Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Forfatterne liker å anerkjenne Markus Youles, Sophien Kamoun og Sylvestre Marillonnet for å lage Golden Gate kloning deler tilgjengelig gjennom Addgene databasen. I tillegg vil vi gjerne takke E. James, P. Hadobas, og T. J. Higgens for p. andersonii frø. Dette arbeidet ble støttet av Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-åpen konkurranse stipend 819.01.007) og departementet for forskning, teknologi og høyere utdanning i republikken Indonesia (RISET-PRO Grant 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Belgfrukter og den fjernt-relaterte Cannabaceae slekten Parasponia representerer de eneste to klader av plantearter i stand til å etablere et endosymbiotic forhold til nitrogen-fixing rhizobia og danner rot knuter. Sammenlignende studier mellom arter av begge klader er svært relevante for å gi innsikt i de viktigste genetiske nettverkene som tillater dette symbiose. For tiden er genetiske studier i hovedsak gjort i belgfrukter; spesielt de to modell artene M. truncatula og L. japonicus. For å gi en ekstra eksperimentell plattform og tilrettelegge komparative studier med en nodulating ikke-legume, beskriver vi her en detaljert protokoll for stabil transformasjon og omvendt genetiske analyser i P. andersonii. Den presenterte protokollen bruker in vitro forplantning av T0 transgene P. andersonii linjer, slik at fenotypiske analyse skal igangsettes innen 4 måneder etter A. tumefaciens co-dyrking. Dette er vesentlig raskere enn dagens protokoller som er etablert for stabil transformasjon av belgfrukter33. Dette gjør P. andersonii en attraktiv forsknings modell.
Protokollen som beskrives her, inneholder flere viktige trinn. Det første som angår frø spire. For å forberede P. andersonii frø for spire, frø må isoleres fra bær. Dette gjøres ved å gni bærene på et stykke silkepapir eller mot innsiden av en te sil. Denne prosedyren må utføres forsiktig for å hindre skade på frø pelsen. Hvis frøet pelsen blir skadet, blekemiddel kunne gå inn i frøet under sterilisering, noe som reduserer frø levedyktighet. Å bryte frø dormancy, frø er utsatt for en 10-dagers temperatur syklus. Men til tross for denne behandlingen, er spire ikke helt synkronisert. Vanligvis, de første frøene viser radicle fremveksten etter 7 dager, men andre kan ta flere dager lengre tid å spire.
Kritiske punkter i transformasjon prosedyren gjelder valg av Start materialet og varigheten av co-dyrking trinn. For å nå effektiv transformasjon, er det best å bruke sunne og unge stengler eller petioles av ikke-sterile drivhus dyrket planter som utgangsmaterialet. For å indusere veksten av unge grener, er det tilrådelig å trimme Parasponia trær hver 2-3 måneder og friske trær en gang i året. I tillegg må co-dyrking trinn skal utføres for 2 dager bare. Langvarig co-dyrking fremmer over-kolonisering av vev explants av A. tumefaciens og generelt reduserer transformasjon effektivitet. For å hindre over-kolonisering av A. tumefaciens det er også viktig å regelmessig oppdatere platene som explants er dyrket. I tilfelle over-kolonisering forekommer, kan vevs explants vaskes (se Seksjon 3,8) for å fjerne A. tumefaciens celler. Vi anbefaler å legge blekemiddel til SH-10 løsning som brukes til vask (endelig konsentrasjon: ~ 2% natriumhypokloritt). Det er viktig å merke seg at dette ekstra vaske trinnet kanskje ikke fungerer på tungt infiserte explants (figur 2b). I tilfelle en transformasjon med en CRISPR/Cas9 konstruere gir bare et begrenset antall påstått-transformert skudd eller hvis mutagenese av et bestemt gen er forventet å forårsake problemer i regenerering, er det tilrådelig å inkludere en tom vektor kontroll konstruere som den positive kontrollen. Til slutt er det viktig å sikre at alle transgene-linjer som velges er et resultat av uavhengige hendelser i T-DNA-integrasjon. Derfor instruerer vi til å ta bare ett påstått-transgene Shoot fra hver side av en explant. Vi innser imidlertid at dette reduserer det potensielle antallet uavhengige linjer. Hvis mange linjer er nødvendig, kan forskerne bestemme seg for å skille påstått-forvandlet calli fra den opprinnelige explants når disse calli er ≥ 2 mm i størrelse og kultur disse calli uavhengig. På denne måten kan flere linjer isoleres fra hver explant, noe som øker antall potensielle transgene linjer.
