Name: transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Yazarlar Mark Youles, Sophien Kamoun ve Sylvestre Marillonnet'i Addgene veritabanı nda Golden Gate klonlama parçalarını kullanıma savurduklarından dolayı kabul etmek isterler. Ayrıca, P. andersonii tohumları için E. James, P. Hadobas ve T. J. Higgens'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO-VICI hibe 865.13.001; NWO-Açık Yarışma hibe 819.01.007) ve Endonezya Cumhuriyeti Araştırma, Teknoloji ve Yüksek Öğretim Bakanlığı (RISET-PRO hibe 8245-ID).

<ol>
	<li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+(EAST+JAVA).">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li><li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulmaceae.">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia.">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li><li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speak,+friend,+and+enter:+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants.">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li><li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis.">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li><li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses.">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li><li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resurrected+Scenario:+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation.">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li><li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis.">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743 (2018).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+(Ulmaceae).">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li><li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes.">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes&#8211;mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent.">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes&#8211;mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li><li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations.">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li><li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules.">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li><li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+root:+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots.">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li><li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium.">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li><li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia.">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li><li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia.">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs.">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765 (2011).</li><li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli.">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li><li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants.">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li><li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+CRISPR/Cas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana.">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium.">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li><li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes.">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li><li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli.">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li><li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizobium+tropici,+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees.">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li><li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling.">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li><li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d&#8217;un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d&#8217;estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle.">Mesure du taux de mycorhization VA d&#8217;un systeme radiculaire. Recherche de methods d&#8217;estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li><li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures.">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li><li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity,+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions.">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil.">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li><li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).</li><li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+plant+tissue+culture.">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li><li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somaclonal+variation+&#8212;+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement.">Somaclonal variation &#8212; a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li><li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes.">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li><li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+of+Black+Cottonwood,+Populus+trichocarpa+(Torr.