Name: genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00
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我们感谢J.Roop、R.哈克利、I.格里戈里耶夫、阿·阿金和J.斯克尔对原始研究的贡献,F.AlZaben,A.Flury,G.Geiselman,J.Hong,J.Kim,M.Maurer和L.Oltrogge,D.萨维奇慷慨地提供显微镜资源,B.布莱克曼,S.科拉迪蒂,A.弗拉姆霍尔茨,V.瓜奇,D.科什兰,C.纳尔逊和A.萨西库马尔讨论;我们还感谢J.Dueber(加州大学伯克利分校生物工程系)的PiggyBac质粒。这项工作得到了R01 GM120430-A1和美国能源部科学用户设施办公室联合基因组研究所1460至RBB社区测序项目的支持。后者的工作得到美国能源部科学办公室根据第1号合同的支持。去 AC02-05CH11231。

1. 准备含有猪囊的质粒进行转化
<ol><li>将含有质粒pJR487的大肠杆菌菌株分到单菌群,放入LB + 卡比西林琼脂板。在37°C或单个菌落出现之前孵育1晚。 注:关于如何克隆质粒pJR487的描述可以在我们以前的工作3中找到。</li>
	<li>在 100 μg/mL 时接种 1 L 的 LB + 卡比西林,在 2 L 玻璃瓶中使用单个含有 pJR487 的大肠杆菌。在 37°C 下生长过夜,在 200 rpm 转速下摇动,直到饱和(OD...

<ol>
	<li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits:+successes+and+pitfalls.">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li><li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+species+differences.">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li><li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance.">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li><li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test.">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li><li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast.">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li><li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics:+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus.">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li><li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons.">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li><li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae.">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li></ol>

与以前的统计遗传方法相比,RH-seq的优点是几倍。与链接和关联分析相比,RH-seq提供单基因映射分辨率;因此,即使在研究特定物种个体之间的特征变异以及特异性差异时,它也可能具有重大效用。此外,以前在全基因组对内造异性分析的尝试使用基因缺失突变体的集合,其中一些含有二次突变,可能导致假阳性结果9,10。RH-seq策略通过依次生成和对每个基因中的?...

自该领域诞生以来,了解野生个体变异的机械基础一直是遗传学的首要目标。当我们绘制出一个感兴趣的特征的位点时,新兴基因可以立即用作诊断和药物的目标,并可以揭示进化的原理。为此的行业标准是通过联系或关联1来测试基因型和表型之间的关系。这些方法功能强大,但存在一个关键限制——它们依赖于来自不育个体间交叉的重组后代的大面板。它们对于研究那些不能交配形成后代的物种没有用处。因此,该场几乎没有能力对生殖分离的物种2之间的特征差异进行无偏见的解剖。
在这项工作中,我们报道了一种新的方法RH-seq3的技术基础,用于对物种间特征变异的遗传基础进行基因组尺度调查。这种方法是互惠性异形测试4,5的大规模平行版本,它最初被设想为一种评估两个基因不同背景之间等位基因差异的表型效应的方法。特定位点 (图 1A)在这个方案中,两个不同的个体首先交配形成一个杂交,其中一半的基因组来自各自的父母。在此背景中,将生成多个菌株,每个菌株包含每个父位点的中断或删除副本。这些菌株是双重体,因为它们在基因组中无处不在,除了在兴趣点,它们被认为是单倍体,并被称为互惠,因为每个只缺乏一个父母的等位基因,其剩余的等位基因派生自其他父级。通过比较这些互惠性窒息菌株的表型 , 可以得出结论 , 在纵的位点 DNA 序列变异是否有助于感兴趣的特征 , 因为在位点变异是互惠之间的唯一遗传差异赫米西戈特菌株。通过这种方式,在控制良好的实验设置中,物种之间的遗传差异与物种之间的表型差异是有可能的。迄今为止,该测试的应用一直在候选基因框架中,也就是说,假设已经具备,候选位点的自然变异可能会影响特征。
接下来,我们用酵母作为模型系统,为基因组尺度的互惠性全致度屏幕奠定了协议。我们的方法通过在物种之间产生可行的无菌F1杂交物,并使它们被转位子诱变,从而创造了血小生子突变体的基因组补充。我们汇集出麻囊,在基于测序的检测中测量其表型,并测试池中具有给定基因的两个父母等位基因的克隆之间的频率差异。结果是一个位点目录,物种之间的变异会影响感兴趣的特征。我们实施RH-seq工作流程,以阐明两个萌芽酵母物种,糖母细胞和S.悖论之间的热耐受性差异的遗传基础,这一物种在500万年前就发生了分歧。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-2 plasmid Gigaprep kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4204</td>
			<td>The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiOAc</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mg/mL Geneticin (G418)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52% polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1546547</td>
			<td>Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved LB liquid broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]</td>
			<td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco</td>
			<td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hiseq 2500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used for SE-150 reads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large shaking incubators with variable temperature settings</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB + carbenicillin agar plates (100 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorimeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q33240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 39&#176;C</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast fungal gDNA prep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750</td>
			<td>Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD + G418 agar plates (300 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis

