Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii at JoVE.com

A los autores les gusta reconocer a Mark Youles, Sophien Kamoun y Sylvestre Marillonnet por hacer que las piezas de clonación de Golden Gate estén disponibles a través de la base de datos Addgene. Además, nos gustaría agradecer a E. James, P. Hadobas y T. J. Higgens por las semillas de P. andersonii. Este trabajo fue apoyado por la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-VICI grant 865.13.001; NWO-Open Competition concede 819.01.007) y el Ministerio de Investigación, Tecnología y Educación Superior de la República de Indonesia (beca RISET-PRO 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las legumbres y el género Parasponia de Cannabaceae, distantemente relacionado, representan los dos únicos clados de especies vegetales capaces de establecer una relación endosimbiótica con la rizobia fijadora de nitrógeno y formar nódulos radiculares. Los estudios comparativos entre especies de ambos clados son muy relevantes para proporcionar información sobre las redes genéticas centrales que permiten esta simbiosis. Actualmente, los estudios genéticos se realizan principalmente en legumbres; especialmente las dos especies modelo M. truncatula y L. japonicus. Para proporcionar una plataforma experimental adicional y facilitar los estudios comparativos con un nódulo no leguminoso, describimos aquí un protocolo detallado para la transformación estable y análisis genéticos inversos en P. andersonii. El protocolo presentado utiliza la propagación in vitro de las líneas transgénicas T0 P. andersonii, permitiendo que el análisis fenotípico se inicie dentro de los 4 meses después del co-cultivo de A. tumefaciens. Esto es sustancialmente más rápido que los protocolos actuales que se han establecido para la transformación estable de las legumbres33. Esto hace de P. andersonii un modelo de investigación atractivo.
El protocolo descrito aquí contiene varios pasos críticos. El primero de los cuales se refiere a la germinación de semillas. Para preparar las semillas de P. andersonii para la germinación, las semillas necesitan ser aisladas de las bayas. Esto se hace frotando las bayas en un pedazo de papel tisú o contra el interior de un tamiz de té. Este procedimiento debe realizarse suavemente para evitar daños en la capa de semillas. Si la capa de semilla se daña, la lejía podría entrar en la semilla durante la esterilización, lo que reduce la viabilidad de las semillas. Para romper la latencia de las semillas, las semillas se someten a un ciclo de temperatura de 10 días. Sin embargo, a pesar de este tratamiento, la germinación no está totalmente sincronizada. Generalmente, las primeras semillas muestran la aparición del radio después de 7 días, pero otras pueden tardar varios días más en germinar.
Los puntos críticos del procedimiento de transformación se refieren a la elección del material de partida y a la duración de la etapa de co-cultivo. Para alcanzar una transformación eficiente, lo mejor es utilizar tallos o pecíolos sanos y jóvenes de plantas cultivadas en invernadero no estériles como material de partida. Con el fin de inducir el crecimiento de ramas jóvenes, es aconsejable recortar árboles de Parasponia cada 2-3 meses y refrescar los árboles una vez al año. Además, el paso de co-cultivo debe realizarse solo durante 2 días. El co-cultivo prolongado promueve la colonización excesiva de explantes de tejido por A. tumefaciens y generalmente reduce la eficiencia de transformación. Para evitar la colonización excesiva por A. tumefaciens también es importante refrescar regularmente las placas en las que se cultivan los explantas. En caso de que se produzca una colonización excesiva, los explantes de tejido podrían lavarse (ver Sección 3.8) para eliminar las células A. tumefaciens. Aconsejamos añadir lejía a la solución SH-10 utilizada para el lavado (concentración final: 2% hipoclorito). Es importante tener en cuenta que este paso de lavado adicional podría no funcionar en explantes muy infectados (Figura2B). En caso de que una transformación con una construcción CRISPR/Cas9 produzca sólo un número limitado de brotes transformados putativamente o si se espera que la mutagénesis de un gen en particular cause problemas en la regeneración, es aconsejable incluir una construcción de control vectorial vacía como el control positivo. Por último, es importante asegurarse de que todas las líneas transgénicas seleccionadas sean resultantes de eventos independientes de integración de T-DNA. Por lo tanto, instruimos a tomar sólo un brote putativo-transgénico de cada lado de una explanta. Sin embargo, nos damos cuenta de que esto reduce el número potencial de líneas independientes. Si se requieren muchas líneas, los investigadores podrían decidir separar el calli transformado putativamente de los explantes originales cuando estos calli son de 2 mm de tamaño y cultivo de estos calli de forma independiente. De esta manera, se podrían aislar varias líneas de cada explanta, lo que aumenta el número de líneas transgénicas potenciales.