+&amp;+Gray).">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. &amp; Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520 (2011).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Structure+of+the+Legume,+Lotus+japonicus.">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li><li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants.">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).</li><li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation.">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971 (2015).</li><li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Baklagiller ve uzaktan ilişkili Cannabaceae cinsi Parasponia, azot sabitleme rizobiası ile endosimbiyotik ilişki kurabilen ve kök nodülleri oluşturabilen bitki türlerinin sadece iki clad'ını temsil eder. Her iki clades türleri arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar son derece bu simbiyoz sağlayan çekirdek genetik ağlar içine anlayışlar sağlamak için ilgilidir. Şu anda, genetik çalışmalar ağırlıklı olarak baklagiller yapılır; özellikle iki model tür M. truncatula ve L. japonicus. Ek bir deneysel platform sağlamak ve bir nodulating olmayan baklagil ile karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştırmak için, burada p. andersoniiistikrarlı dönüşüm ve ters genetik analizler için ayrıntılı bir protokol açıklar. Sunulan protokolde T0 transgenik P. andersonii hatlarının in vitro yayılımı, A. tumefaciens co-cultivation'dan sonra 4 ay içinde fenotipik analize başlanmasına olanak tanımıştır. Bu baklagiller33istikrarlı dönüşümü için kurulmuş olan mevcut protokoller önemli ölçüde daha hızlıdır. Bu P. andersonii çekici bir araştırma modeli yapar.
Burada açıklanan protokol birkaç kritik adım içerir. Bunlardan ilki tohum çimlenmesiyle ilgilidir. Çimlenme için P. andersonii tohumları hazırlamak için, tohumlar meyveleri izole edilmesi gerekir. Bu bir kağıt mendil parçası veya bir çay elek içine karşı çilek sürtünme tarafından yapılır. Bu işlemin, tohum katın zarar görmesini önlemek için nazikçe yapılması gerekir. Eğer tohum kat zarar görürse, çamaşır suyu sterilizasyon sırasında tohum girebilirsiniz, hangi tohum canlılığını azaltır. Tohum atıllığını kırmak için tohumlar 10 günlük sıcaklık döngüsüne tabi tutulur. Ancak, bu tedaviye rağmen, çimlenme tamamen senkronize değildir. Genellikle, ilk tohumları radicle ortaya çıkması göstermek 7 gün sonra, ama diğerleri çimlenmek için birkaç gün daha uzun sürebilir.
Dönüşüm prosedüründeki kritik noktalar başlangıç materyalinin seçimi ve ortak yetiştirme adımının süresi ile ilgilidir. Verimli dönüşümulaşmak için, başlangıç malzemesi olarak steril olmayan sera yetiştirilen bitkilerin sağlıklı ve genç kaynaklanıyor veya petioles kullanmak en iyisidir. Genç dalların büyümesini sağlamak için, parasponia ağaçlarını her 2-3 ayda bir kesmeniz ve yılda bir kez ağaçları yenilemeleri tavsiye edilir. Ayrıca, ortak yetiştirme adımı sadece 2 gün için yapılmalıdır. Uzun süreli birlikte yetiştirme A. tumefaciens tarafından doku ekbitkileri aşırı kolonizasyon teşvik ve genellikle dönüşüm verimliliğini azaltır. A. tumefaciens tarafından aşırı kolonizasyon önlemek için de düzenli olarak eksültasyon ekili olan plakaları yenilemek için önemlidir. Aşırı kolonizasyon meydana gelirse, doku eksperiler yıkanabilir (Bkz. Bölüm 3.8) A. tumefaciens hücreleri kaldırmak için. Yıkamada kullanılan SH-10 çözeltisine çamaşır suyu eklemenizi tavsiye ederiz (son konsantrasyon: ~%2 hipoklorit). Bu ek yıkama adımının ağır enfekte ekbitkilerde işe yaramayabileceğini unutmayın (Şekil 2B). CRISPR/Cas9 yapısı ile yapılan bir dönüşümün sadece sınırlı sayıda putatif olarak dönüştürülmüş sürgünler üretmesi veya belirli bir genin mutagenezinin rejenerasyonda sorunlara yol açması bekleniyorsa, boş bir vektör kontrol yapısının pozitif kontrol. Son olarak, seçilen tüm transgenik çizgilerin bağımsız T-DNA tümleştirme olaylarından kaynaklandığından emin olmak önemlidir. Bu nedenle, bir eksplantın her iki tarafından sadece tek bir putatif-transgenik çekim almak için talimat. Ancak, bunun potansiyel bağımsız hat sayısını azalttığının farkındayız. Birçok satır gerekirse, araştırmacılar bu calli 'nin ≥2 mm boyutu ve kültürü bu calli bağımsız olduğunda putatif olarak dönüştürülmüş calli'yi orijinal ekspekten ayırmaya karar verebilirler. Bu şekilde, her eksplanttan birden fazla hat izole edilebilir, bu da potansiyel transgenik çizgilerin sayısını yükseltir.