I den gjeldende protokollen, transgene linjer av P. andersonii spres vegetativt gjennom in vitro forplantning. Fordelen med dette er at mange transgene plantlets kan genereres på relativt kort tidsperiode. Imidlertid har denne metoden også flere begrensninger. For det første er vedlikeholdet av T0 transgene Lines gjennom in vitro forplantning arbeidsintensiv og kan føre til uønskede genetiske eller epigenetic endringer34,35. For det andre, T0 linjer fortsatt inneholde en kopi av t-DNA, inkludert antibiotikaresistens kassetten. Dette begrenser antall mulige re-transformasjoner, som ulike utvalgs markører er nødvendig for hver re-transformasjon. Foreløpig har vi bare testet transformasjon ved hjelp av kanamycin eller hygromycin utvalg (data ikke vist). Videre, tilstedeværelsen av Cas9-koding sekvens og sgRNAs i T0 transgene linjene kompliserer komplementering studier. Komplementering analyser er mulig, men krever sgRNA målområdet (e) for å være mutert som sådan at gen-redigering av komplementering konstruere er forhindret. For det tredje, en ulempe med å arbeide med T0 linjer er at CRISPR/Cas9 mutanter kan være chimeric. For å forhindre fenotypiske analyse av chimeric mutant linjer anbefaler vi at du gjentar genotyperingteknologi analysen etter in vitro-forplantning på minst 3 forskjellige skudd. Selv om antall chimeric mutanter innhentet ved hjelp av protokollen som er beskrevet her er begrenset, de er tidvis observert10. For å overvinne begrensningene ved å arbeide med T0 linjer, kan P. andersonii mutant linjer overføres generatively. P. andersonii trær er dioecious og vind-pollinated2. Dette betyr at hver transgene linje må manipuleres som sådan at mannlige og kvinnelige blomster er produsert på en enkelt person, og senere vokst som sådan at korset pollinering ikke oppstår. Som P. andersonii er en raskt voksende treet det krever en betydelig mengde plass i et tropisk drivhus (28 ° c, ~ 85% relativ fuktighet). Derfor, selv om det er teknisk mulig, er generative forplantning av P. andersonii transgene Lines logistisk utfordrende.
I protokoll seksjonen har vi beskrevet 3 metoder for nodulation av P. andersonii. Fordelen med platen og posen systemer er at røttene er lett tilgjengelig, som kan tillate flekk-inoculation av bakterier og etter nodule formasjon over tid. Imidlertid er plate systemet ganske arbeidsintensiv, noe som gjør det mindre egnet for store nodulation eksperimenter. En ulempe med posen systemet er at det er vanskelig å hindre sopp forurensning. Poser er ikke sterile, og derfor soppvekst er ofte observert på den øverste halvdelen av posen. Men dette påvirker ikke P. andersonii vekst, og derfor ikke forstyrrer nodulation analyser. I tillegg er posen systemet kun egnet for frøplanter. Til tross for flere forsøk, har vi ikke vært i stand til å vokse plantlets innhentet gjennom in vitro forplantning i poser.
P. andersonii omvendt genetikk rørledningen beskrevet her gir en betydelig forbedring i forhold til den eksisterende a. rhizogenes-basert root Transformation metode11. Ved hjelp av de beskrevne prosedyrene kan stabile transgene-linjer genereres effektivt og kan opprettholdes via in vitro-forplantning. I kontrast er A. rhizogenes transformasjon forbigående og resulterer bare i dannelsen av transgene røtter. Fordi hver transgene root resultater fra en uavhengig transformasjon, A. rhizogenes transformasjon-baserte analyser lider av betydelig fenotypiske variasjon. Denne variasjonen er mye mindre i tilfelle av stabile linjer, selv om in vitro forplantning også skaper noen grad av variasjon. På grunn av denne reduserte variasjonen og det faktum at flere plantlets kunne phenotyped for hver stabil linje, er stabile linjer mer egnet for kvantitative analyser sammenlignet med en. rhizogenes-forvandlet røtter. I tillegg er den stabile transformasjonen ikke avhengig av innføringen av A. rhizogenes root inducing geometriske (ROL) som påvirker den endogene hormonet balanse15. Derfor stabile linjer er bedre egnet for omvendt genetisk analyse av gener involvert i hormon homeostase sammenlignet med A. rhizogenes-forvandlet røtter. En mer generell fordel av P. andersonii som forsker modell er at det ikke opplever en nylig hele Genova DUPLISERING (WGD). Den legume Papilionoideae gruppe, som inkluderer modellen belgfrukter M. truncatula og L. Japonicus, samt Vierfamilien (rekkefølge Malpighiales) som inkluderer modelltreet Populus trichocarpa erfarne WGDs ~ 65 millioner år siden36,37. Mange paralogous Gene eksemplarer som følge av disse WGDs er beholdt i genomer av M. truncatula, L. japonicus og P. trichocarpa37,38,39, som skaper redundans som kan komplisere omvendt genetiske analyser. Ettersom p. andersonii ikke opplevde en nylig WGD, kan omvendt genetiske analyser på P. andersonii bli mindre påvirket av overflødig paralogous gen kopier.
