Name: genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis at JoVE.com

Wij danken J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin en J. Skerker voor hun bijdragen aan de oorspronkelijke studie, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, en L. Oltrogge voor technische bijstand, D. Savage voor zijn vrijgevigheid met microscopie bronnen, en B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson, en A. Sasikumar voor discussies; We danken ook J. dueber (Department of Bioengineering, UC Berkeley) voor de PiggyBac plasmide. Dit werk werd ondersteund door R01 GM120430-a1 en door communautaire sequencing project 1460 aan RBB op het Amerikaanse ministerie van energie joint Genome Institute, een DOE kantoor van Science user facility. Het werk van deze laatste werd gesteund door het kantoor van de wetenschap van het Amerikaanse ministerie van energie onder contract nr. DE-AC02-05CH11231.

1. bereiding van het piggyBac-bevattende plasmide voor transformatie
<ol><li>Streak uit naar enkele kolonies de E. coli stam harkotteren plasmide pJR487 op een lb + carbenicillin agar plaat. Incuberen gedurende 1 nacht bij 37 °C of totdat er enkele kolonies verschijnen. Opmerking: een beschrijving van hoe plasmide pJR487 werd gekloond, vindt u in ons vorige werk3.</li>
	<li>Inoculeren 1 L LB + carbenicillin op 100 μg/mL met een enkele kolonie E. coli met pJR487 in een glaz...

<ol>
	<li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits:+successes+and+pitfalls.">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li><li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+species+differences.">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li><li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance.">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li><li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test.">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li><li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast.">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li><li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics:+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus.">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li><li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons.">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li><li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae.">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li></ol>

De voordelen van de RH-SEQ ten opzichte van eerdere statistische-genetische methoden zijn meerdere malen. In tegenstelling tot de koppeling-en associatie analyse, biedt de RH-SEQ een single-gen mapping-resolutie; als zodanig, het zal waarschijnlijk van belangrijk nut zijn, zelfs in studies van eigenschap variatie over individuen van een bepaalde soort, evenals interspecifieke verschillen. Ook, eerdere pogingen tot genoom-brede wederzijdse hemizygosity analyse gebruikt verzamelingen van gendeletie mutanten, waarvan sommig...

Sinds het begin van het veld, het is een belangrijker doel in de genetica om te begrijpen van de mechanistische basis van variatie tussen wilde individuen. Als we loci in kaart plaatsen die aan een kenmerk van belang zijn gekoppeld, kunnen de opkomende genen onmiddellijk worden gebruikt als doelstellingen voor diagnostiek en drugs, en kunnen ze licht werpen op de principes van evolutie. De industriestandaard in de richting van dit doel is om te testen op een relatie tussen genotype en fenotype over een populatie via koppeling of vereniging1. Krachtig als deze benaderingen zijn, ze hebben een belangrijke beperking-ze vertrouwen op grote panelen van recombinant nageslacht van kruisen tussen interfertile individuen. Ze zijn niet van toepassing in de studie van soorten die niet kunnen paren om in de eerste plaats nakomelingen te vormen. Als zodanig heeft het veld weinig capaciteit voor onbevooroordeelde dissectie van eigenschap-verschillen tussen reproductief geïsoleerde soorten2.
In dit werk rapporteren we de technische onderbouwing van een nieuwe methode, RH-SEQ3, voor genoom onderzoeken van de genetische basis van eigenschap variatie tussen soorten. Deze aanpak is een massaal parallelle versie van de wederzijdse hemizygote test4,5, die eerst werd bedacht als een manier om de fenotypische effecten van allel verschillen tussen twee genetisch verschillende achtergronden te evalueren op een bepaalde Locus (Figuur 1a). In deze regeling worden de twee divergente personen voor het eerst tot een hybride, waarvan de helft afkomstig is van elk van de respectieve ouders. In deze achtergrond worden meerdere stammen gegenereerd, elk met een onderbroken of verwijderde kopie van het allel van elke ouder van de Locus. Deze stammen zijn hemizygoot, omdat ze overal in het genoom diploïde blijven, behalve op de Locus van belang, waar ze worden beschouwd als haploïde, en worden aangeduid als wederkerig omdat ze slechts één ouder allel missen, met zijn overgebleven allel afgeleid van de andere ouder. Door de fenotypes van deze wederzijdse hemizygote stammen te vergelijken, kan men concluderen of DNA sequentie varianten op de gemanipuleerde Locus bijdragen aan de eigenschap van belang, aangezien varianten op de Locus het enige genetische verschil zijn tussen de wederkerige hemizygote stammen. Op deze manier is het mogelijk om genetische verschillen tussen soorten te koppelen aan een fenotypische verschil tussen hen in een goed gecontroleerde experimentele opstelling. Tot op heden zijn de toepassingen van deze test in een kandidaat-gen-kader geweest — dat wil doen, gevallen waarin de hypothese al in de hand is dat een natuurlijke variatie op een kandidaat-locus van invloed kan zijn op een eigenschap.
In wat volgt, we leggen het protocol voor een genoom schaal wederzijdse hemizygosity scherm, met behulp van gist als een modelsysteem. Onze methode creëert een genomische aanvulling van hemizygote mutanten door levensvatbare, steriele F1-hybriden te genereren tussen soorten en ze te onderwerpen aan transposon-mutagenese. We pool de hemizygoten, meten hun fenotypes in sequentiegebaseerde testen en testen op verschillen in frequentie tussen de klonen van het zwembad met de allelen van een bepaald gen van de twee ouders. Het resultaat is een catalogus van loci waarbij varianten tussen soorten invloed hebben op de eigenschap van belang. We implementeren de RH-SEQ workflow om te verhelderen de genetische basis van thermotolerance verschillen tussen twee ontluikende gist soorten, Saccharomyces cerevisiae en S. paradoxus, die omgeleid ~ 5.000.000 jaar geleden6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-2 plasmid Gigaprep kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4204</td>
			<td>The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiOAc</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mg/mL Geneticin (G418)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52% polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1546547</td>
			<td>Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved LB liquid broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]</td>
			<td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco</td>
			<td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hiseq 2500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used for SE-150 reads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large shaking incubators with variable temperature settings</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB + carbenicillin agar plates (100 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorimeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q33240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 39&#176;C</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast fungal gDNA prep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750</td>
			<td>Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD + G418 agar plates (300 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis

Een centraal doel van de moderne genetica is om te begrijpen hoe en waarom organismen in het wild verschillen in fenotype. Tot op heden is het veld grotendeels uitgebreid op de sterkte van koppelings-en koppelingsmethoden, die de relatie tussen DNA-sequentie varianten en fenotype over recombinant nageslacht van paringen tussen individuen van een soort traceren. Deze benaderingen, hoewel krachtig, zijn niet goed geschikt voor eigenschap verschillen tussen reproductief geïsoleerde soorten. Hier beschrijven we een nieuwe methode voor genoom-brede dissectie van natuurlijke eigenschap variatie die gemakkelijk kan worden toegepast op onverenigbare soorten. Onze strategie, RH-seq, is een Genome-brede implementatie van de wederzijdse hemizygote-test. We hebben het aangewend om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de opvallende hoge temperatuur groei van de gist Saccharomyces cerevisiae ten opzichte van zijn zuster soorten S. paradoxus. RH-SEQ maakt gebruik van transposon-mutagenese om een pool van wederzijdse hemizygoten te creëren, die vervolgens worden gevolgd door een hoge-temperatuur competitie via een hoge doorvoer volgorde. Onze RH-SEQ workflow zoals hier uiteengezet biedt een rigoureuze, onbevooroordeelde manier om oude, complexe eigenschappen in de ontluikende gist clade te ontleden, met het voorbehoud dat resource-intensieve Deep sequencing nodig is om genomische dekking voor genetische mapping te garanderen. Als sequencing kosten dalen, deze aanpak houdt grote belofte voor toekomstig gebruik over eukaryoten.

We gedekt s. cerevisiae en s. paradoxus om een steriele hybride te vormen, die we aan transposon mutagenese onderworpen hebben. Elke gemutageniseerde kloon was een hemizygote, een diploïde hybride waarin één allel van één gen verstoord is (Figuur 1a, Figuur 2). We namen de hemizygoten tegen elkaar op door groei bij 39 °C en, in een afzonderlijk experiment als controle, op 28 °C (Figuur 1b), ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis at JoVE.com

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

Wederzijdse hemizygosity via sequencing (RH-SEQ) is een krachtige nieuwe methode om de genetische basis van een eigenschap verschil tussen soorten in kaart te worden. Pools van hemizygotes worden gegenereerd door transposon mutagenese en hun fitheid wordt bijgehouden door concurrerende groei met behulp van High-through sequencing. Analyse van de resulterende gegevens wijst genen aan die aan de eigenschap ten grondslag liggen.