En el protocolo actual, las líneas transgénicas de P. andersonii se propagan vegetativamente a través de la propagación in vitro. La ventaja de esto es que muchas plantas transgénicas se pueden generar en un período de tiempo relativamente corto. Sin embargo, este método también tiene varias limitaciones. En primer lugar, el mantenimiento de las líneas transgénicas T0 a través de la propagación in vitro requiere mucha mano de obra y podría dar lugar a alteraciones genéticas o epigenéticas no deseadas34,35. En segundo lugar, las líneas T0 todavía contienen una copia del ADN T, incluido el casete de resistencia a antibióticos. Esto limita el número de posibles retransformaciones, ya que se requieren diferentes marcadores de selección para cada retransformación. Actualmente, solo hemos probado la transformación utilizando la selección de kanamicina o higromicina (datos no mostrados). Además, la presencia de la secuencia de codificación Cas9 y los sgRNA en las líneas transgénicas T0 complica los estudios de complementación. Los ensayos de complementación son posibles, pero requieren que los sitios objetivo del sgRNA sean mutados como tales para evitar la edición génica de la construcción de la complementación. En tercer lugar, una desventaja de trabajar con líneas T0 es que los mutantes CRISPR/Cas9 podrían ser quiméricos. Para evitar el análisis fenotípico de las líneas mutantes quiméricas, recomendamos repetir el análisis de genotipado después de la propagación in vitro en al menos 3 brotes diferentes. Aunque, el número de mutantes quiméricos obtenidos usando el protocolo descrito aquí es limitado, ocasionalmente se observan10. Para superar las limitaciones de trabajar con líneas T 0, las líneas mutantes de P. andersonii podrían propagarse generativamente. Los árboles P. andersonii son dioicas y polinizadas por el viento2. Esto significa que cada línea transgénica necesita ser manipulada como tal para que las flores masculinas y femeninas se produzcan en un solo individuo, y posteriormente se cultivan como tal que no se produce la polinización cruzada. Como P. andersonii es un árbol de rápido crecimiento que requiere una cantidad sustancial de espacio en un invernadero tropical (28 oC, 85% de humedad relativa). Por lo tanto, aunque técnicamente posible, la propagación generativa de las líneas transgénicas de P. andersonii es logísticamente desafiante.
En la sección de protocolo, describimos 3 métodos para la nodulación de P. andersonii. La ventaja de los sistemas de placas y bolsas es que las raíces son fácilmente accesibles, lo que puede permitir la inoculación puntual de bacterias y después de la formación de nódulos con el tiempo. Sin embargo, el sistema de placas es bastante laborioso, lo que lo hace menos adecuado para experimentos de nodulación a gran escala. Una desventaja del sistema de la bolsa es que es difícil prevenir la contaminación por hongos. Las bolsas no son estériles, y por lo tanto el crecimiento de hongos se observa a menudo en la mitad superior de la bolsa. Sin embargo, Esto no afecta el crecimiento de P. andersonii, y por lo tanto no interfiere con los ensayos de nodulación. Además, el sistema de bolsa sólo es adecuado para plántulas. A pesar de varios intentos, hemos sido incapaces de cultivar plantitas obtenidas a través de la propagación in vitro en bolsas.
