglie vere, trasferiscile in vasi pieni di terreno di invaso commerciale e coprili con una tazza di plastica traslucida per prevenire l'essiccazione. Metti le pentole in una stanza climatica o in una serra di 28 gradi Celsius, 85% di umidità relativa o serra sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore di notte. Dopo una settimana, rimuovere la tazza di plastica.Innaffiare regolarmente i vasi e integrare con fertilizzante per sostenere la crescita degli alberi. Preparati alla trasformazione raccogliendo giovani rami da cinque a otto centimetri dagli alberi coltivati in serra, assicurandoti di utilizzare solo rami sani e non infetti. Tagliare le foglie, lasciando un centimetro al quadrato di tessuto fogliare alla fine di ogni picciolo.Disinfettare il tessuto per 15 minuti con candeggina di ipoclorito al 2% contenente alcune gocce di polisorbato 20, quindi sciacquarlo otto volte con acqua autoclavata. Sospendere di nuovo le cellule di Agrobacterium in 25 millilitri di mezzo di infiltrazione fino a una densità ottica di circa cinque. Tagliare il gambo e il tessuto del picciolo in pezzi di un centimetro all'interno della sospensione cellulare.Rimuovere i tessuti fogliari e incubare il gambo e i pezzi di picciolo nella sospensione cellulare per 10-30 minuti. Asciugare i pezzi di tessuto su un pezzo sterile di carta da filtro e metterli su un supporto di radicamento preparato secondo le indicazioni manoscritte. Incubare le piastre al buio a 21 gradi Celsius per due giorni.Dopo i due giorni, ispezionare le piastre per la contaminazione fungina o batterica e scartare le piastre contaminate. Trasferire i pezzi di tessuto a 10 millilitri di mezzo SH-10 preparato secondo le indicazioni manoscritte. Lasciare il tessuto nel mezzo per almeno 10 minuti e agitare delicatamente ogni due o tre minuti per lavarlo.Preparare il supporto di radicamento con cefotaxime e kanamicina secondo le indicazioni del manoscritto e versare le tavole. Asciugare i tessuti su pezzi sterili di carta da filtro e trasferirli sulle piastre. Incubare le piastre per sette giorni a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore-notte.Controllare le piastre per la contaminazione fungina o batterica ogni due giorni. In caso di contaminazione, trasferire i pezzi di tessuto non infetti su una piastra fresca. Dopo sette giorni, trasferire i pezzi di tessuto su un mezzo di propagazione preparato secondo le indicazioni manoscritte e incubare a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore-notte.Aggiornare le piastre una volta alla settimana fino a quando non si sviluppano germogli transgenici, assicurandosi di trasferire solo pezzi di tessuto non infetti su nuove piastre. Una volta che i germogli transgenici putativi sono lunghi almeno un centimetro, tagliare i germogli e colturarli in modo indipendente nel mezzo di propagazione con antibiotici. Per assicurarsi che i germogli rappresentino trasformatori indipendenti, prendi un solo germoglio da ciascun lato di un'espianto.Propagare il tessuto posizionando circa 10 germogli su una piastra fresca di mezzo di propagazione e chiudendo la piastra con due strati di foglio di tenuta elastico. Incubare le piastre a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore di notte, e ripetere questo passaggio ogni quattro settimane. Quando i germogli raggiungono un centimetro di lunghezza, tagliarli alla loro base e posizionarli sul mezzo di radicamento.Posizionare i germogli in posizione verticale inserendo la punta basale del germoglio nel mezzo. Circa 10 germogli possono essere posizionati su una singola piastra. Inizia preparando il rhizobium inoculum.Inoculare 10 millilitri di mezzo YEM liquido da una singola colonia di Mesorhizobium plurifarium BOR2 e incubare a 28 gradi Celsius per due giorni. Utilizzare questa coltura per inoculare un volume maggiore di mezzo YEM liquido. Una volta coltivato, centrifugare la coltura batterica per 10 minuti a 3.500 volte g per raccogliere le cellule.Sospendere di nuovo il pellet batterico nel mezzo liquido EKM e determinare la densità ottica. Preparare tre litri di mezzo EKM, che è sufficiente per circa 20 vasi, e inocularlo con la sospensione rizobiale. Mescolare il mezzo con 1,25 chilogrammi di perlite e aggiungere 210 grammi di questa miscela a pentole sterili in polipropilene traslucido.Piantare da una a tre plantlet Parasponia andersonii ad ogni vaso e preparare diversi vasi con plantlet trasformate con il costrutto di controllo. Pesare molti dei vasi e coprire il fondo di ogni pentola per proteggere le radici dall'esposizione alla luce. Incubare i vasi in una sala di crescita climatizzata a 28 gradi Celsius sotto un regime di 16 ore al giorno, otto ore-notte per quattro o sei settimane.Una volta alla settimana, pesare diverse pentole per determinare la perdita d'acqua. Se la perdita d'acqua supera i 10 millilitri, integrare con acqua ultra pura per compensare la perdita. Dopo l'incubazione, pulire le radici dalla perlite e determinare i numeri dei noduli usando un binocolo.Questa tecnica è stata utilizzata per trasformare con successo piioli e segmenti di steli Parasponia andersonii con ceppo agrobatterio AGL1. In primo luogo, le espianto tissutali vengono co-coltivate con Agrobacterium per due giorni. La co-coltivazione prolungata si traduce in una sovraco colonizzazione batterica e dovrebbe essere prevenuta.Poche settimane dopo, piccoli micro-calli verdi si osservano lungo la superficie della ferita originale. Questi calli continuano a crescere e sviluppare uno o più germogli trasformati putativamente a sei-otto settimane dall'inizio della trasformazione. Le efficienze di trasformazione variano dal 10 al 30% per gli espianto tissutale dai rami maturi al 65-75% per le espianto tissutale da rami giovani e in rapida crescita.I germogli transgenici possono essere moltiplicati attraverso la propagazione in vitro, che dà origine a decine di germogli entro un mese. Questi germogli possono essere posizionati su un mezzo di radicamento che indurrà la formazione di radici in circa due settimane e produrrà piante che possono essere utilizzate per la sperimentazione. Quando si avvia un esperimento di trasformazione stabile, è importante selezionare rami sani come materiale di origine.Le linee transgeniche Parasponia T0 vengono propagate in vitro. Pertanto, è essenziale genotipare accuratamente le linee transgeniche Parasponia. L'istituzione della Parasponia come modello sperimentale consente l'analisi comparativa tra due lignaggi nodulanti lontanamente correlati, Parasponia e legumi.Ciò potrebbe identificare le reti genetiche di conservazione alla base della simbiosi del rizobio. La parasponia può anche essere un modello prezioso per studiare altri argomenti di ricerca come la formazione del legno, lo sviluppo di fiori bisessuali o la biosintesi dei metaboliti secondari specifici delle Cannabaceae.

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Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

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Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

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Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

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Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

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Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

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Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

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CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

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