Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Författarna vill erkänna mark youles, Sophien kamoun och Sylvestre Marillonnet för att göra Golden Gate kloning delar tillgängliga via Addgene databasen. Dessutom skulle vi vilja tacka E. James, P. Hadobas, och T. J. Higgens för P. andersonii frön. Detta arbete stöddes av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-Open Competition Grant 819.01.007) och Republiken Indonesiens ministerium för forskning, teknik och högre utbildning (RISET-PRO Grant 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Baljväxter och det avlägset besläktade Cannabaceae släktet parasponia representerar de enda två kladerna av växtarter som kan etablera ett endosymbiotiskt förhållande med kvävefixerande former och rotknölar. Jämförande studier mellan arter av båda kladerna är mycket relevanta för att ge insikter i de centrala genetiska nätverk som möjliggör denna symbios. För närvarande, genetiska studier görs främst i baljväxter; speciellt de två modell arterna M. minor och L. japonicus. För att ge en ytterligare experimentell plattform och underlätta jämförande studier med en nodulating icke-balanväxter, beskriver vi här ett detaljerat protokoll för stabil omvandling och omvänd genetiska analyser i P. andersonii. Det presenterade protokollet använder in vitro-spridning av T0 transgena P. andersonii -linjer, vilket gör det möjligt att inleda fenotypisk analys inom 4 månader efter samodling av A. tumefaciens . Detta är betydligt snabbare än nuvarande protokoll som har fastställts för stabil omvandling av baljväxter33. Detta gör P. andersonii en attraktiv forskningsmodell.
Det protokoll som beskrivs här innehåller flera kritiska steg. Den första gäller utsäde grobarhet. För att förbereda P. andersonii frön för grobarhet, frön måste isoleras från bären. Detta görs genom att gnugga Bären på en bit av silkespapper eller mot insidan av en tesil. Detta förfarande måste utföras försiktigt för att förhindra skador på utsäde pälsen. Om frö pälsen blir skadad, kan blekmedel in i utsäde under sterilisering, vilket minskar utsäde lönsamhet. För att bryta utsäde dormancy, frön utsätts för en 10-dagars temperaturcykel. Men trots denna behandling är grobarheten inte helt synkroniserad. Generellt, de första fröna visar rot uppkomst efter 7 dagar, men andra kan ta flera dagar längre tid att gro.
Kritiska punkter i omvandlingsförfarandet gäller valet av utgångsmaterial och varaktigheten av samodling steg. För att uppnå effektiv omvandling, är det bäst att använda friska och unga stammar eller bladskaft av icke-sterila växthusodling växter som utgångsmaterial. För att inducera tillväxten av unga grenar, är det tillrådligt att trimma Parasponia träd varje 2-3 månader och uppdatera träd en gång om året. Dessutom måste samodling steg endast utföras för 2 dagar. Långvarig samodling främjar över-kolonisering av vävnad djur av A. tumefaciens och i allmänhet minskar omvandlings effektiviteten. För att förhindra överkolonisering av A. tumefaciens är det också viktigt att regelbundet uppdatera plattorna på vilka djur odlas. I fall överkolonisering inträffar, vävnad djur kan tvättas (se avsnitt 3,8) för att ta bort A. tumefaciens celler. Vi rekommenderar att lägga blekmedel till SH-10 lösning som används för tvättning (slutlig koncentration: ~ 2% hypoklorit). Det är viktigt att notera att detta ytterligare tvättsteg kanske inte fungerar på tungt smittade djur (figur 2b). Om en omvandling med en CRISPR/Cas9-konstruktion ger endast ett begränsat antal putsat-transformerade skott eller om mutagenes av en viss gen förväntas orsaka problem i regenerering, är det tillrådligt att inkludera en tom vektor kontroll konstruktion som den positiva kontrollen. Slutligen är det viktigt att se till att alla transgena linjer som väljs är resultatet av oberoende T-DNA-integrationsevenemang. Därför instruerar vi att ta bara en enda putatively-transgena skjuta från varje sida av en explant. Vi inser dock att detta minskar det potentiella antalet oberoende linjer. Om många linjer krävs, kan forskarna besluta att separera putatively omvandlad Calli från den ursprungliga djur när dessa Calli är ≥ 2 mm i storlek och kultur dessa Calli självständigt. På detta sätt kan flera linjer isoleras från varje explant, vilket höjer antalet potentiella transgena linjer.