Samlet gir vi en detaljert protokoll for omvendt genetisk analyse i P. andersonii. Ved hjelp av denne protokollen, kan enkelt mutant linjer effektivt genereres i en tidsramme på 2-3 måneder10. Denne protokollen kan utvides til å skape høyere orden mutanter gjennom multipleksing av sgRNAs målretting ulike gener samtidig, som vist for andre plantearter40,41,42. I tillegg er den stabile transformerings prosedyren som beskrives her, ikke begrenset til CRISPR/Cas9 gen målretting, men kan også brukes til å innføre andre typer konstruksjoner (f.eks. for promoter-reporter-analyser, svangerskap/formidling eller trans- komplementering). Vi etablerte P. andersonii som en komparativ forsknings modell for å studere mutualistic symbioses med nitrogen-fixing rhizobia eller endomycorrhizal sopp. Men protokollene beskrevet her også gi verktøy for å studere andre aspekter av biologi av dette tropiske treet, slik som tre dannelse, utvikling av bi-seksuelle blomster eller biosyntesen av Cannabaceae-spesifikke sekundære metabolitter.

Parasponia andersonii er et tropisk tre som tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og er innfødt til Papua Ny Guinea og flere Stillehavsøyene1,2,3. Sammen med 4 ekstra Parasponia arter, representerer den den eneste ikke-legume avstamning som kan etablere en nitrogen-fixing nodule symbiose med rhizobia. Dette symbiose er godt studert i legume (Fabaceae) modeller Medicago truncatula og Lotus japonicus, som har resultert i å anskaffe detaljert kunnskap om den molekylære genetiske natur nodule formasjon og funksjon4. I tillegg ble det demonstrert at roten nodule symbiose i belgfrukter er grunnlagt på den mye eldre, og utbredt arbuscular mycorrhizal symbiose5. Phylogenomic sammenligninger tyder på at nitrogen-fixing nodule symbioses av belgfrukter, Parasponia, så vel som, den såkalte actinorhizal plantearter som er vert diazotrophic Frankia bakterier, har en felles evolusjonær opprinnelse 6,7,8. For å avgjøre om genene identifisert å være involvert i legume nodule formasjon er den delen av en bevart genetisk basis, studier på ikke-legume arter er avgjørende. For dette formål, foreslår vi å bruke P. andersonii som en komparativ forsknings modell, sammen med belgfrukter, for å identifisere kjernen genetiske nettverk underliggende root nodule formasjon og funksjon.
P. andersonii er en pioner som kan bli funnet i bakkene av vulkanske åser. Det kan møte vekst hastigheter på 45 cm per måned og nå lengder på opptil 10 meter9. P. andersonii trær er vind-pollinated, som er tilrettelagt ved dannelsen av separate mannlige og kvinnelige blomster3,10. Vi har nylig sekvensert og kommenterte diploid Genova (2n = 20; 560 MB/1C) av P. andersonii, og samlet utkast til Genova sekvenser av 2 ekstra Parasponia arter; P. Rigida og p. rugosa6. Dette avslørte ~ 35 000 P. andersonii gen modeller som kan grupperes i > 20000 orthogroups sammen med gener fra M. truncatula, soyabønner (Glycine Max), Arabidopsis thaliana, skog jordbær ( Fragaria jordbær), trema orientalis, svart bomull poppel (Populus trichocarpa) og eucalypt (eucalyptus grandis)6. I tillegg transcriptome sammenligninger mellom M. truncatula og P. andersonii identifiserte et sett med 290 antatte orthologues som viser et nodule-forbedret uttrykks mønster i begge artene6. Dette gir en utmerket ressurs for sammenlignende studier.