现代遗传学的中心目标是了解野生生物在表型上是如何和为什么不同的。迄今为止,该领域已在很大程度上依靠链接和关联映射方法的强度,该方法从物种个体之间的交配中追踪DNA序列变异和表型在重组后代之间的关系。这些方法虽然强大,但并不适合生殖隔离物种之间的特征差异。在这里,我们描述了一种全基因组解剖自然特性变异的新方法,这种变异可以很容易地应用于不相容的物种。我们的战略,RH-seq,是一个全基因组的对内血吸血测试的实施。我们利用它来识别导致酵母糖菌相对于其姐妹物种S.RH-seq利用转轴龙诱变来创建一个互惠血吸体池,然后通过高通量测序通过高温竞争进行跟踪。我们这里介绍的RH-seq工作流程提供了一种严谨、无偏见的方式来解剖萌芽酵母包层中的古老、复杂的特征,并告诫需要资源密集型深度测序,以确保基因图谱的基因组覆盖。随着测序成本的降低,这种方法为真核生物的未来应用带来了巨大的希望。

我们交配S.cerevisae和S.paradoxus形成无菌杂交,我们进行转泊。每个诱变克隆都是血吸虫,一种双倍体杂交,其中一个基因的等位基因被打乱(图1A,图2)。我们在39°C下通过生长来相互竞争,在28°C(图1B)的单独实验中,我们从每种培养物中分离出DNA。为了报告每个半球体的适应性,我们通过批量测序对丰度进行了量化,?...

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Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

通过全基因组互惠性分析,对糖母菌菌种间热耐性差异的遗传图谱

通过测序(RH-seq)的互惠血性是绘制物种间特征差异遗传基础的有力新方法。血吸血池由转位子诱变产生,其适应性通过高全测序的竞争性增长进行跟踪。对结果数据的分析可确定特征背后的基因。