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Onze methode is een van de eersten die in staat zijn om de genetische grondslagen van trait verschillen te ontleden op een genoom-brede schaal tussen soorten in plaats van binnen soorten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge doorvoer, hoge resolutie, en op grote schaal toepasbaar. Om te beginnen met deze procedure, haal de JR507 vriezer voorraad stam uit de opslag op min 80 graden Celsius, en streep het uit naar enkele kolonies op een YPD agar plaat.Broed op 26 graden Celsius gedurende twee dagen of tot er kolonies verschijnen. Dan inenting 100 milliliter vloeibare YPD in een 250 milliliter glazen kolf met een enkele kolonie van JR507, en incubeer bij 28 graden Celsius tijdens het schudden op 200 RPM gedurende 24 uur of tot stationaire fase is bereikt. De volgende dag, meet de od600 van de nachtelijke cultuur.Terug verdunnen een deel van de nachtelijke cultuur met verse vloeibare YPD in een nieuwe een liter kolf om een nieuwe cultuur te creëren met een od600 van nul punt twee en een volume van 500 milliliter. Herhaal dit proces nog drie keer om een totaal van vier culturen te creëren met een od600 van nul punt twee, met dezelfde nachtcultuur voor alle nieuwe culturen. Incubeer alle culturen op 28 graden Celsius gedurende zes uur tijdens het schudden op 200 RPM.Combineer hierna twee van de 500 milliliter culturen om een een liter cultuur te creëren. Combineer de resterende twee 500 milliliter culturen om een tweede een liter cultuur te creëren. Splits elk van de een liter culturen in 20 50 milliliter aliquots elk in een plastic conische buis voor een totaal van 40 buizen.Zet 20 buizen opzij. Centrifugeren de resterende 20 buizen op 1000 keer G gedurende drie minuten om de gistcellen pellet. Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet met 25 milliliter steriel water door vortexing.Centrifuge op 1000 keer G gedurende drie minuten. Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet met vijf milliliter 1X Tris-EDTA nul punt een Molar lithiumacetaat buffer door vortexing. Centrifuge op 1000 keer G gedurende drie minuten.Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet opnieuw met vijf milliliter 1X Tris-EDTA nul punt een Molar lithiumacetaat buffer door vortexing. Centrifuge op 1000 keer G gedurende drie minuten. Terwijl de cellen centrifugeren, bereid ten minste 120 milliliter van een oplossing met polyethyleenglycol, lithiumacetaat en Tris-EDTA buffer.Bewaar deze oplossing op ijs. Om het plasma-DNA voor te bereiden op transformatie, kook eerst vier milliliter zalm sperma DNA op 100 graden Celsius gedurende vijf minuten. Daarna koel je het onmiddellijk vijf minuten af op het ijs.Meng 20 milliliter pJR487 bij een concentratie van 538 nanogram per milliliter met vier milliliter van het koude zalmsperma DNA. Houd dit mengsel op ijs tot klaar voor gebruik. Voeg vervolgens 600 microliter van het plasma- en sperma-DNA-mengsel toe bovenop elke celpellet.Voeg drie milliliter van het PEG lithium acetaat TE mengsel toe aan elke pellet. We hangen op door op en neer te pipetten en dan te wervelen. Broed de buizen 10 minuten op kamertemperatuur.Vervolgens warmte schok elke buis in een waterbad op 39 graden Celsius gedurende 26 minuten, zorg ervoor dat elke buis om te keren om de paar minuten. Centrifugeren de buizen op 1000 keer G gedurende drie minuten. Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet in 10 milliliter van YPD door vortexing.Combineer hierna alle 20 buizen in een nieuwe glazen kolf. Voeg 433 punt vier milliliter vloeibare YPD in een nieuwe een liter glazen kolf. Breng vervolgens 66 punt zes milliliter cellen in de kolf.Herhaal dit overdrachtsproces nog twee keer om het volledige volume van getransformeerde cellen te gebruiken. Meet dan de od600 van elke nieuwe 500 milliliter cultuur. Incubeer alle drie culturen op 28 graden Celsius gedurende twee uur tijdens het schudden op 200 RPM.Voeg hierna nulpunt vijf milliliter van 300 milligram per microliter G418 toe aan elk van de kolven tot een uiteindelijke