I det aktuella protokollet sprids transgena linjer av P. andersonii vegetativt genom in vitro-spridning. Fördelen med detta är att många transgena plantlets kan genereras i en relativt kort tidsperiod. Men denna metod har också flera begränsningar. För det första är upprätthållandet av T0 transgena linjer genom in vitro-spridning arbetsintensiva och kan resultera i oönskade genetiska eller epigenetiska förändringar34,35. För det andra, T0 linjer innehåller fortfarande en kopia av t-DNA, inklusive antibiotikaresistens kassetten. Detta begränsar antalet möjliga omtransformeringar, eftersom olika markerings markörer krävs för varje omomvandling. För närvarande har vi bara testat omvandling med kanamycin eller hygromycin urval (data som inte visas). Dessutom komplierar närvaron av Cas9-kodningssekvensen och sgRNAs i T0 transgena linjer kompletterings studier. Kompletterings analyser är möjliga men kräver att sgRNA målwebbplats (er) muteras som sådan att genredigering av komplemen konstruktionen förhindras. För det tredje, en nackdel med att arbeta med T0 linjer är att CRISPR/Cas9 mutanter kan vara chimeric. För att förhindra fenotypisk analys av chimär Mutant linjer, rekommenderar vi att upprepa genotypning analys efter in vitro-spridning på minst 3 olika skott. Även om antalet chimär mutanter som erhållits med hjälp av protokollet som beskrivs här är begränsad, de är ibland observeras10. För att övervinna begränsningarna av att arbeta med T0 linjer, P. andersonii Mutant linjer kan spridas Generativt. P. andersonii träd är tvåbyggare och vind-pollinerade2. Detta innebär att varje transgen linje måste manipuleras så att manliga och kvinnliga blommor produceras på en enda individ, och därefter odlas som sådan att kors pollinering inte förekommer. Som P. andersonii är ett snabbväxande träd det kräver en stor mängd utrymme i ett tropiskt växthus (28 ° c, ~ 85% relativ fuktighet). Därför, även om det är tekniskt möjligt, generativ utbredning av P. andersonii transgena linjer är logistiskt utmanande.
I protokollet avsnitt, beskrev vi 3 metoder för nodulationen av P. andersonii. Fördelen med plattan och påsen system är att rötterna är lättillgängliga, vilket kan tillåta spot-inympning av bakterier och efter knöl bildas över tiden. Men plattan systemet är ganska arbetsintensiva, vilket gör det mindre lämpad för storskaliga nodulationen experiment. En nackdel med påsen systemet är att det är svårt att förhindra svampangrepp. Påsar är inte sterila, och därför svamp tillväxt observeras ofta på den övre halvan av påsen. Emellertid, detta påverkar inte P. andersonii tillväxt, och därför inte stör nodulationen analyser. Dessutom är påsen systemet endast lämplig för plantor. Trots flera försök, har vi inte kunnat odla plantlets erhålls genom in vitro-förökning i påsar.
Den P. andersonii omvänd genetik pipeline som beskrivs här erbjuder en betydande förbättring jämfört med den befintliga a. rhizogenes-baserade rot omvandling metod11. Med hjälp av de beskrivna procedurerna kan stabila transgena linjer genereras effektivt och kan upprätthållas via in vitro-spridning. I motsats, A. rhizogenes omvandling är övergående och endast resulterar i bildandet av transgena rötter. Eftersom varje transgen rot resultat från en oberoende omvandling, A. rhizogenes omvandling-baserade analyser lider av betydande fenotypisk variation. Denna variation är mycket mindre i händelse av stabila linjer, även in vitro-spridning skapar också en viss nivå av variation. På grund av denna reducerade variation och det faktum att flera plantlets skulle kunna fenotypas för varje stabil linje, är stabila linjer mer lämpade för kvantitativa analyser jämfört med A. rhizogenes-transformerade rötter. Dessutom är den stabila omvandlingen inte beroende av införandet av A. rhizogenes root inducerande Locus (ROL) som påverkar endogena hormonbalansen15. Därför är stabila linjer bättre lämpade för omvänd genetisk analys av gener involverade i hormon homeostas jämfört med A. rhizogenes-transformerade rötter. En mer allmän fördel av P. andersonii som forskningsmodell är att den inte upplever en nyligen hela genomduplicering (wgd). Den baljväxter papilionoideae under familj, som omfattar modellen baljfrukter M. minor och L. japonicus, liksom Salicaceae (Beställ Malpighiales) som innehåller modellen trädet Populus trichocarpa erfarna wgds ~ 65 miljoner år sedan36,37. Många paralogous genkopior till följd av dessa wgds behålls i genomen hos av M. minor, L. japonicus och P. trichocarpa37,38,39, vilket skapar redundans som kan komplicera omvända genetiska analyser. Som p. andersonii inte upplever en nyligen wgd, omvänd genetiska analyser på P. andersonii kan vara mindre påverkas av redundant funktion av paralogous genkopior.
