Name: genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis at JoVE.com

. אנחנו מודים לג רואופ, ר. האקלי, אני. גריגוריה, א. ארקין וג סקלקר על תרומתם למחקר המקורי, פ. אלזבאן, א. פלאם, ג. גגלמן, ג'יי הונג, י. קים, מ. מOltrogge, ו-ל. לסיוע טכני, ד. סאבאג ' לנדיבות עם מיקרוסקופ משאבים, ו-B. Blackman, ס. קוראדטי, א. פלמהולץ, נ' גואצ'י, ד. כורטלנד, ס. נלסון ו-א. ססיקומאר לדיונים; כמו כן, אנו מודים לג דובר (המחלקה לביוהנדסה, אוניברסיטת ברקלי) עבור הפלאבאק. עבודה זו נתמכת על ידי R01 GM120430-A1 ועל ידי הקהילה רצף הפרויקט 1460 RBB בארה ב. המחלקה לאנרגיה משותפת מכון הגנום, משרד DOE של מתקן משתמש המדע. העבודה שנערכה על ידי האחרונה נתמכת על ידי משרד המדע של משרד האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה לא. דה-AC02-05CH11231.

1. הכנת הפלאבאק המכיל את הפלמיד לטרנספורמציה
<ol><li>פס החוצה מושבות יחיד את זן E. coli מחסה פלpJR487 באמצע ליברות + carbenicillin אגר צלחת. מודטה ללילה אחד ב 37 ° c או עד מושבות יחיד להופיע. הערה: תיאור האופן בו ניתן למצוא את הpJR487 בעבודה הקודמת3.</li>
	<li>מחסן 1 L של LB + carbenicillin ב 100 μg/mL עם מושבה אח...

<ol>
	<li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits:+successes+and+pitfalls.">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li><li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+species+differences.">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li><li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance.">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li><li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test.">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li><li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast.">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li><li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics:+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus.">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li><li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons.">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li><li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae.">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li></ol>

היתרונות של RH-seq על פני שיטות סטטיסטיות-גנטיות קודמות הן מספר קיפול. בניגוד לניתוח ההצמדה וההתאגדות, הטיפול ב-RH-seq מעניק רזולוציית מיפוי של גנים בודדים; ככזה, סביר להניח שהיא תהיה בעלת תועלת משמעותית גם במחקרים של וריאציה של תכונה על פני אנשים ממין נתון, כמו גם הבדלים בין-ספציפיים. כמו כן, נסי...