For å studere gen funksjonen i P. andersonii røtter og knuter, har det blitt etablert en protokoll for Agrobacterium rhizogenes-mediert rot transformasjon11. Ved hjelp av denne protokollen, sammensatte planter bærende transgene røtter kan genereres i en relativt kort tidsramme. Denne metoden er også mye brukt i legume-symbiose forskning12,13,14. Men ulempen med denne metoden er at bare røttene er forvandlet og at hver transgene root representerer en uavhengig transformasjon hendelse, noe som resulterer i betydelig variasjon. Transformasjonen er også forbigående og transgene Lines kan ikke opprettholdes. Dette gjør en. rhizogenes-basert root transformasjon mindre egnet for CRISPR/Cas9-mediert Genova redigering. I tillegg, A. rhizogenes overfører sine root inducing geometrisk knute punkt (ROL) gener til anlegget Genova, som en gang uttrykt forstyrre hormon homeostase15. Dette gjør studere rollen av plantehormoner i A. rhizogenes-forvandlet røtter utfordrende. For å overkomme disse begrensningene har vi nylig utviklet en protokoll for Agrobacterium tumefaciens-basert transformasjon og CRISPR/Cas9-mediert mutagenese av P. andersonii10.
Her gir vi en detaljert beskrivelse av a. tumefaciens-basert transformasjon prosedyre og omvendt genetikk rørledning utviklet for P. andersonii. I tillegg gir vi protokoller for nedstrøms håndtering av transgene plantlets, inkludert analyser for å studere symbiotisk interaksjoner. Ved å bruke protokollen som er beskrevet her, kan flere transgene-linjer genereres i løpet av en 2-3 måneders periode. I kombinasjon med CRISPR/Cas9-mediert mutagenese, dette tillater effektiv generering av knockout mutant linjer. Disse muterte linjene kan vegetativt spres i vitro10,16,17, som tillater tilstrekkelig materiale skal genereres for å starte fenotypiske karakterisering på 4 måneder etter at transformasjonen prosedyren har blitt igangsatt10. Sammen, dette settet med prosedyrer bør tillate enhver Lab å vedta P. andersonii som en forsknings modell for studier som tar sikte på å forstå rhizobial og mycorrhizal foreninger, samt potensielt andre aspekter av biologi av dette tropiske treet.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii er et raskt voksende tropisk tre som tilhører cannabis-familien (Cannabaceae). Sammen med 4 andre arter, danner det den eneste kjente ikke-legume avstamning i stand til å etablere en nitrogen-fixing nodule symbiose med Rhizobium. Sammenlignende studier mellom belgfrukter og P. andersonii kan gi verdifull innsikt i de genetiske nettverkene underliggende root nodule formasjon. For å lette sammenlignende studier, vi nylig sekvensert P. andersonii Genova og etablerte Agrobacterium tumefaciens-MEDIERT stabil transformasjon og CRISPR/Cas9-baserte Genova redigering. Her gir vi en detaljert beskrivelse av transformasjon og Genova redigerings prosedyrer utviklet for P. andersonii. I tillegg beskriver vi prosedyrer for frøet spire og karakterisering av symbiotisk fenotyper. Ved hjelp av denne protokollen kan stabile transgene mutant linjer genereres i en periode på 2-3 måneder. Vegetative in vitro-spredning av T0 transgene Lines gjør det mulig for bestemmelse av fenotype eksperimenter å initieres ved 4 måneder etter A. tumefaciens co-dyrking. Denne protokollen tar derfor bare marginalt lenger enn den midlertidige Agrobacterium rhizogenesrot transformerings metoden som er tilgjengelig for P. andersonii, men tilbyr flere klare fordeler. Sammen prosedyrene beskrevet her tillater P. andersonii skal brukes som en forsknings modell for studier som tar sikte på å forstå symbiotisk foreninger så vel som potensielt andre aspekter av biologi av denne tropiske treet.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii er et raskt voksende tropisk tre som tilhører cannabis-familien (Cannabaceae) og kan danne nitrogen-fixing rot knuter i forbindelse med Rhizobium. Her beskriver vi en detaljert protokoll for omvendt genetiske analyser i P. andersonii basert på Agrobacterium tumefaciens-MEDIERT stabil transformasjon og CRISPR/Cas9-baserte Genova redigering.

Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia er et tropisk tre fra Cannabis-familien som er i stand til å etablere en nitrogen-fikse symbiose med rhizobium. Komparative studier mellom Parasponia og belgfrukter kan gi innsikt i de viktigste genetiske nettverkene underliggende rhizobium symbiose. Med denne protokollen kan Parasponia andersonii stabile transgene muterte linjer genereres i en periode på to til tre måneder.Disse linjene kan effektivt forplantes gjennom in vitro forplantning. Denne protokollen gir en eksperimentell plattform for å studere rhizobial symbiose samt andre aspekter av biologien til dette tropiske treet. Grunnleggende ferdigheter i vevskultur og molekylær kloning er tilstrekkelig til å implementere denne protokollen.Dette gjør det mulig for ethvert laboratorium å tilpasse Parasponia som forskningsmodell. Demonstrerte prosedyren vil være ph.d.-studentene Titis Wardhani og Yuda Roswanjaya sammen med Marijke Hartog, en tekniker i laboratoriet vårt. For å dyrke Parasponia andersonii trær, begynn med å spire frøene.Fjern frøene fra Parasponia bær ved å gni mot innsiden av en te sil eller squashing dem på et stykke vev papir. Desinfiser frø ved hjelp av 4% hypoklorittblekemiddel i 15 til 20 minutter, og vask deretter frøene seks ganger med sterilisert vann. Overfør frøene til sterile 200 mikroliter PCR-rør, og fyll rørene med sterilisert vann for å senke frøene.Inkuber rørene i 10 dager i en termocycler i henhold til manuskriptretninger. Etter 10-dagers inkubasjon, overfør frøene til SH-0 plater, og lukk dem med to lag elastisk tetningsfolie for å forhindre tørking. Inkuber ved 28 grader Celsius med en 16-timers, åtte-timers-natt syklus i tre til fire uker.Når plantene utvikler sitt første sett med sanne blader, overføre dem til potter fylt med kommersiell potting jord, og dekke dem med en gjennomskinnelig plastkopp for å hindre uticcation. Plasser pottene i et 28-graders Celsius, 85% relativ fuktighetsklima eller drivhus under et 16-timers, åtte timers nattregime. Etter en uke, fjern plastkoppen.Regelmessig vann pottene, og supplere med gjødsel for å opprettholde trevekst. Forbered deg på transformasjon ved å høste unge fem til åtte centimeter grener fra drivhusdyrkede trær, og sørg for å bruke bare sunne, ikke-infiserte grener. Klipp av bladene, og la en centimeter kvadrert av bladvev på slutten av hvert petiole.Desinfiser vevet i 15 minutter med 2% hypoklorittblekemiddel som inneholder noen dråper polysorbat 20, og skyll det deretter åtte ganger med autoklavet vann. Re-suspendere Agrobacterium celler i 25 milliliter infiltrasjon medium til en optisk tetthet på ca fem. Skjær stammen og petiole vev i en centimeter stykker inne i cellesuspensjonen.Fjern bladvevet og inkuber stammen og petiolebitene i cellesuspensjonen i 10 til 30 minutter. Tørk vevsbitene på et sterilt stykke filterpapir og legg dem på rooting medium utarbeidet i henhold til manuskriptretninger. Inkuber platene i mørket ved 21 grader Celsius i to dager.Etter de to dagene, inspiser platene for sopp eller bakteriell forurensning og kast forurensede plater. Overfør vevsbitene til 10 milliliter SH-10 medium utarbeidet i henhold til manuskriptretninger. La vevet stå i mediet i minst 10 minutter, og rør forsiktig hvert to til tre minutt for å vaske.Forbered rotingsmediet med cefotaxime og kanamycin i henhold til manuskriptets retninger, og hell plater. Tørk vevet på sterile biter av filterpapir, og overfør dem til platene. Inkuber plater i syv dager ved 28 grader Celsius under en 16-timers, åtte-timers-natt diett.Sjekk platene for sopp- eller bakteriekontaminering annenhver dag. Hvis det oppstår kontaminering, overfør de ikke-infiserte vevsbitene til en ny plate. Etter syv dager, overføre vev stykker til forplantning medium utarbeidet i henhold til manuskript retninger og inkubere på 28 grader Celsius under en 16-timers-dag, åtte-timers-natt diett.Oppdater platene en gang i uken til transgene skudd utvikler seg, og sørg for å bare overføre ikke-infiserte vevsbiter til nye plater. Når de antatte transgene skuddene er minst en centimeter lang, kutt skuddene og kultur dem uavhengig i forplantningsmedium