Sammantaget ger vi ett detaljerat protokoll för omvänd genetisk analys i P. andersonii. Med hjälp av detta protokoll kan enstaka muterade linjer effektivt genereras inom en tidsram på 2-3 månader10. Detta protokoll kan utökas för att skapa högre ordningens mutanter genom multiplexering av sgrnas som riktar sig mot olika gener samtidigt, vilket visas för andra växtarter40,41,42. Dessutom är den stabila omvandlings procedur som beskrivs här inte begränsad till CRISPR/Cas9 gen inriktning, utan kan också användas för att introducera andra typer av konstruktioner (t. ex. för promotorn-reporter-analyser, ektopisk uttryck eller trans- komplementarisering). Vi etablerade P. andersonii som en jämförande forskningsmodell för att studera mutualistiska symbioser med kvävefixerande former eller endomycorrhizal svampar. Men de protokoll som beskrivs här ger också verktyg för att studera andra aspekter av biologi i denna tropiska träd, såsom trä formation, utveckling av bi-sexuella blommor eller biosyntesen av Cannabaceae-specifika sekundära metaboliter.

Parasponia andersonii är ett tropiskt träd tillhörande cannabis familjen (Cannabaceae) och är infödd till Papua Nya Guinea och flera Stillahavsöarna1,2,3. Tillsammans med 4 ytterligare Parasponia arter, den representerar den enda icke-balanser härstamning som kan etablera en kvävefixerande knöl symbios med Rhizobia. Denna symbios är väl studerat i baljväxter (Fabaceae) modeller Medicago minor och Lotus japonicus, vilket har resulterat i att förvärva detaljerad kunskap om den molekylära genetiska karaktären av knöl bildas och fungerande4. Dessutom, det visades att roten knöl symbios i baljväxter grundas på mycket äldre, och utbredd arbuskulära bildar mykorrhiza symbios5. Phylogenomic jämförelser tyder på att kvävefixerande knöl symbioser av baljväxter, Parasponia, liksom, den så kallade actinorhizal växtarter som värd diazotrofiska frankia bakterier, har en gemensam evolutionära ursprung 6,7,8. För att avgöra om de gener som identifierats vara inblandade i balannodule bildas är en del av en bevarad genetisk grund, studier på icke-balanväxter arter är viktiga. För detta ändamål föreslår vi att använda P. andersonii som en jämförande forskningsmodell, tillsammans med baljväxter, för att identifiera de centrala genetiska nätverk underliggande rot knöl bildas och fungerar.
P. andersonii är en pionjär som finns på sluttningarna av vulkaniska kullar. Den kan möta tillväxthastigheter på 45 cm per månad och nå längder på upp till 10 meter9. P. andersonii träd är vind-pollineras, som underlättas av bildandet av separata manliga och kvinnliga blommor3,10. Vi sekvenserade nyligen och kommenterade diploida arvsmassan (2n = 20; 560 MB/1C) av P. andersonii, och monterade utkast till genomsekvenser av ytterligare två parasponia -arter; P. rigida och p. rugosa6. Detta avslöjade ~ 35 000 P. andersonii gen modeller som kan klustras i > 20000 ortogrupper tillsammans med gener från M. minor, sojabönor (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Woodland Strawberry ( Fragaria smultron), trema orientalis, svart bomull poppel (Populus trichocarpa) och eucalypt (Eucalyptus grandis)6. Dessutom, transkriptome jämförelser mellan M. minor och P. andersonii identifierade en uppsättning 290 förmodade orthologues som visar en nodule-förstärkt uttryck mönster i båda arterna6. Detta ger en utmärkt resurs för jämförande studier.