Mevcut protokolde P. andersonii'nin transgenik çizgileri in vitro yayılım yoluyla bitkisel olarak yayılır. Bunun avantajı birçok transgenik plantlets nispeten kısa bir süre içinde oluşturulabilir olmasıdır. Ancak, bu yöntemde de çeşitli sınırlamalar vardır. Öncelikle, in vitro yayılım yoluyla T0 transgenik hatların bakımı emek yoğun ve istenmeyen genetik veya epigenetik değişikliklere neden olabilir34,35. İkinci olarak, T0 çizgileri hala Antibiyotik direnci kaseti de dahil olmak üzere T-DNA'sının bir kopyasını içerir. Bu, her yeniden dönüştürme için farklı seçim işaretleri gerektiğinden, olası yeniden dönüşüm lerin sayısını sınırlar. Şu anda, biz sadece kanamisin veya higromisin seçimi (veri gösterilmez) kullanarak dönüşüm test ettik. Ayrıca, T0 transgenik hatlarında Cas9 kodlama dizisi nin ve sgRNA'ların varlığı tamamlayıcı çalışmaları karmaşıkhale getirmiştir. Tamamlayıcı tahliller mümkündür, ancak sgRNA hedef alanının(lar) mutasyona uğramasını gerektirir, çünkü tamamlayıcı yapının gen düzenlemesi engellenir. Üçüncü olarak, T0 hatları ile çalışan bir dezavantajı CRISPR / Cas9 mutantlar chimeric olabilir. Simerik mutant hatlarının henotik analizini önlemek için, en az 3 farklı çekimde in vitro yayılım sonrası genotipleme analizini tekrarlamanızı öneririz. Burada açıklanan protokol kullanılarak elde edilen şimerik mutantların sayısı sınırlı olmasına rağmen, zaman zaman10gözlenir. T0 hatları ile çalışma sınırlamaları aşmak için, P. andersonii mutant hatları generatively yayılabilir. P. andersonii ağaçları dioecious ve rüzgar-tozlaşma2. Bu, her transgenik çizginin erkek ve dişi çiçeklerin tek bir birey üzerinde üretilmesi ve daha sonra çapraz tozlaşmanın oluşmaması gibi yetiştirilmesi gibi manipüle edilmesi gerektiği anlamına gelir. P. andersonii hızlı büyüyen bir ağaç olduğu için tropikal bir serada (28 °C, ~%85 bağıl nem) önemli miktarda yer gerektirir. Bu nedenle, teknik olarak mümkün olsa da, P. andersonii transgenik hatlarının generatif yayılımı lojistik açıdan zordur.
Protokol bölümünde P. andersoniinodulation için 3 yöntem açıklanmıştır. Plaka ve kese sistemlerinin avantajı, köklerin kolayca erişilebilir olmasıdır, bu da bakterilerin nokta aşılanmasına ve zamanla nodül oluşumunu takiben izin verebilir. Ancak, plaka sistemi oldukça emek yoğun, hangi daha az büyük ölçekli nodulation deneyler için uygun hale getirir. Kese sisteminin bir dezavantajı mantar kontaminasyonunu önlemenin zor olmasıdır. Keseler steril değildir ve bu nedenle poğaçanın üst yarısında genellikle mantar büyümesi görülür. Ancak, bu P. andersonii büyümesini etkilemez, ve bu nedenle nodulation tahlilleri ile müdahale etmez. Ayrıca, kese sistemi sadece fideler için uygundur. Çeşitli girişimlere rağmen, biz torbalarda in vitro yayılım yoluyla elde edilen plantlets büyümek mümkün olmuştur.
Burada açıklanan P. andersonii ters genetik boru hattı mevcut A. rhizogenestabanlı kök dönüşüm yöntemi11ile karşılaştırıldığında önemli bir iyileşme sunuyor. Açıklanan prosedürler kullanılarak, kararlı transgenik hatlar verimli bir şekilde oluşturulabilir ve in vitro yayılım yoluyla muhafaza edilebilir. Buna karşılık, A. rhizogenes dönüşümü geçicidir ve sadece transgenik köklerin oluşumuna neden olabilir. Çünkü her transgenik kök bağımsız bir dönüşümden kaynaklanır, A. rhizogenes transformasyon tabanlı tahliller önemli bir henotik varyasyon muzdarip. Bu varyasyon kararlı çizgiler durumunda çok daha azdır, ancak in vitro yayılım da bir miktar varyasyon oluşturur. Bu azaltılmış varyasyon ve birden fazla plantlets her kararlı çizgi için fenotip olabilir gerçeği nedeniyle, kararlı çizgiler a. rhizogenes-dönüştürülmüş kökleri ile karşılaştırıldığında nicel tahliller için daha uygundur. Ayrıca, kararlı dönüşüm endojen hormon dengesini etkileyen A. rhizogenes kök indükleyici lokus giriş bağlı değildir (rol) endojen hormon dengesini etkiler15. Bu nedenle, kararlı çizgiler daha iyi hormon homeostaz dahil genlerin ters genetik analizi için uygundur A. rhizogenes-dönüştürülmüş kökleri ile karşılaştırıldığında. Araştırma modeli olarak P. andersonii daha genel bir avantajı yeni bir bütün genom çoğaltma (WGD) yaşamadı olmasıdır. Baklagil Papilionoideae alt familyası, model baklagiller M. truncatula ve L. japonicusiçerir, yanı sıra Salicaceae (sipariş Malpighiales) model ağaç Populus trichocarpa deneyimli WGDs ~65 içerir milyon yıl önce36,37. Bu WGD'lerden kaynaklanan birçok paralog gen kopyası M. truncatula, L. japonicus ve P. trichocarpa37,38,39, ters genetik analizleri zorlaştırabilecek fazlalık. P. andersonii yeni bir WGD deneyimi yoktu gibi, P. andersonii üzerinde ters genetik analizler paralogous gen kopyalarının gereksiz işleyişinden daha az etkilenebilir.
Birlikte ele alındığında, Biz P. andersoniiters genetik analiz için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokol kullanılarak, tek mutant hatları verimli bir zaman dilimi içinde oluşturulabilir 2-3 ay10. Bu protokol, diğer bitki türleri40,41,42için gösterildiği gibi, aynı anda farklı genleri hedefleyen sgRNA'ların çoklama yoluyla daha yüksek sıra mutantlar oluşturmak için uzatılabilir. Ayrıca, burada açıklanan kararlı dönüşüm prosedürü CRISPR/Cas9 gen hedeflemesi ile sınırlı değildir, ancak diğer yapı türlerini tanıtmak için de kullanılabilir (örn. organizatör-muhabir tahlilleri, ektopik ifade veya trans- tamamlayıcı). Azot sabitleme rhizobia veya endomycorrhizal mantarları ile karşılıklı ortakyaşamları incelemek için karşılaştırmalı bir araştırma modeli olarak P. andersonii'yi kurduk. Ancak, burada açıklanan protokoller aynı zamanda bu tropik ağacın biyolojisinin diğer yönlerini incelemek için araçlar sağlar, örneğin odun oluşumu, bi-cinsel çiçeklerin geliştirilmesi veya Cannabaceae'ye özgü ikincil metabolitlerin biyosentezi gibi.