מאז השחר של השדה, זה היה מטרה מעולה בגנטיקה כדי להבין את הבסיס המכונה של וריאציה על אנשים פראיים. כאשר אנו ממפים את הבית בבסיס תכונה של עניין, הגנים מתהווה יכול להיות שימוש מיידי כמטרות אבחון ותרופות, והוא יכול לשפוך אור על עקרונות האבולוציה. תקן התעשייה לקראת המטרה הזאת הוא לבחון את הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפ באמצעות הצמדה או אסוציאציה1. רב עוצמה כמו גישות אלה, יש להם מגבלה אחת מפתח – הם סומכים על פאנלים גדולים של צאצאי רקומביננטי מן הצלבים בין אנשים הפרעות. הם אינם בשימוש בחקר המינים שאינם יכולים להזדווג ליצור צאצאים מלכתחילה. ככזה, לשדה יש יכולת מועטה לניתוח משוחד של הבדלים בין מינים מבודדים מחדש של2.
בעבודה זו אנו מדווחים על התחתון הטכני של שיטה חדשה, RH-seq3, עבור סקרים הגנום בקנה מידה של הבסיס הגנטי של וריאציה תכונה בין מינים. גישה זו היא גרסה מקבילה בנפט של הבחינה הדדית מבחן4,5, אשר היה לראשונה הגה כדרך להעריך את ההשפעות פנוטימית של הבדלים allelic בין שני רקעים שונים גנטית ב לוקוס מסוים (איור 1a). בערכה זו, שני האנשים מפוצלים הם הראשונים ליצור היברידית, מחצית הגנום אשר מגיע מכל אחד ההורים בהתאמה. ברקע זה, זנים מרובים מופקים, כל אחד המכיל עותק קטוע או נמחק של כל ההורה של כל הורה של לוקוס. זנים אלה הם hemizygous מאז הם נשארים דיפלואידי בכל מקום בגנום למעט במיקום של עניין, שם הם נחשבים haploid, והם מכונים הדדית מאז כל אחד חסר רק אלל של ההורה אחד, עם אלל הנותרים נגזר ה הורה אחר. על-ידי השוואת הפנוטיפים של זנים אלה he, הדדיים הדדית, אפשר להסיק אם משתנים רצף ה-DNA על מקום מניפולציות לתרום את התכונה של עניין, מאז המשתנים לוקוס הם ההבדל הגנטי היחיד בין הדדית זנים המיזוליציטים. בדרך זו, ניתן לקשר בין הבדלים גנטיים בין מינים לבין הבדל פנוטיוני ביניהם בכיוונון ניסיוני מבוקר. עד כה היישומים של בדיקה זו היו במסגרת מועמד-גן-כלומר, מקרים בהם ההשערה כבר בהישג יד כי וריאציה טבעית על לוקוס מועמד עשוי להשפיע על תכונה.
במה שלהלן, אנו מניחים את הפרוטוקול למסך הופכי בקנה מידה של הגנום, באמצעות שמרים כמערכת מודל. השיטה שלנו יוצרת השלמה גנומית של מוטציות heמיזרגוט, על ידי יצירת מוטאנטים של F1 כלאיים החיים בין המינים והוא מרכיב אותם לטרנספסון. אנחנו מאגר heמיזוליטיס, למדוד פנוטיפים שלהם לפי רצף מבוסס, ולבדוק הבדלים בתדר בין שיבוטים של הבריכה הנושאת שני ההורים ' אללים של גן נתון. התוצאה היא קטלוג של הבית שבו משתנים בין המינים משפיעים על תכונת הריבית. אנו מיישמים את זרימת העבודה RH-seq כדי להבהיר את הבסיס הגנטי של הבדלים התרמותרמיים בין שני מינים שמרים הנצה, סכביסים cerevisiae ס ו -S. paradoxus, אשר התפצל ~ 5,000,000 לפני שנה6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-2 plasmid Gigaprep kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4204</td>
			<td>The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiOAc</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mg/mL Geneticin (G418)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52% polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1546547</td>
			<td>Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved LB liquid broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]</td>
			<td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco</td>
			<td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hiseq 2500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used for SE-150 reads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large shaking incubators with variable temperature settings</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB + carbenicillin agar plates (100 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorimeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q33240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 39&#176;C</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast fungal gDNA prep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750</td>
			<td>Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD + G418 agar plates (300 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis

מטרה מרכזית של גנטיקה מודרנית היא להבין כיצד ומדוע אורגניזמים בטבע שונים ב פנוטיפים. עד היום, השדה התקדם בעיקר על כוחה של שיטות מיפוי הצמדה ושיוך, אשר מעקב אחר הקשר בין משתנים רצף ה-DNA ו לפנוטיפ באמצעות רקומביננטי צאצאים מתוך מצות בין אנשים של מין. גישות אלה, אם כי חזקות, אינן מתאימות באופן מתאים להבדלים בין מינים מבודדים מחדש. כאן אנו מתארים שיטה חדשה לניתוח הגנום-רחב של וריאציה תכונה טבעית שניתן להחיל בקלות על מינים לא תואמים. האסטרטגיה שלנו, RH-seq, היא יישום הגנום הרחב של מבחן ההופכי הופכי. אנו לרתום אותו כדי לזהות את הגנים האחראים על הצמיחה המרשימה בטמפרטורה גבוהה של שמרים סכביסים cerevisiae ס ביחס paradoxus המינים של אחותה . RH-seq מנצל טרנספסון מוטאנסיס כדי ליצור בריכה של הדדיות הדדית, אשר מסומנים לאחר מכן באמצעות תחרות בטמפרטורות גבוהות באמצעות רצף התפוקה הגבוהה. העבודה שלנו RH-seq כפי שהונחו כאן מספק קפדנית, דרך משוחדת כדי לנתח העתיקה, תכונות מורכבות ב שמרים לבשלה, עם האזהרה כי ברצף אינטנסיבי משאבים מרחוק נדרש כדי להבטיח כיסוי גנומית עבור מיפוי גנטי. כאשר העלויות ברצף ירידה, גישה זו מחזיקה הבטחה גדולה לשימוש עתידי על פני eukaryotes.