För att studera gen funktionen i P. andersonii rötter och noduli, ett protokoll för Agrobacterium rhizogenes-medierad rot omvandling har upprättats11. Med hjälp av detta protokoll, sammansatta växter som bär transgena rötter kan genereras i en relativt kort tidsram. Denna metod är, också, allmänt tillämpas i balen-symbios forskning12,13,14. Nackdelen med denna metod är dock att endast rötter omvandlas och att varje transgen rot representerar en oberoende transformationshändelse, vilket resulterar i betydande variation. Omvandlingen är också övergående och transgena linjer kan inte upprätthållas. Detta gör en. rhizogenes-baserad rot omvandling mindre LÄMPAD för CRISPR/Cas9-medierad genom redigering. Dessutom, A. rhizogenes överför sin rot inducerande Locus (ROL) gener till växtgenomet, som en gång uttryckte störa hormon homeostas15. Detta gör att studera rollen av växthormoner i A. rhizogenes-transformerade rötter utmanande. För att övervinna dessa begränsningar, vi nyligen utvecklat ett protokoll för Agrobacterium tumefaciens-baserad omvandling och CRISPR/Cas9-medierad mutesis av P. andersonii10.
Här ger vi en detaljerad beskrivning av a. tumefaciens-baserade omvandlings procedur och omvänd genetik pipeline utvecklad för P. andersonii. Dessutom tillhandahåller vi protokoll för nedströms hantering av transgena plantlets, inklusive analyser för att studera symbiotiska interaktioner. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, kan flera transgena linjer genereras i en 2-3 månaders period. I kombination med CRISPR/Cas9-medierad mutagenes, detta möjliggör effektiv generering av knockout Mutant linjer. Dessa Mutant linjer kan vegetativt förökas in vitro-10,16,17, vilket gör att tillräckligt material som skall genereras för att starta fenotypisk karakterisering vid 4 månader efter omvandlingsförfarandet har inletts10. Tillsammans, denna uppsättning förfaranden bör tillåta varje labb att anta P. andersonii som en forskningsmodell för studier som syftar till att förstå rhizobial och bildar mykorrhiza föreningar, samt potentiellt andra aspekter av biologi i denna tropiska träd.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii är ett snabbväxande tropiskt träd som tillhör cannabis familjen (Cannabaceae). Tillsammans med 4 ytterligare arter, det utgör den enda kända icke-balen härstamning kunna etablera en kvävefixerande knöl symbios med Rhizobium. Jämförande studier mellan baljväxter och P. andersonii kan ge värdefull insikt i de genetiska nätverk underliggande rot knöl bildas. För att underlätta jämförande studier, sekvenserade vi nyligen P. andersonii genom och etablerade Agrobacterium tumefaciens-medierad stabil transformation och CRISPR/Cas9-baserad genom redigering. Här ger vi en detaljerad beskrivning av omvandling och genomredigering förfaranden som utvecklats för P. andersonii. Dessutom beskriver vi procedurer för utsäde grobarhet och karakterisering av symbiotiska fenotyper. Med hjälp av detta protokoll kan stabila transgena muterade linjer genereras under en period av 2-3 månader. Vegetativt in vitro-spridning av T0 transgena linjer gör det möjligt att inleda fenotypnings experiment vid 4 månader efter en. tumefaciens samodling. Därför tar detta protokoll bara marginellt längre än den övergående Agrobacterium rhizogenes-baserade rotomvandlings metod tillgänglig för P. andersonii, men erbjuder flera tydliga fördelar. Tillsammans, de förfaranden som beskrivs här tillåter P. andersonii att användas som en forskningsmodell för studier som syftar till att förstå symbiotiska föreningar samt potentiellt andra aspekter av biologi i detta tropiska träd.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii är ett snabbväxande tropiskt träd som tillhör cannabis familjen (Cannabaceae) och kan bilda kvävefixerande rotknölar i samband med Rhizobium. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för omvänd genetiska analyser i P. andersonii baserat på Agrobacterium tumefaciens-medierad stabil transformation och CRISPR/Cas9-baserad genom redigering.