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait tropik bir ağaçtır vePapua Yeni Gine ve birkaç Pasifik Adaları 1,2,3'e özgüdür. 4 ek Parasponia türü ile birlikte, rhizobia ile azot sabitleme nodül simbiyoz kurabilirsiniz sadece non-baklagiller soy temsil eder. Bu simbiyoz iyi baklagiller (Fabaceae) modelleri Medicago truncatula ve Lotus japonicusçalışılmıştır , hangi nodül oluşumu moleküler genetik doğası ayrıntılı bilgi edinme sonuçlandı ve işleyişi4. Ayrıca baklagillerde kök nodül simbiyozçok çok daha eski ve yaygın arbusküler micorrhizal simbiyoz5üzerine kurulduğu gösterilmiştir. Filogenomik karşılaştırmalar, baklagiller, Parasponia,azot sabitleme nodül simbiyozlar yanı sıra, diazotrofik Frankia bakteri barındıran sözde actinorhizal bitki türleri, ortak bir evrimsel kökene sahip olduğunu göstermektedir 6,7,8. Baklagil nodül oluşumunda rol aldığı tespit edilen genlerin korunmuş genetik temelin bir parçası olup olmadığını belirlemek için baklagil dışı türler üzerinde yapılan çalışmalar esastır. Bu amaçla, p. andersonii'yi baklagillerin yanı sıra, kök nodül oluşumu ve işleyişinin altında yatan çekirdek genetik ağları tanımlamak için karşılaştırmalı bir araştırma modeli olarak kullanmayı öneriyoruz.
P. andersonii volkanik tepelerin yamaçlarında bulunabilir bir öncüdür. Ayda 45 cm'lik büyüme hızlarını karşılayabilir ve 10metreyekadar 9 metreye ulaşabilir. P. andersonii ağaçları rüzgar-tozlaşma, hangi ayrı erkek ve dişi çiçekler3,10oluşumu ile kolaylaştırılır. Yakın zamanda P. andersonii'nindiploid genomunu (2n = 20; 560 Mb/1C) sıraladık ve açıklamaladık ve 2 ek Parasponia türünün taslak genom dizilerini bir araya getirdik; P. rigida ve P. rugosa6. Bu ortaya ~ 35,000 P. andersonii gen modelleri içinde kümelenebilir >20,000 ortogruplar m. truncatulagenleri ile birlikte , soya (Glisin max), Arabidopsis thaliana, ormanlık çilek ( Fragaria vesca), Trema orientalis, siyah pamuk kavak (Populus trichocarpa) ve okaliptüs (Okaliptüs grandis)6. Ayrıca, M. truncatula ve P. andersonii arasındaki transkripsiyon karşılaştırmaları, her iki türde de nodül geliştirilmiş ifade deseni gösteren 290 putatif ortolog kümesini tanımlamışlardır6. Bu karşılaştırmalı çalışmalar için mükemmel bir kaynak sağlar.
P. andersonii kökleri ve nodüllerde gen fonksiyonunu incelemek için Agrobacterium rhizogenes-aracılı kök dönüşümü için bir protokol oluşturulmuştur11. Bu protokol kullanılarak, transgenik kökleri taşıyan bileşik bitkiler nispeten kısa bir zaman diliminde oluşturulabilir. Bu yöntem, aynı zamanda, yaygın baklagil-simbiyoz araştırma12,13,14uygulanır. Ancak, bu yöntemin dezavantajı sadece köklerin dönüştürülmesi ve her transgenik kökün bağımsız bir dönüşüm olayını temsil ederek önemli bir değişime yol açarak ortaya çıkan bir durumdur. Ayrıca, dönüşüm geçicidir ve transgenik çizgiler sürdürülemez. Bu, A. rhizogenesbazlı kök dönüşümünü CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenlemesi için daha az uygun hale getirir. Ayrıca, A. rhizogenes kök indükleyen locus aktarAn (rol) bitki genomuna genler, hangi kez hormon homeostaz15müdahale ifade . Bu a. rhizogenes-dönüştürülmüş kökleri zorlu bitki hormonlarının rolünü çalışma yapar. Bu sınırlamaları aşmak için, son zamanlarda Agrobacterium tumefaciens-tabanlı dönüşüm ve CRISPR / Cas9-P. andersonii10aracılı mutagenezi için bir protokol geliştirdi.
Burada, P. andersoniiiçin geliştirilen A. tumefacienstabanlı dönüşüm prosedürü ve ters genetik boru hattının ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Ayrıca, simbiyotik etkileşimleri incelemek için tahliller de dahil olmak üzere transgenik plantetlerin aşağı doğru kullanımı için protokoller salıyoruz. Burada açıklanan protokol kullanılarak, 2-3 aylık bir süre içinde birden fazla transgenik hat oluşturulabilir. CRISPR/Cas9 aracılı mutagenez ile birlikte, bu nakavt mutant hatları verimli nesil sağlar. Bu mutant çizgiler vegetatif in vitro 10,16,17, dönüşüm prosedürü sonra 4 ay içinde henotipik karakterizasyon başlatmak için oluşturulacak yeterli malzeme sağlar yayılır olabilir 10başlatıldı . Birlikte, bu prosedürler insa edilen bu laboratuvar, herhangi bir laboratuvarın, bu tropik ağacın biyolojisinin potansiyel olarak diğer yönlerini nisabı ve mikizobial ilişkime yönelik çalışmalar için bir araştırma modeli olarak p. andersonii'yi benimsemesine olanak vermelidir.