La canalización de genética inversa P. andersonii descrita aquí ofrece una mejora sustancial en comparación con el método de transformación de raíz basado en A. rhizogenesexistente 11. Utilizando los procedimientos descritos, las líneas transgénicas estables se pueden generar eficientemente y se pueden mantener a través de la propagación in vitro. Por el contrario, la transformación de A. rhizogenes es transitoria y sólo resulta en la formación de raíces transgénicas. Debido a que cada raíz transgénica resulta de una transformación independiente, los ensayos basados en la transformación de A. rizogenes sufren de variación fenotípica sustancial. Esta variación es mucho menor en el caso de líneas estables, aunque la propagación in vitro también crea cierto nivel de variación. Debido a esta variación reducida y el hecho de que múltiples plantitas podrían ser fenotipo para cada línea estable, las líneas estables son más adecuadas para ensayos cuantitativos en comparación con A. rhizogenes-raíces transformadas. Además, la transformación estable no depende de la introducción de la raíz A. rizogenes inducir locus (rol) que afecta el equilibrio hormonal endógeno15. Por lo tanto, las líneas estables son más adecuadas para el análisis genético inverso de genes implicados en la homeostasis hormonal en comparación con las raíces transformadas de A. rhizogenes. Una ventaja más general de P. andersonii como modelo de investigación es que no experimentó una duplicación reciente del genoma entero (WGD). La leguminosa Subfamilia Papilionoideae, que incluye el modelo de legumbres M. truncatula y L. japonicus, así como las Salicaceae (orden Malpighiales) que incluye el árbol modelo Populus trichocarpa experimentado WGDs 65 millones de años hace36,37. Muchas copias genéticas parapálogas resultantes de estos GMT se conservan en los genomas de M. truncatula, L. japonicus y P. trichocarpa37,38,39, que crea redundancia que podría complicar los análisis genéticos inversos. Como P. andersonii no experimentó un WGD reciente, los análisis genéticos inversos en P. andersonii podrían verse menos afectados por el funcionamiento redundante de copias genéticas paralocóloas.
En conjunto, proporcionamos un protocolo detallado para el análisis genético inverso en P. andersonii. Usando este protocolo, las líneas mutantes individuales se pueden generar eficientemente en un período de tiempo de 2-3 meses10. Este protocolo se puede ampliar para crear mutantes de orden superior a través de la multiplexación de sgRNAs dirigidos a diferentes genes simultáneamente, como se muestra para otras especies de plantas40,41,42. Además, el procedimiento de transformación estable descrito aquí no se limita a la orientación genética CRISPR/Cas9, sino que también podría utilizarse para introducir otros tipos de construcciones (por ejemplo, para ensayos promotor-reportero, expresión ectópica o trans- complementamiento). Establecimos P. andersonii como un modelo de investigación comparativa para estudiar simbiosis mutuas con rizobia fijador de nitrógeno o hongos endomicorrhizal. Sin embargo, los protocolos descritos aquí también proporcionan herramientas para estudiar otros aspectos de la biología de este árbol tropical, como la formación de madera, el desarrollo de flores bisexuales o la biosíntesis de metabolitos secundarios específicos de Cannabaceae.

Parasponia andersonii es un árbol tropical perteneciente a la familia Cannabis (Cannabaceae) y es nativo de Papúa Nueva Guinea y varias Islas del Pacífico1,2,3. Junto con 4 especies adicionales de Parasponia, representa el único linaje no leguminoso que puede establecer una simbiosis nódula fijante de nitrógeno con rizobia. Esta simbiosis está bien estudiada en los modelos de leguminosas (Fabaceae) Medicago truncatula y Lotus japonicus,lo que ha dado como resultado la adquisición de un conocimiento detallado de la naturaleza genética molecular de la formación de nódulos y el funcionamiento4. Además, se demostró que la simbiosis del nódulo raíz en las legumbres se basa enla simbiosis micorriza arbuscular mucho más antigua y generalizada 5. Las comparaciones filogenómicas sugieren que las simbiosis de nódulos fijadores de nitrógeno de las legumbres, Parasponia,así como las llamadas especies de plantas actinorhizales que albergan bacterias Defrankia diazotroficas, tienen un origen evolutivo compartido 6,7,8. Para determinar si los genes identificados para participar en la formación de nódulos de leguminosas son la parte de una base genética conservada, los estudios sobre especies no leguminosas son esenciales. Con este fin, proponemos utilizar P. andersonii como modelo de investigación comparativa, junto con las legumbres, para identificar las redes genéticas básicas subyacentes a la formación y funcionamiento del nódulo raíz.
P. andersonii es un pionero que se puede encontrar en las laderas de las colinas volcánicas. Puede alcanzar velocidades de crecimiento de 45 cm por mes y alcanzar longitudes de hasta 10 metros9. Los árboles P. andersonii son polinizados por el viento, lo que se ve facilitado por la formación de flores separadas masculinas y femeninas3,10. Recientemente secuenciamos y anotamos el genoma diploide (2n a 20; 560 Mb/1C) de P. andersonii,y ensamblamos secuencias de genoma de borrador de 2 especies adicionales de Parasponia; P. rigida y P. rugosa6. Esto reveló modelos de genes de 35.000 P. andersonii que se pueden agrupar en >20.000 ortogrupos junto con genes de M. truncatula, soja (Glycine max), Arabidopsis thaliana, bosque de fresas ( Fragaria vesca), Trema orientalis, álamo de algodón negro (Populus trichocarpa) y eucalipto (Eucalyptus grandis)6. Además, las comparaciones de transcriptoma entre M. truncatula y P. andersonii identificaron un conjunto de 290 ortologos putativos que muestran un patrón de expresión mejorado con nódulos en ambas especies6. Esto proporciona un excelente recurso para los estudios comparativos.