Transformering, genom-redigering och fenotypning av kvävefixerande tropiska Cannabaceae träd Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia är ett tropiskt träd från familjen Cannabis som kan etablera en kvävefixerande symbios med rhizobium. Jämförande studier mellan Parasponia och baljväxter kan ge insikt i de centrala genetiska nätverk som ligger till grund för rhizobium symbios. Med detta protokoll kan Parasponia andersonii stabil transgena mutant linjer genereras i en period av två till tre månader.Dessa rader kan spridas effektivt genom in vitro-spridning. Detta protokoll ger en experimentell plattform för att studera rhizobial symbios samt andra aspekter av biologin i detta tropiska träd. Grundläggande färdigheter i vävnadskultur och molekylär kloning är tillräckliga för att genomföra detta protokoll.Detta gör att alla laboratorium att anpassa Parasponia som forskningsmodell. Demonstrera förfarandet kommer att doktorander Titis Wardhani och Yuda Roswanjaya tillsammans med Marijke Hartog, en tekniker i vårt labb. Att växa Parasponia andersonii träd, börja med att gro fröna.Ta bort fröna från Parasponia bär genom att gnugga mot insidan av en te sikt eller squash dem på en bit av mjukpapper. Desinficera frön med 4%hypoklorit blekmedel i 15 till 20 minuter, och sedan tvätta fröna sex gånger med steriliserat vatten. Överför fröna till sterila 200 microliter PCR-rör, och fyll rören med steriliserat vatten för att dränka fröna.Inkubera rören i 10 dagar i en termocyklare enligt manuskriptriktningar. Efter den 10-dagars inkubation, överför fröna till SH-0 plattor, och stäng dem med två lager av elastisk tätningsfolie för att förhindra torkning. Inkubera vid 28 grader Celsius med en 16-timmars, åtta timmars natt cykel i tre till fyra veckor.När plantorna utvecklar sin första uppsättning sanna blad, överför dem till krukor fyllda med kommersiell krukjord, och täck dem med en genomskinlig plastkopp för att förhindra uttorkning. Placera krukorna i en 28-graders Celsius, 85% relativ luftfuktighet klimat rum eller växthus under en 16-timmars dag, åtta timmar natt regim. Efter en vecka, ta bort plastkoppen.Regelbundet vatten krukorna, och komplettera med gödningsmedel för att upprätthålla trädtillväxt. Förbered för omvandling genom att skörda unga fem till åtta centimeters grenar från de växthusodlade träden, se till att endast använda friska, icke-infekterade grenar. Skär av bladen, lämnar en centimeter kvadrat av bladvävnad i slutet av varje petiole.Desinficera vävnaden i 15 minuter med 2%hypokloritblekt som innehåller några droppar polysorbat 20, och skölj den sedan åtta gånger med autoklaverat vatten. Åter avbryta Agrobacterium celler i 25 milliliter av infiltration medium till en optisk densitet på cirka fem. Skär stammen och petiole vävnaden i en centimeter bitar inuti cellen suspension.Ta bort bladvävnaderna och inkubera stjälken och petiolebitarna i cellupphängningen i 10 till 30 minuter. Torka vävnaderna bitar på en steril bit av filterpapper och placera dem på böka medium beredd enligt manuskriptet riktningar. Inkubera plattorna i mörker vid 21 grader Celsius i två dagar.Efter de två dagarna, inspektera plattorna för svamp- eller bakteriekontaminering och kassera kontaminerade plattor. Överför vävnadsbitarna till 10 milliliter av SH-10 medium som är beredda enligt manuskriptriktningar. Låt vävnaden i mediet i minst 10 minuter, och försiktigt agitera varannan till var tredje minut för att tvätta.Förbered böka medium med cefotaxime och kanamycin enligt manuskriptet riktningar, och häll plattor. Torka vävnaderna på sterila bitar av filterpapper, och överför dem till plattorna. Inkubera plattor i sju dagar vid 28 grader Celsius under en 16-timmars dag, åtta timmar natt regim.Kontrollera plattor för svamp eller bakteriell kontaminering varannan dag. Om kontaminering uppstår, överför de icke-infekterade vävnadsbitarna till en fräsch platta. Efter sju dagar överför du vävnadsbitarna till förökningsmedium som utarbetats enligt manuskriptriktningar och inkuberar vid 28 grader Celsius under en 16-timmars, åtta timmars nattregim.Uppdatera plattorna en gång i veckan tills transgena skott utvecklas, se till att bara överföra icke-infekterade vävnad bitar till nya plattor. När de förmodade transgena skotten är minst en centimeter långa, skär skotten och odla dem självständigt i förökningsmedium med antibiotika. För att säkerställa att skotten