מיזלנו את ס. cerevisiae ס ו- s paradoxus ליצור היברידית סטרילית, אשר אנו נתונים לטרנספסון מוטגנזה. כל שיבוט מוטגני היה he, היברידית דיפלואידי שבו אחד אלל של גן אחד מופרת (איור 1a, איור 2). היינו מתמודדים נגד השני באמצעות גידול ב39 ° c ובניסוי נפרד כפקד, ב -28 ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis at JoVE.com

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

השיטה שלנו היא אחת הראשונות להיות מסוגל לנתח את הבסיסים הגנטיים של הבדלי תכונות בקנה מידה גנום רחב בין מינים במקום בתוך מינים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שזה תפוקה גבוהה, רזולוציה גבוהה, וישים נרחב. כדי להתחיל בהליך זה, לאחזר את זן מלאי המקפיא JR507 מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולפס אותו למושבות בודדות על צלחת אגר YPD.דגירה ב 26 מעלות צלזיוס במשך יומיים או עד מושבות להופיע. ואז לחסן 100 מיליליטר של YPD נוזלי בבקבוק זכוכית 250 מיליליטר עם מושבה אחת של JR507, ו דגירה ב 28 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 200 סל"ד במשך 24 שעות או עד שלב נייח הוא הגיע. למחרת, למדוד את od600 של תרבות הלילה.בחזרה לדלל חלק מתרבות הלילה עם YPD נוזלי טרי לתוך בקבוק ליטר אחד חדש כדי ליצור תרבות חדשה עם od600 של נקודת אפס שתיים ונפח של 500 מיליליטר. חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות כדי ליצור סך של ארבע תרבויות עם od600 של נקודת אפס שתיים, באמצעות אותה תרבות לילה עבור כל התרבויות החדשות. הדגירה כל התרבויות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שש שעות תוך רועד ב 200 סל"ד.לאחר מכן, לשלב שתיים מתוך 500 תרבויות מיליליטר כדי ליצור תרבות ליטר אחד. שלב את שתי התרבויות הנותרות של 500 מיליליטר כדי ליצור תרבות שנייה של ליטר אחד. ראשית, לפצל כל אחת מתרבות ליטר אחד לתוך 20 50 aliquots מיליליטר כל אחד בצינור חרוט פלסטיק עבור סך של 40 צינורות.מניחים בצד 20 צינורות. צנטריפוגה הנותרים 20 צינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות כדי גלולה את תאי השמרים. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש כל גלולה עם 25 מיליליטר של מים סטריליים על ידי מערבולת.צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. השלך את העל-טבעי, ולחץ מחדש על כל גלולה עם חמישה מיליליטר של נקודת האפס 1X טריס-EDTA אחד מאגר ליתיום אצטט Molar על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות.השלך את העל-טבעי, ולחץ שוב על כל גלולה עם חמישה מיליליטר 1X טריס-EDTA נקודת אפס אחת מאגר ליתיום אצטט Molar על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. בעוד התאים הם צנטריפוגה, להכין לפחות 120 מיליליטר של פתרון המכיל פוליאתילן גליקול, ליתיום אצטט, וחוצץ טריס-EDTA.אחסן את הפתרון הזה בקרח. כדי להכין את ה-DNA פלזמה לשינוי, תחילה להרתיח ארבעה מיליליטר של DNA זרע סלמון ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, מיד לקרר אותו על קרח במשך חמש דקות.מערבבים 20 מיליליטר של pJR487 בריכוז של 538 ננוגרם למיליליטר עם ארבעה מיליליטר של DNA זרע סלמון קר. שמור את התערובת על הקרח עד מוכן לשימוש. לאחר מכן, להוסיף 600 microliters של תערובת DNA פלזמה וזרע על גבי כל גלולה התא.הוסף שלושה מיליליטר של תערובת ליתיום אצטט TE PEG לכל גלולה. אנחנו משהים על ידי צינור למעלה ולמטה ולאחר מכן מערבולת. דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.ואז חום לזעזע כל צינור באמבט מים ב 39 מעלות צלזיוס במשך 26 דקות, הקפדה להפוך כל צינור כל כמה דקות. צנטריפוגה הצינורות ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש כל גלולה ב-10 מיליליטר של YPD על-ידי מערבולת.לאחר מכן, לשלב את כל 20 צינורות לתוך בקבוק זכוכית חדש. הוסף 433 נקודה ארבעה מיליליטר של YPD נוזלי לתוך בקבוק זכוכית ליטר חדש. ואז להעביר 66 נקודה שישה מיליליטר של תאים לתוך הבקבוק.