Para estudiar la función génica en las raíces y nódulos de P. andersonii, se ha establecido un protocolo para la transformación de la raíz mediada por Agrobacterium rhizogenes11. Usando este protocolo, las plantas compuestas que soportan raíces transgénicas se pueden generar en un marco de tiempo relativamente corto. Este método es, también, ampliamente aplicado en la investigación de leguminosis12,13,14. Sin embargo, la desventaja de este método es que sólo las raíces se transforman y que cada raíz transgénica representa un evento de transformación independiente, lo que resulta en una variación sustancial. Además, la transformación es transitoria y las líneas transgénicas no se pueden mantener. Esto hace que la transformación de raíz basada en Rhizogenessea menos adecuada para la edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9. Además, A. rhizogenes transfiere sus genes de locus inductor de raíz (rol) al genoma de la planta, que una vez expresado interfieren con la hormona homeostasis15. Esto hace que estudiar el papel de las hormonas vegetales en A. rizogenes-raíces transformadas desafiante. Para superar estas limitaciones, recientemente desarrollamos un protocolo para la transformación basada en Agrobacterium tumefaciensy la mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9 de P. andersonii10.
Aquí, proporcionamos una descripción detallada del procedimiento de transformación basado en A. tumefaciensy la canalización de genética inversa desarrollada para P. andersonii. Además, proporcionamos protocolos para el manejo posterior de plantlets transgénicos, incluyendo ensayos para estudiar interacciones simbióticas. Usando el protocolo descrito aquí, se pueden generar múltiples líneas transgénicas en un período de 2-3 meses. En combinación con la mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9, esto permite una generación eficiente de líneas mutantes noqueadas. Estas líneas mutantes pueden propagarse vegetativamente in vitro10,16,17, lo que permite generar material suficiente para iniciar la caracterización fenotípica a los 4 meses después de que el procedimiento de transformación iniciado10. Juntos, este conjunto de procedimientos debe permitir que cualquier laboratorio adopte P. andersonii como modelo de investigación para estudios dirigidos a entender las asociaciones rizobialyas y micorrizas, así como potencialmente otros aspectos de la biología de este árbol tropical.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii es un árbol tropical de rápido crecimiento que pertenece a la familia Cannabis (Cannabaceae). Junto con 4 especies adicionales, forma el único linaje no leguminoso conocido capaz de establecer una simbiosis nódula fijadora de nitrógeno con rizobio. Los estudios comparativos entre las legumbres y P. andersonii podrían proporcionar información valiosa sobre las redes genéticas subyacentes a la formación de nódulos radiculares. Para facilitar los estudios comparativos, recientemente secuenciamos el genoma de P. andersonii y establecimos Agrobacterium tumefaciens-mediada en transformación estable y edición del genoma basada en CRISPR/Cas9. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los procedimientos de transformación y edición del genoma desarrollados para P. andersonii. Además, describimos los procedimientos para la germinación de semillas y la caracterización de fenotipos simbióticos. Usando este protocolo, las líneas mutantes transgénicas estables se pueden generar en un período de 2-3 meses. La propagación vegetativa in vitro de líneas transgénicas T0 permite iniciar experimentos de fenotipado a los 4 meses después del cocultivo de A. tumefaciens. Por lo tanto, este protocolo toma sólo marginalmente más tiempo que el método transitorio de transformación de raíz basado en Agrobacterium rhizogenesdisponible para P. andersonii, aunque ofrece varias ventajas claras. Juntos, los procedimientos descritos aquí permiten que P. andersonii sea utilizado como un modelo de investigación para estudios dirigidos a entender las asociaciones simbióticas, así como potencialmente otros aspectos de la biología de este árbol tropical.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii es un árbol tropical de rápido crecimiento que pertenece a la familia Cannabis (Cannabaceae) y puede formar nódulos radiculares fijados al nitrógeno en asociación con el rizobio. Aquí, describimos un protocolo detallado para análisis genéticos inversos en P. andersonii basado en Agrobacterium tumefaciens-mediada transformación estable y edición del genoma basada en CRISPR/Cas9.