representerar oberoende transformants, ta bara ett enda skott från varje sida av en explant.Propagera vävnaden genom att placera ca 10 skott på en färsk platta av förökningsmedium och stänga plattan med två lager elastisk tätningsfolie. Inkubera plattorna vid 28 grader Celsius under en 16-timmars dag, åtta timmar-natt regim, och upprepa detta steg var fjärde vecka. När skotten når en centimeter i längd, skär dem vid sin bas och placera dem på rotningsmediet.Placera skotten upprätt genom att föra in skjutningens basala spets i mediet. Cirka 10 skott kan placeras på en enda platta. Börja med att förbereda rhizobium inokulat.Inokulera 10 milliliter flytande YEM medium från en enda koloni av Mesorhizobium plurifarium BOR2, och inkubera vid 28 grader Celsius i två dagar. Använd denna kultur för att inokulera en större volym flytande YEM medium. När odlas, centrifugera bakteriekulturen i 10 minuter vid 3, 500 gånger g för att skörda cellerna.Åter upphäva bakteriepelleten i flytande EKM-medium, och bestäm den optiska densiteten. Förbered tre liter EKM-medium, vilket är tillräckligt för cirka 20 krukor, och inokulerar det med rhizobial suspensionen. Blanda mediet med 1,25 kg perlit, och tillsätt 210 gram av denna blandning till sterila genomskinliga polypropylen krukor.Plantera en till tre Parasponia andersonii plantlets till varje kruka, och förbereda flera krukor med plantlets omvandlas med kontrollen konstruera. Väg flera av krukorna, och täck botten av varje kruka för att skydda rötterna från ljusexponering. Inkubera krukorna i ett climatized tillväxtrum på 28 grader Celsius under en 16-timmars-dag, åtta timmar-natt regim för fyra till sex veckor.En gång i veckan, väga flera krukor för att bestämma vattenförlust. Om vattenförlusten överstiger 10 milliliter, komplettera med ultrarent vatten för att kompensera för förlusten. Efter inkubationen, rengör rötterna från perlit, och bestämma nodulenummer med hjälp av en kikare.Denna teknik har använts för att framgångsrikt omvandla petioles och segment av Parasponia andersonii stjälkar med Agrobacterium stam AGL1. Först samodlar vävnadsexplanterna med Agrobacterium i två dagar. Långvarig samodling resulterar i bakteriell över-kolonisering och bör förhindras.Några veckor senare observeras små gröna mikro-calli längs den ursprungliga sårytan. Dessa kalli fortsätter att växa och utveckla en eller flera förmodade omvandlas skott på sex till åtta veckor efter början av omvandlingen. Transformation effektivitetsvinster varierar från 10 till 30%för vävnad explants från mogna grenar till 65 till 75%för vävnad explants från unga och snabbt växande grenar.Transgena skott kan multipliceras genom förökning in vitro, vilket ger upphov till tiotals skott inom en månad. Dessa skott kan placeras på böka medium som kommer att inducera rotbildning i ungefär två veckor och avkastning växter som kan användas för experiment. När du startar ett stabilt experiment för omvandling är det viktigt att välja friska grenar som källmaterial.Parasponia T0 transgena linjer förökas in vitro. Därför är det väsentligt att grundligt genotyp Parasponia transgena linjer. Inrättandet av Parasponia som en experimentell modell möjliggör jämförande analys mellan två avlägset besläktade nodulating härstamningar, Parasponia och baljväxter.Detta skulle kunna identifiera bevara genetiska nätverk som ligger till grund för rhizobium symbios. Parasponia kan också vara en värdefull modell för att studera andra forskningsämnen som träbildning, utveckling av bisexuella blommor, eller biosyntesen av Cannabaceae-specifika sekundära metaboliter.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

Genome redigering och riktad differentiering av hPSCs för Förhöra Lineage bestämmelse i Human Pancreatic utveckling

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

Förbättrad genomet redigering med Cas9 ribonukleoprotein i olika celler och organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

Omvänd Transkription-Loop-medierad isotermiska amplifiering (RT-lampa) analys för Zika Virus och städning gener i urin, Serum och Mosquito Samples

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

CRISPR-medierad gen editering av den mänskliga svamp patogener Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

Introduktion av punktmutationer i mänskliga pluripotenta stamceller med sömlös genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...