med antibiotika. For å sikre at skuddene representerer uavhengige transformanter, ta bare et enkelt skudd fra hver side av en explant.Forplant vevet ved å plassere ca 10 skudd på en frisk plate av forplantningsmedium og lukke platen med to lag elastisk tetningsfolie. Inkuber platene ved 28 grader Celsius under en 16-timers, åtte-timers-natt diett, og gjenta dette trinnet hver fjerde uke. Når skuddene når en centimeter i lengde, kutt dem på basen og plasser dem på rotmediet.Plasser skuddene oppreist ved å sette basalspissen på skuddet inn i mediet. Omtrent 10 skudd kan plasseres på en enkelt plate. Start med å forberede rhizobium inoculum.Inokuler 10 milliliter flytende YEM medium fra en enkelt koloni mesorhizobium plurifarium BOR2, og inkubere ved 28 grader Celsius i to dager. Bruk denne kulturen til å inokulere et større volum flytende YEM-medium. Når vokst, sentrifugere bakteriekulturen i 10 minutter på 3, 500 ganger g for å høste cellene.Re-suspendere bakteriell pellet i flytende EKM medium, og bestemme den optiske tettheten. Forbered tre liter EKM medium, som er nok for ca 20 potter, og inokuler den med rhizobial suspensjon. Bland mediet med 1,25 kilo perlitt, og tilsett 210 gram av denne blandingen for å sterile gjennomsiktige polypropylenpotter.Plant en til tre Parasponia andersonii plantlets til hver pott, og forberede flere potter med plantlets forvandlet med kontrollkonstruksjonen. Vei flere av pottene, og dekk bunnen av hver pott for å skjerme røttene mot lyseksponering. Inkuber pottene i et klimatisert vekstrom på 28 grader Celsius under en 16-timers, åtte-timers-natt diett i fire til seks uker.En gang i uken, veie flere potter for å bestemme vanntap. Hvis vanntapet overstiger 10 milliliter, supplere med ultra-rent vann for å kompensere for tapet. Etter inkubasjonen, rengjør røttene fra perlite, og bestem nodule tall ved hjelp av kikkert.Denne teknikken har blitt brukt til å lykkes forvandle petioles og segmenter av Parasponia andersonii stammer med Agrobacterium belastning AGL1. Først blir vevs explants co-dyrket med Agrobacterium i to dager. Langvarig kodyrking resulterer i bakteriell overkolonisering og bør forebygges.Noen uker senere observeres små grønne mikro-calli langs den opprinnelige såroverflaten. Disse calli fortsette å vokse og utvikle en eller flere putatively-forvandlet skudd på seks til åtte uker etter starten av transformasjon. Transformasjonseffektiviteten varierer fra 10 til 30% for vevsutvinninger fra modne grener til 65 til 75%for vevsutvinninger fra unge og raskt voksende grener.Transgene skudd kan multipliseres gjennom in vitro forplantning, noe som gir opphav til titalls skudd innen en måned. Disse skuddene kan plasseres på rooting medium som vil indusere rotdannelse i ca to uker og gi planter som kan brukes til eksperimentering. Når du starter et stabilt transformasjonseksperiment, er det viktig å velge sunne grener som kildemateriale.Parasponia T0 transgene linjer forplantes in vitro. Derfor er det viktig å grundig genotype Parasponia transgene linjer. Etableringen av Parasponia som en eksperimentell modell tillater komparativ analyse mellom to fjernt beslektede nodulating avstamninger, Parasponia og belgfrukter.Dette kan identifisere bevare genetiske nettverk underliggende rhizobium symbiose. Parasponia kan også være en verdifull modell for å studere andre forskningsemner som tredannelse, utvikling av biseksuelle blomster eller biosyntesen til Cannabaceae-spesifikke sekundære metabolitter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

Forbedret genomet redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i ulike celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

Omvendt transkripsjon-Loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) analysen for Zika Virus og Housekeeping gener i urin, Serum og mygg prøver

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

CRISPR-mediert genomet redigering av Human Fungal patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

Vi introduserer punktmutasjoner i menneskelige pluripotente stamceller ved hjelp av sømløs genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...