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

我们的方法是首次能够解剖物种之间基因组范围而不是物种内特征差异的遗传基础。该技术的主要优点是高通量、高分辨率、广泛适用。要开始此过程，请从零下 80 摄氏度的储存中检索 JR507 冰柜库存应变，并条纹到 YPD 阿加板上的单菌落。在26摄氏度下孵育两天或直到菌落出现。然后在250毫升的玻璃瓶中接种100毫升的液体YPD，用JR507的单组，在28摄氏度下孵育，同时在200 RPM下摇晃24小时，或直到达到静止相。第二天，测量一夜文化的 od600 。背部用新鲜液体 YPD 稀释一些隔夜培养，放入新的一升烧瓶中，以零点 2 的 od600 和 500 毫升的体积创建新的培养。重复此过程三次，以零点二的 od600 总共创建四个区域性，对所有新区域性使用相同的隔夜区域性。在28摄氏度下孵育所有培养物6小时，同时在200 RPM下摇晃。在此之后，结合两个 500 毫升的区域性，创建一升文化。将剩余的两个 500 毫升培养物组合在一起，以创建第二个 1 升培养物。首先，将每升培养物分成20 50毫升的等分，每个分体在塑料锥形管中，总共40根管子。留出20根管子。将剩余的20个管子在1000次G下离心3分钟，以对酵母细胞进行颗粒。丢弃上流水，通过涡流将每个颗粒与25毫升的无菌水重新暂停。在 1000 次 G 下离心三分钟。丢弃上流水，通过涡流将每粒颗粒与五毫升 1X Tris-EDTA 零点一摩尔醋酸锂缓冲液重新暂停。在 1000 次 G 下离心三分钟。丢弃上流剂，再用五毫升 1X Tris-EDTA 零点一摩尔醋酸锂酯缓冲液通过涡旋重新暂停每个颗粒。在 1000 次 G 下离心三分钟。当细胞离心时，准备至少120毫升含有聚乙二醇、醋酸锂和三叶草-EDTA缓冲液的溶液。将此溶液存放在冰上。为了准备血浆DNA的转化，首先在100摄氏度下煮沸四毫升鲑鱼精子DNA5分钟。在此之后，立即在冰上冷却五分钟。将 20 毫升 pJR487 混合，浓度为每毫升 538 毫微克，与 4 毫升冷鲑鱼精子 DNA 混合。将这种混合物放在冰上，直到准备好使用。接下来，在每个细胞颗粒上加入600微升的血浆和精子DNA混合物。在每个颗粒中加入三毫升PEG醋酸锂TE混合物。我们通过上下移液，然后涡流暂停。在室温下孵育管子10分钟。然后在39摄氏度的水浴中加热每个管，26分钟，确保每管每隔几分钟倒一次。将管子以1000倍G离心三分钟。丢弃上流剂，通过涡旋将每个颗粒在 10 毫升 YPD 中重新暂停。在此之后，将所有 20 根管子组合成一个新的玻璃瓶。将433点四毫升液体YPD加入新的一升玻璃瓶中。然后将66点6毫升的细胞转移到烧瓶中。重复此传输过程两次，以使用转换单元格的整个体积。然后测量每个新的 500 毫升培养的 od600。在28摄氏度下孵育所有三种培养物两小时，同时在200 RPM下摇晃。在此之后，将每微升G418的零点5毫升300毫克添加到每个烧瓶中，最终浓度为每毫升300微克。将烧瓶以 28 摄氏度和 200 RPM 的速度将烧瓶返回振动孵化器。使用剩余的 20 个锥形管重复整个过程。此时，应该有六个一升的烧瓶，每个含有500毫升的细胞，并添加了G418。在28摄氏度下孵育所有6个烧瓶，以200 RPM的速度摇晃约两天，或直到每个烧瓶中达到约2点3的od600。然后，将所有六个烧瓶组合在一起，创建单一区域性。使用此组合培养剂，将两个新的一升烧瓶接种 500 毫升 YPD 和 G418 的，接种零点二的 od600。在28摄氏度下孵育这些新培养，在200 RPM下摇晃，直到达到约2点2的od600。在此之后，将两种区域性合并为一种区域性，并测量组合区域性的 od600。以1000倍G离心25毫升，三分钟。计算文本协议中概述的 25 毫升中的总 od600 单位的细胞数。丢弃上一提液，将细胞重新悬浮在足够的水中，以每毫升一点八五的 od600 产生细胞悬浮液。使用玻璃珠，将一毫升重新暂停的细胞盘到 12 个带 5-FOA 的大型方形合成阿加板中。在28摄氏度下孵育每个盘子一至两天，或直到盘子上形成草坪。接下来，使用小无菌的尖叫声将细胞从盘子的一半刮掉，放入含有35毫升无菌水的管子中。对其余六个板重复此过程，导致水中有两管细胞。将悬浮液组合成一个烧瓶，测量悬浮液的 od600，用水作为空白。用水调节细胞浓度，直到 od600 达到每毫升 44 点。接下来，准备细胞的冰柜储存，并储存在零下80摄氏度，如文本协议中所述。在这项研究中，S.Cerevisiae和S.Paradoxus交配形成一种无菌杂交体，在突变时被转置。每个突变的克隆都是一个下卵体，一种二倍体杂交，其中一个基因的一个等位基因被破坏。在高温下，细胞体被竞争，DNA从每种培养中分离。DNA被修复并连接到适配器，转子与基因组之间的交汇点被放大，使用转子特异性底转和适配器特异性底转。计算从安培孔读取计数的批量测序计数，报告克隆在种群中的适合性。随着这种测序的结果，给定基因的中分细胞丰度可以在两类下部子之间的两个温度下进行比较。只有 S.Cerevisiae 等位基因的克隆是野生类型和功能性的，克隆仅依赖于 S.Paradoxus 等位基因。在这个具有代表性的实施中，在八个内务基因上检测到强信号。在每种情况下，在混合的S.Cerevisiae等位基因中插入转子，会损害高温下的生长。这些低 si 代表热耐莉特性的候选决定因素， 将 S. Cerevisiae 与 S. Paradoxus 区别。现在，我们已经完成了这个实验，我们可以解剖这些物种之间的其他特征，如冷或盐耐受性。

Research

JoVE Journal

Genetics

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科研

遗传学

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