<table>
<tbody>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N0640</td>
<td>NAA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1503.0250</td>
<td>MES</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D134406</td>
<td>Acetosyringone</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>X1402.1000</td>
<td>X-Gal</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101236</td>
<td>For nucleic acid electrophoresis gel</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>Pouches box material, hangers</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>101188</td>
<td>NH4NO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B3408-1G</td>
<td>BAP</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100156</td>
<td>H3BO3</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER1011</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>15561020</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137101</td>
<td>CaCl2&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>C0111.0025</td>
<td>C16H16N5O7S2Na</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>K1231</td>
<td>Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure</td>
</tr>
<tr>
<td>Agronutrition</td>
<td>AP2011</td>
<td>Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102790</td>
<td>CuSO4&middot;5H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>D1004.1000</td>
<td>Used for plant tissue culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105101</td>
<td>K2HPO4</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>20302.293</td>
<td>Na2&middot;EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M0803.1000</td>
<td>C6H14O6</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>ER0291</td>
<td>Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100983</td>
<td>C2H5OH</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>BDH9232-500G</td>
<td>EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z377600-1PAK</td>
<td>Cellophane membrane</td>
</tr>
<tr>
<td>Biomatters, Ltd.</td>
<td>R9 or higher</td>
<td>Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs</td>
</tr>
<tr>
<td>Mega International</td>
<td>-</td>
<td>Technical information at https://mega-international.com/tech-info/</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>65882</td>
<td>Used for fixating nodule tissues</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>24385.295</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Vink</td>
<td>219341</td>
<td>Pouches box material, bottom part</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica Biosystems</td>
<td>14702218311</td>
<td>Used as a template for plastic embedding</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>100317</td>
<td>HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5386-1G</td>
<td>IBA</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103862</td>
<td>C6H5FeO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>103965</td>
<td>FeSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>I1401.0005</td>
<td>IPTG</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>K0126.0010</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L2000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105886</td>
<td>MgSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105934</td>
<td>MnCl2&middot;4H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>102786</td>
<td>MnSO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>M1002.1000</td>
<td>Used for bacterial culture agar-based medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Manutan</td>
<td>92007687</td>
<td>Pouches material</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraxisdienst</td>
<td>130774</td>
<td>Elastic sealing foil</td>
</tr>
<tr>
<td>Pull Rhenen</td>
<td>Agra-Perlite No.3</td>
<td>Used as growing substrate in pots for nodulation assay</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>391-0581</td>
<td>Used as container for cellophane membranes</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>F130WH</td>
<td>For genotyping transgenic lines</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50337</td>
<td>Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48017</td>
<td>End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48018</td>
<td>End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48001</td>
<td>Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>48007</td>
<td>Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50268</td>
<td>Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, &Omega; (Tobacco Mosaic Virus)</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46966</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>46968</td>
<td>Used for designing CRISPR/Cas9 module</td>
</tr>
<tr>
<td>Addgene </td>
<td>50334</td>
<td>Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette</td>
</tr>
<tr>
<td>Topzeven</td>
<td>-</td>
<td>Used as filters for washing spore suspension</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>8.17003</td>
<td>PEG400</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>E1674.0001</td>
<td>Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>104871</td>
<td>KH2PO4</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105033</td>
<td>KOH</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>105153</td>
<td>K2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Van Leusden b.v.</td>
<td>-</td>
<td>Used as growing substrate for mychorrhization assay</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0225.0050</td>
<td>SH-basal salt medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0411.0250</td>
<td>SH-vitamin mixture</td>
</tr>
<tr>
<td>Lehle Seeds</td>
<td>VIS-02</td>
<td>Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>137017</td>
<td>NaCl</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>89230-072</td>
<td>C6H11NaO7</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106521</td>
<td>Na2MoO4&middot;2H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>106574</td>
<td>Na2HPO4&middot;7H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>567549</td>
<td>NaH2PO4&middot;H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>239313</td>
<td>Na2SO4O</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>S0809.5000</td>
<td>C12H22O11</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>B69</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>EL0013</td>
<td>Used in Golden Gate cloning assembly</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64708806</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>64709003</td>
<td>HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td>
<td>66022678</td>
<td>Methyl methacrylate-based resin solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>1159300025</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Acros</td>
<td>189350250</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>VWR Chemicals</td>
<td>663684B</td>
<td>Polysorbate 20</td>
</tr>
<tr>
<td>Stout Perspex</td>
<td>-</td>
<td>pouches box material, lid</td>
</tr>
<tr>
<td>Duchefa Biochemie</td>
<td>Y1333.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Merck</td>
<td>108816</td>
<td>ZnCl2</td>
</tr>
<tr>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>33399</td>
<td>ZnSO4O&middot;7H2O</td>
</tr>
</tbody>
</table>