concentratie van 300 microgram per milliliter. Breng de kolven terug naar de schuddende couveuse bij 28 graden Celsius en 200 RPM. Herhaal dit hele proces met de resterende 20 conische buizen.Op dit punt moeten er zes flessen van één liter zijn, elk met 500 milliliter cellen met G418 toegevoegd. Incubeer alle zes kolven bij 28 graden Celsius met schudden op 200 RPM gedurende ongeveer twee dagen of tot een od600 van ongeveer twee punt drie is bereikt in elke kolf. Combineer vervolgens alle zes de kolven samen om één cultuur te creëren.Gebruik deze gecombineerde cultuur om twee nieuwe een liter kolven met 500 milliliter YPD en G418 inenten tot een od600 van nul punt twee. Broed deze nieuwe culturen 's nachts bij 28 graden Celsius met schudden op 200 RPM totdat het een od600 van ongeveer twee punt twee bereikt. Combineer hierna beide culturen tot één cultuur en meet de od600 van de gecombineerde cultuur.Centrifuge 25 milliliter van deze cultuur op 1000 keer G gedurende drie minuten. Bereken het aantal totale od600-eenheden cellen in de 25 milliliter zoals beschreven in het tekstprotocol. Gooi de supernatant, en resuspend de cellen in genoeg water om een cel suspensie te creëren met een od600 van een punt acht vijf per milliliter.Met behulp van glazen kralen, plaat een milliliter van geresuspended cellen op elk van 12 grote, vierkante complete synthetische agar platen met 5-FOA. Incubeer elke plaat op 28 graden Celsius gedurende een tot twee dagen, of totdat een gazon vormen op de plaat. Gebruik vervolgens kleine steriele squeegees om de cellen van de helft van de plaat af te schrapen, en in een buis, met 35 milliliter steriel water.Herhaal dit proces voor de resterende zes platen, wat resulteert in twee buisjes cellen in water. Combineer de celsuspensies in een enkele kolf en meet de od600 van de suspensie, met behulp van water als een blanco. Gebruik water om de celconcentratie aan te passen tot de od600 44 punt vier per milliliter bereikt.Bereid vervolgens de vriesvoorraden cellen voor en bewaar ze bij min 80 graden Celsius, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie worden S.Cerevisiae en S.Paradoxus gekoppeld tot een steriele hybride, die wordt omgezet op mutagenesis. Elke gemutageniseerde kloon is een hemizygote, een diploïde hybride waarin een allel van één gen wordt verstoord.De hemizygotes worden op hoge temperatuur geconcurreerd en het DNA is geïsoleerd van elke cultuur. Het DNA is shirred en ligated aan adapters, en de verbinding tussen de transposon en het genoom wordt versterkt met een transposon-specifieke primer en een adapter-specifieke primer. Het optellen van bulk sequencing lezen telt van de amplicon, verslag van de geschiktheid van een kloon in de bevolking.Met de resultaten in de hand van deze volgorde, de hemizygote overvloeds voor een bepaald gen, kan worden vergeleken bij de twee temperaturen tussen twee klassen van hemizygotes. Klonen waar alleen de S.Cerevisiae allel was wild type en functioneel, en klonen alleen vertrouwen op de S.Paradoxus allel. Bij deze representatieve implementatie worden sterke signalen gedetecteerd bij acht huishoudgenen.In elk geval, transposon inserties in de S.Cerevisiae allel in de hybride, gecompromitteerd groei bij hoge temperatuur. Deze low-si vertegenwoordigde kandidaat determinanten van de thermotolerance eigenschap die S.Cerevisiae onderscheidt van S.Paradoxus. Nu we dit experiment hebben voltooid, kunnen we andere eigenschappen ontleden die verschillen tussen deze soorten, zoals koude of zouttolerantie.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetische manipulatie van een onconventionele Gist voor duurzame biobrandstoffen en biochemische Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bepalen van genoom-brede Transcript verval tarieven in delende en zwakke menselijke fibroblasten

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Bepaling van de waarschijnlijkheid van Variant pathogeniteit met behulp van aminozuur-niveau Signal-to-Noise analyse van genetische variatie

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...