Transformando, Edición del Genoma y Fenotipando el árbol tropical de cannabaceae de fijación de nitrógeno Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia es un árbol tropical de la familia Cannabis que es capaz de establecer una simbiosis fijadora de nitrógeno con rizobio. Los estudios comparativos entre Parasponia y las legumbres podrían proporcionar información sobre las redes genéticas básicas subyacentes a la simbiosis del rizobio. Con este protocolo, parasponia andersonii líneas mutantes transgénicas estables se pueden generar en un período de dos a tres meses.Estas líneas se pueden propagar eficientemente a través de la propagación in vitro. Este protocolo proporciona una plataforma experimental para estudiar la simbiosis rizobiana, así como otros aspectos de la biología de este árbol tropical. Las habilidades básicas en el cultivo de tejidos y la clonación molecular son suficientes para implementar este protocolo.Esto permite a cualquier laboratorio adaptar Parasponia como modelo de investigación. Demostrando el procedimiento serán los estudiantes de doctorado Titis Wardhani y Yuda Roswanjaya junto con Marijke Hartog, un técnico en nuestro laboratorio. Para cultivar árboles de Parasponia andersonii, comience germinando las semillas.Retire las semillas de las bayas de Parasponia frotando contra el interior de un tamiz de té o aplastándolas en un pedazo de papel tisú. Desinfecte las semillas con 4%hipoclorito durante 15 a 20 minutos, y luego lave las semillas seis veces con agua esterilizada. Transfiera las semillas a tubos estériles de PCR de 200 microlitros y llene los tubos con agua esterilizada para sumergir las semillas.Incubar los tubos durante 10 días en un termociclo, según las instrucciones del manuscrito. Después de la incubación de 10 días, transfiera las semillas a placas SH-0 y ciérrelas con dos capas de lámina de sellado elástica para evitar el secado. Incubar a 28 grados centígrados con un ciclo de 16 horas al día, ocho horas de noche durante tres a cuatro semanas.Una vez que las plántulas desarrollen su primer conjunto de hojas verdaderas, transcúyenlas a macetas llenas de tierra de maceta comercial, y cúbralas con una taza de plástico translúcido para evitar la desicación. Coloque las ollas en una sala de clima de humedad relativa de 28 grados, 85% o invernadero bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche. Después de una semana, retire la taza de plástico.Regar regularmente las macetas, y complementar con fertilizante para sostener el crecimiento del árbol. Prepárese para la transformación cosechando ramas jóvenes de cinco a ocho centímetros de los árboles cultivados en invernadero, asegurándose de utilizar sólo ramas sanas y no infectadas. Cortar las hojas, dejando un centímetro cuadrado de tejido de la hoja al final de cada pecíolo.Desinfectar el tejido durante 15 minutos con 2%hipoclorito que contiene unas gotas de polisorbato 20, y luego enjuagar ocho veces con agua autoclave. Re-suspende las células de Agrobacterium en 25 mililitros de media de infiltración a una densidad óptica de unos cinco. Corte el tallo y el tejido pecíolo en trozos de un centímetro dentro de la suspensión celular.Retire los tejidos de las hojas e incubar las piezas del tallo y el pecíolo en la suspensión celular durante 10 a 30 minutos. Seque las piezas de los tejidos en un pedazo estéril de papel de filtro y colóquelos en un medio de enraizamiento preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Incubar las placas en la oscuridad a 21 grados centígrados durante dos días.Después de los dos días, inspeccione las placas en busca de contaminación por hongos o bacterias y deseche las placas contaminadas. Transfiera las piezas de tejido a 10 mililitros de medio SH-10 preparados según las instrucciones del manuscrito. Deje el tejido en el medio durante al menos 10 minutos y agite suavemente cada dos o tres minutos para lavarlo.Preparar medio de enraizamiento con cefotaxime y kanamicina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y verter las placas. Seque los tejidos en trozos estériles de papel de filtro y transfieralos a las placas. Incubar placas durante siete días a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche.Revise las placas en busca de contaminación por hongos o bacterias cada dos días. Si se produce contaminación, transfiera las piezas de tejido no infectadas a un plato nuevo. Después de siete días, transfiera las piezas de tejido al medio de propagación preparado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e incubar a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche.Refresque las placas una vez a la semana hasta que se desarrollen brotes transgénicos, asegurándose de