transforming, genome editing and phenotyping the nitrogen-fixing tropical cannabaceae tree parasponia andersonii

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait hızlı büyüyen bir tropikal ağaçtır. 4 ek tür ile birlikte, rhizobium ile azot sabitleme nodül simbiyoz kurmak mümkün bilinen tek baklagil olmayan soy oluşturur. Baklagiller ve P. andersonii arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar kök nodül oluşumunun altında yatan genetik ağlara değerli bir bakış açısı sağlayabilir. Karşılaştırmalı çalışmaları kolaylaştırmak için, yakın zamanda P. andersonii genomunu sıraladık ve Agrobacterium tumefaciens-aracılı kararlı dönüşüm ve CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenlemesini kurduk. Burada P. andersoniiiçin geliştirilen dönüşüm ve genom düzenleme prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Buna ek olarak, simbiyotik fenotiplerin tohum çimlenmesi ve karakterizasyonu için prosedürleri açıklar. Bu protokol kullanılarak 2-3 aylık bir sürede stabil transgenik mutant hatları oluşturulabilir. T0 transgenik hatlarının vitro yayılımı nda vegetatif, A. tumefaciens co-cultivation'dan 4 ay sonra fenotilik deneylerin başlatılmasını sağlar. Bu nedenle, bu protokol sadece marjinal geçici Agrobacterium rhizogenesdaha uzun sürer -P. andersoniiiçin kullanılabilir tabanlı kök dönüşüm yöntemi , ancak birkaç net avantajlar sunuyor. Burada açıklanan prosedürler, P. andersonii'nin simbiyotik çağrışımları ve bu tropik ağacın biyolojisinin potansiyel olarak diğer yönlerini anlamayı amaçlayan çalışmalarda bir araştırma modeli olarak kullanılmasına izin verebilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video at JoVE.com