חזור על תהליך העברה זה פעמיים נוספות כדי להשתמש בכל אמצעי האחסון של תאים שעברו שינוי צורה. ואז למדוד את od600 של כל תרבות חדשה 500 מיליליטר. דגירה כל שלוש התרבויות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שעתיים תוך טלטול ב 200 סל"ד.לאחר מכן להוסיף נקודת אפס חמישה מיליליטר של 300 מיליגרם למיקרוליטר G418 לכל אחד מהבקבוקים לריכוז סופי של 300 מיקרוגרם למיליליטר. מחזירים את הבקבוקים לאנקובטור הרועד ב-28 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. חזור על כל התהליך הזה עם 20 צינורות חרוט הנותרים.בשלב זה, צריך להיות שישה בקבוקונים ליטר אחד, כל אחד מכיל 500 מיליליטר של תאים עם G418 הוסיף. הדגירה כל ששת הבקבוקים ב 28 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד במשך כיומיים או עד od600 של כשתי נקודות שלוש הוא הגיע בכל בקבוקון. לאחר מכן, לשלב את כל ששת flasks יחד כדי ליצור תרבות אחת.השתמש בתרבות משולבת זו כדי לחסן שני בקבוקונים חדשים של ליטר אחד עם 500 מיליליטר של YPD ו- G418 ל- od600 של נקודת אפס שתיים. הדגירה תרבויות חדשות אלה לילה ב 28 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד עד שהוא מגיע od600 של כשתי נקודות שתיים. לאחר מכן, לשלב את שתי התרבויות לתרבות אחת, ולמדוד את od600 של התרבות המשולבת.צנטריפוגה 25 מיליליטר של תרבות זו ב 1000 פעמים G במשך שלוש דקות. חשב את מספר יחידות התאים הכוללות של od600 ב- 25 מיליליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים במספיק מים כדי ליצור השעיית תא עם od600 של נקודה אחת שמונה חמש למיליליטר.באמצעות חמוזי זכוכית, צלחת מיליליטר אחד של תאים resuspended על כל אחד 12 גדול, מרובע להשלים צלחות אגר סינתטי עם 5-FOA. דגירה כל צלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך יום עד יומיים, או עד מדשאה נוצרת על הצלחת. לאחר מכן, השתמש חריקות סטריליות קטנות כדי לגרד את התאים של מחצית הצלחת, לתוך צינור, המכיל 35 מיליליטר של מים סטריליים.חזור על תהליך זה עבור ששת הלוחות הנותרים, וכתוצאה מכך שני צינורות של תאים במים. שלב את מתלי התא לתוך בקבוקון יחיד, ולמדוד את od600 של ההשעיה, באמצעות מים כמו ריק. השתמש במים כדי להתאים את ריכוז התא עד od600 מגיע 44 נקודה ארבע למיליליטר.לאחר מכן, הכינו מלאי תאים במקפיא ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, S.Cerevisiae ו S.Paradoxus הם mated כדי ליצור היברידית סטרילית, אשר נתון transpose על mutagenesis. כל שיבוט מוטגן הוא המיזיגוט, הכלאה דיפלואידית שבה אלל אחד של גן אחד משובש.ההמיזיגוטים מתחרים בטמפרטורה גבוהה, והדנ"א מבודד מכל תרבות. הדנ"א מומר ומ וקשוב במתאמים, והצומת בין הטרנספוזון לגנום מוגבר עם פריימר ספציפי לטרנספוזון ו פריימר ספציפי למתאם. ספירת רצף בתפזורת ספירת קריאה מן האמפליקון, לדווח על הכושר של שיבוט באוכלוסייה.עם התוצאות ביד מן רצף זה, שפע hemizygote עבור גן נתון, ניתן להשוות בשתי הטמפרטורות בין שתי מחלקות של hemizygotes. שיבוטים שבהם רק ה-S.Cerevisiae allele היה פראי ופונקציונלי, ושיבוטים הסתמכו רק על אלל ס. פרדוקסוס. ביישום מייצג זה, אותות חזקים מזוהים בשמונה גנים של משק בית.בכל מקרה, הכנסות טרנספוזון ב- S.Cerevisiae allele בהיברידית, צמיחה בסכנה בטמפרטורה גבוהה. אלה מיוצגים נמוך si דטרמיננטים מועמדים של התכונה thermotolerance המבדיל S.Cerevisiae מ S.Paradoxus. עכשיו שהשלמנו את הניסוי הזה, אנחנו יכולים לנתח תכונות אחרות השונות בין המינים האלה, כמו סובלנות קרה או מלח.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

קביעת הסבירות של Variant פתוגניות באמצעות חומצת אמינו ברמת ניתוח אות לרעש של וריאציה גנטית

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...