transferir únicamente las piezas de tejido no infectadas a placas nuevas. Una vez que los brotes transgénicos putativos miten al menos un centímetro de largo, corte los brotes y escúlelos de forma independiente en el medio de propagación con antibióticos. Para asegurarse de que los brotes representan transformadores independientes, tome un solo disparo de cada lado de un explant.Propagar el tejido colocando alrededor de 10 brotes en una placa fresca de medio de propagación y cerrando la placa con dos capas de lámina de sellado elástica. Incubar las placas a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche, y repetir este paso cada cuatro semanas. Cuando los brotes alcancen un centímetro de longitud, córtalos en su base y colóquelos en el medio de enraizamiento.Coloque los disparos en posición vertical insertando la punta basal del brote en el medio. Se pueden colocar alrededor de 10 tomas en una sola placa. Comience preparando el rizobio inóculo.Inocular 10 mililitros de medio líquido YEM de una sola colonia de Mesorhizobium plurifarium BOR2, e incubar a 28 grados centígrados durante dos días. Utilice este cultivo para inocular un mayor volumen de medio YEM líquido. Una vez cultivado, centrifugar el cultivo bacteriano durante 10 minutos a 3.500 veces g para cosechar las células.Vuelva a suspender el pellet bacteriano en un medio líquido EKM y determine la densidad óptica. Preparar tres litros de medio EKM, que es suficiente para unos 20 macetas, e inocular con la suspensión rizobiana. Mezclar el medio con 1,25 kilogramos de perlita, y añadir 210 gramos de esta mezcla a las ollas de polipropileno translúcido estéril.Planta de una a tres plantaciones de Parasponia andersonii en cada maceta, y prepara varias macetas con plantlets transformados con la construcción de control. Pesar varias de las ollas, y cubrir la parte inferior de cada olla para proteger las raíces de la exposición a la luz. Incubar las macetas en una sala de crecimiento climatizado a 28 grados centígrados bajo un régimen de 16 horas al día, ocho horas de noche durante cuatro a seis semanas.Una vez a la semana, pesar varias ollas para determinar la pérdida de agua. Si la pérdida de agua supera los 10 mililitros, suplementar con agua ultrapura para compensar la pérdida. Después de la incubación, limpie las raíces de la perlita y determine los números de nódulos usando un binocular.Esta técnica se ha utilizado para transformar con éxito pecíolos y segmentos de tallos de Parasponia andersonii con la cepa Agrobacterium AGL1. En primer lugar, los tejidos explants se co-cultivan con Agrobacterium durante dos días. El cultivo prolongado da como resultado una sobrecolonización bacteriana y debe prevenirse.Unas semanas más tarde, se observan pequeñas microllamadas verdes a lo largo de la superficie original de la herida. Estos calli continúan creciendo y desarrollando uno o más brotes transformados putativamente a las seis a ocho semanas después del inicio de la transformación. Las eficiencias de transformación varían de 10 a 30% para los explantes de tejidos de ramas maduras a 65 a 75% para los explantes de tejidos de ramas jóvenes y de rápido crecimiento.Los brotes transgénicos se pueden multiplicar a través de la propagación in vitro, lo que da lugar a decenas de brotes en un mes. Estos brotes se pueden colocar en el medio de enraizamiento que inducirá la formación de raíces en aproximadamente dos semanas y las plantas de rendimiento que se pueden utilizar para la experimentación. Al iniciar un experimento de transformación estable, es importante seleccionar ramas sanas como material de origen.Las líneas transgénicas de Parasponia T0 se propagan in vitro. Por lo tanto, es esencial genotipo completamente Parasponia líneas transgénicas. El establecimiento de Parasponia como modelo experimental permite el análisis comparativo entre dos linajes nodulantes distantemente relacionados, Parasponia y legumbres.Esto podría identificar redes genéticas conservantes subyacentes a la simbiosis del rizobio. Parasponia también puede ser un modelo valioso para estudiar otros temas de investigación como la formación de madera, el desarrollo de flores bisexuales, o la biosíntesis de metabolitos secundarios específicos de Cannabaceae.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Investigación

Genética

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Revertir el ensayo de amplificación isotérmica mediada por el lazo de transcripción (RT-LAMP) para el Virus Zika y Housekeeping Genes en muestras de mosquitos, suero y orina

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Edición del genoma mediada por CRISPR el hongo patógeno Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...