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii Video (Video) | JoVE

Parasponia andersonii, Kenevir ailesine (Cannabaceae) ait olan ve rizobium ile birlikte azot sabitleme kökü nodülleri oluşturabilen hızlı büyüyen tropikal bir ağaçtır. Burada, Agrobacterium tumefaciens-aracılı kararlı dönüşüm ve CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenlemesine dayalı P. andersonii'de ters genetik analizler için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Dönüşüm, Genom Düzenleme ve Fenotipleme Azot sabitleme Tropikal Cannabaceae Ağaç Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia rizom ile bir azot sabitleme simbiyoz kurmak mümkün Esrar ailesinden tropikal bir ağaçtır. Parasponia ve baklagiller arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar rhizobium simbiyoz altında yatan çekirdek genetik ağlar içine fikir sağlayabilir. Bu protokol ile, Parasponia andersonii kararlı transgenik mutant hatları iki ila üç aylık bir süre içinde oluşturulabilir.Bu çizgiler in vitro yayılım yoluyla verimli bir şekilde yayılabilir. Bu protokol, bu tropik ağacın biyolojisinin diğer yönlerinin yanı sıra rizobiyal simbiyoz üzerinde çalışmak için deneysel bir platform sağlar. Doku kültürü ve moleküler klonlama temel becerileri bu protokolü uygulamak için yeterlidir.Bu herhangi bir laboratuvar araştırma modeli olarak Parasponia adapte sağlar. Prosedürü gösteren doktora öğrencileri Titis Wardhani ve Yuda Roswanjaya marijke Hartog, bizim laboratuvarda bir teknisyen ile birlikte olacaktır. Parasponia andersonii ağaçları büyümek için, tohumları çimlenme ile başlar.Bir çay eleğinin içine sürtünme veya kağıt mendil bir parça üzerinde ezme parasponia çilek tohumları çıkarın. 15 ila 20 dakika boyunca % 4 hipoklorit çamaşır suyu kullanarak tohumları dezenfekte edin ve sonra tohumları altı kez sterilsu ile yıkayın. Tohumları steril 200 mikrolitre PCR tüpüne aktarın ve tohumları batırmak için tüpleri steril suyla doldurun.Tüpleri el yazması talimatlara göre bir termocycler 10 gün kuluçkaya yatırın. 10 günlük kuluçkadan sonra tohumları SH-0 plakalarına aktarın ve kurumasını önlemek için iki kat elastik sızdırmazlık folyosu ile kapatın. 28 derecede 16 saatlik bir gün, sekiz saatlik gece döngüsü ile üç ila dört hafta kuluçka.Fideler ilk gerçek yapraklarını geliştirdikten sonra, onları ticari çömlekçilik toprağıyla dolu tencerelere aktarın ve kurumasını önlemek için yarı saydam plastik bir kap ile kaplayın. 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 derece santigrat, % 85 bağıl nem iklim odası veya sera tencere yerleştirin. Bir hafta sonra, plastik bardak çıkarın.Düzenli olarak tencere su ve ağaç büyümesini sürdürmek için gübre ile ek. Serada yetişen ağaçlardan beş ila sekiz santimetrelik genç dalları toplayarak, sadece sağlıklı, enfekte olmayan dalları kullanmayı önleyerek dönüşüme hazırolun. Yaprakları kesin, her petiole sonunda yaprak dokusunun bir santimetre kare kare bırakarak.15 dakika boyunca 2% hipoklorit ağartıcı ile polisorbat 20 birkaç damla içeren doku dezenfekte ve sonra otoklavlı su ile sekiz kez durulayın. Agrobacterium hücrelerini 25 mililitre lik bir infiltrasyon ortamıile yaklaşık beş optik yoğunluğa yeniden askıya alın. Kök ve petiole dokuyu hücre süspansiyonunun içinde bir santimetrelik parçalara kesin.Yaprak dokuları çıkarın ve 10 ila 30 dakika hücre süspansiyon kök ve petiole parçaları inkübe. Doku parçalarını steril bir filtre kağıdı üzerine kurutun ve el yazması talimatlara göre hazırlanmış kökleme ortamına yerleştirin. Plakaları karanlıkta 21 derecede iki gün kuluçkaya yatırın.İki gün sonra, mantar veya bakteriyel kontaminasyon için plakaları inceleyin ve kontamine plakaları atın. Doku parçalarını el yazması talimatlara göre hazırlanan 10 mililitre SH-10 ortamına aktarın. En az 10 dakika orta doku bırakın ve yavaşça yıkamak için her iki ila üç dakikada bir çalkalayın.El yazması yönlere göre cefotaxime ve kanamisin ile kökleme ortamı hazırlayın ve plaka dökün. Steril filtre kağıdı parçaları üzerinde dokuları kurulayın ve plakalara aktarın. 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 santigrat derecede yedi gün boyunca kuluçka plakaları.Her iki günde bir mantar veya bakteriyel kontaminasyon için plakaları kontrol edin. Kontaminasyon oluşursa, enfekte olmayan doku parçalarını yeni bir tabağa aktarın. Yedi gün sonra, el yazması talimatlara göre hazırlanan doku parçalarını yayılma ortamına aktarın ve 16 saat, sekiz saatlik bir gece rejimi altında 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Transgenik sürgünler gelişene kadar haftada bir tabakları yenileyin ve enfekte olmayan doku parçalarını yeni plakalara aktarın. Bir kez putatif transgenik sürgünler en az bir santimetre uzunluğunda, sürgünler kesmek ve antibiyotik ile yayılma orta bağımsız olarak kültür. Sürgünlerin bağımsız dönüştürücüleri temsil etmesini sağlamak için, bir ekstronun her iki tarafından yalnızca tek bir çekim çekin.Yayılım orta taze bir plaka üzerinde yaklaşık 10 sürgünler yerleştirerek ve elastik sızdırmazlık folyo iki kat ile plaka kapatarak doku yaymak. Plakaları 16 saatlik, sekiz saatlik bir rejim altında 28 derecede kuluçkaya yatırın ve bu adımı dört haftada bir tekrarlayın. Sürgünler bir santimetre uzunluğa ulaştığında, tabanlarından kesin ve kökleme ortamına yerleştirin.Çekimin bazal ucunu ortama yerleştirerek çekimleri dik olarak yerleştirin. Yaklaşık 10 sürgünler tek bir plaka üzerine yerleştirilebilir. Rhizobium inoculum hazırlayarak başlayın.Mesorhizobium plurifarium BOR2 kolonisinden 10 mililitre sıvı YEM ortamı aşıla ve iki gün boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sıvı YEM orta daha büyük bir hacim aşılamak için bu kültürü kullanın. Bir kez büyüdükten sonra, hücreleri hasat için 3, 500 kez g 10 dakika boyunca bakteri kültürü santrifüj.Sıvı EKM ortamdaki bakteriyel peleti yeniden askıya alın ve optik yoğunluğunu belirleyin. Yaklaşık 20 tencere için yeterli olan üç litre EKM ortamı hazırlayın ve rizobial süspansiyon ile aşılamak. Orta ve 1,25 kilogram perliti karıştırın ve steril yarı saydam polipropilen kaplara bu karışımın 210 gramını ekleyin.Her pota bir ila üç Parasponia andersonii plantlets bitki ve kontrol yapısı ile dönüştürülmüş plantlets ile çeşitli tencere hazırlamak. Tencerebirkaç tartMak ve ışık maruz kalma kökleri korumak için her tencerenin alt kapağı. Tencereleri 16 saat, sekiz saatlik gece rejimi altında 28 derecede, 16-6 hafta boyunca iklimlendirilmiş bir büyüme odasında kuluçkaya yatırın.Haftada bir kez, su kaybını belirlemek için birkaç tencere tartın. Su kaybı 10 mililitreyi aşarsa, kaybı telafi etmek için ultra saf su ile tamamlayın. Kuluçkadan sonra, perlit kökleri temiz ve bir dürbün kullanarak nodül numaralarını belirlemek.Bu teknik, Agrobacterium strain AGL1 ile petioles ve Parasponia andersonii kaynaklanıyor segmentleri başarıyla dönüştürmek için kullanılmıştır. İlk olarak, doku eksplants iki gün boyunca Agrobacterium ile birlikte yetiştirilir. Uzun süreli birlikte ekimi bakteriyel aşırı kolonizasyonla sonuçlanır ve önlenmelidir.Birkaç hafta sonra, küçük yeşil mikro-calli orijinal yara yüzeyi boyunca gözlenir. Bu calli büyümeye devam ve dönüşümün başlamasından sonra altı ila sekiz hafta bir veya daha fazla putatif dönüştürülmüş sürgünler geliştirmek. Dönüşüm verimliliği, olgun dallardan doku ekspları için %10-30 ile genç ve hızla büyüyen dallardan gelen doku ekspları için %65-75 arasında değişmektedir.Transgenik sürgünler in vitro yayılım yoluyla çarpılabilir, bu da bir ay içinde onlarca sürgüne yol açar. Bu sürgünler yaklaşık iki hafta içinde kök oluşumunu neden olacak ve deney için kullanılabilecek bitkiler verim köklendirme orta yerleştirilebilir. Kararlı bir dönüşüm denemesi başlatırken, kaynak malzeme olarak sağlıklı dalları seçmek önemlidir.Parasponia T0 transgenik hatları in vitro olarak yayılır. Bu nedenle, iyice genotip Parasponia transgenik hatları esastır. Parasponia'nın deneysel bir model olarak kurulması, uzakbir şekilde birbirine bağlı iki nodulating soy, Parasponia ve baklagiller arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.Bu, rhizobium simbiyozun altında yatan genetik ağların korunmasını belirleyebilir. Parasponia da ahşap oluşumu, biseksüel çiçek gelişimi veya Cannabaceae özgü ikincil metabolitlerin biyosentezi gibi diğer araştırma konuları incelemek için değerli bir model olabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Unit 1

Introduction to Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement Video (Video) | JoVE

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen Video (Video) | JoVE

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development Video (Video) | JoVE

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells Video (Video) | JoVE

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms Video (Video) | JoVE

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum Video (Video) | JoVE

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples Video (Video) | JoVE

İzotermal amplifikasyon (RT-lamba) transkripsiyon-Loop-aracılı tahlil Zika virüs ve Housekeeping genler idrar, Serum ve sivrisinek örnekleri için ters

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans Video (Video) | JoVE

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas Video (Video) | JoVE

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing Video (Video) | JoVE

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...