Name: genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00
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Ringraziamo J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin e J. Skerker per il loro contributo allo studio originale, F. Al'aben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, e L. Oltrogge per l'assistenza tecnica, D. Savage per la sua generosità con la microscopia risorse, e B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson, e A. Sasikumar per le discussioni; ringraziamo anche J. Dueber (Dipartimento di Bioingegneria, UC Berkeley) per il plasmide PiggyBac. Questo lavoro è stato supportato da R01 GM120430-A1 e dal Community Sequencing Project 1460 a RBB presso il Department of Energy Joint Genome Institute degli Stati Uniti, un DOE Office of Science User Facility. Il lavoro condotto da quest'ultimo è stato sostenuto dall'Ufficio di Scienza del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti sotto contratto n. DE-AC02-05CH11231.

1. Preparazione del plasmide contenente piggyBac per la trasformazione
<ol><li>Streak fuori a singole colonie il ceppo E. coli che ospita pJR487 pJR487 su un piatto di agar Carbenicillin LB. Incubare per 1 notte a 37 gradi centigradi o fino a quando non appaiono singole colonie. NOTA: Una descrizione di come plasmidp è stato clonato può essere trovato nel nostro lavoro precedente3.</li>
	<li>Inoculare 1 L l di LB : carbenicillina a 100 g/mL con una singola colonia di E. coli</e...

<ol>
	<li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits:+successes+and+pitfalls.">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li><li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+species+differences.">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li><li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance.">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li><li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test.">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li><li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast.">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li><li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics:+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus.">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li><li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons.">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li><li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae.">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li></ol>

I vantaggi di RH-seq rispetto ai precedenti metodi statistico-genetici sono molteplici. A differenza del collegamento e dell'analisi delle associazioni, RH-seq offre la risoluzione della mappatura di un singolo gene; come tale, sarà probabilmente di notevole utilità anche negli studi di variazione dei tratti tra gli individui di una determinata specie, così come le differenze interspecifiche. Inoltre, i precedenti tentativi di analisi dell'emizigosità reciproca a livello di genoma hanno utilizzato raccolte di mutanti...

Fin dagli albori del campo, è stato un obiettivo primario nella genetica comprendere la base meccanicistica della variazione tra gli individui selvatici. Mentre tracciamo i loci alla base di un tratto di interesse, i geni emergenti possono essere di uso immediato come obiettivi per la diagnostica e la droga, e possono far luce sui principi dell'evoluzione. Lo standard di settore a tal fine è quello di verificare la necessità di una relazione tra genotipo e fenotipo tra una popolazione tramite collegamento o associazione1. Per quanto potenti siano questi approcci, hanno una limitazione fondamentale: si basano su grandi pannelli di progenie ricombinante provenienti da croci tra individui interfertili. Sono inutile nello studio di specie che non possono accoppiarsi per formare la progenie in primo luogo. Come tale, il campo ha avuto poca capacità di dissezione imparziale delle differenze di tratto tra le specie riproduttivamente isolate2.
In questo lavoro riportiamo le basi tecniche di un nuovo metodo, RH-seq3, per indagini su scala genomica della base genetica della variazione dei tratti tra le specie. Questo approccio è una versione massicciamente parallela del test reciproco dell'emizigote4,5, che è stato inizialmente concepito come un modo per valutare gli effetti fenotipici delle differenze alleliche tra due sfondi geneticamente distinti in un particolare locus (Figura 1A). In questo schema, i due individui divergenti vengono prima accoppiati per formare un ibrido, la metà del cui genoma proviene da ciascuno dei rispettivi genitori. In questo contesto, vengono generati più ceppi, ciascuno contenente una copia interrotta o eliminata dell'allele di ogni genitore del locus. Questi ceppi sono emiziosi in quanto rimangono diploidi ovunque nel genoma tranne che nel luogo di interesse, dove sono considerati aploidi, e sono indicati come reciproci poiché ognuno manca solo all'allele di un genitore, con il suo allele rimanente derivato dal altro genitore. Confrontando i fenotipi di questi ceppi emizigote reciproci, si può concludere se le varianti della sequenza del DNA al locus manipolato contribuiscono al tratto di interesse, poiché le varianti al locus sono l'unica differenza genetica tra il reciproco ceppi emizygote. In questo modo, è possibile collegare le differenze genetiche tra le specie a una differenza fenotipica tra di loro in una configurazione sperimentale ben controllata. Ad oggi le applicazioni di questo test sono state in un quadro candidato-gene, cioè i casi in cui l'ipotesi è già in corso che la variazione naturale in un locus candidato potrebbe avere un impatto su un tratto.
In quello che segue, stabiliamo il protocollo per uno schermo di emizigosità reciproca su scala genomica, usando il lievito come sistema modello. Il nostro metodo crea un complemento genomico di mutanti emizigote, generando ibridi F1 vitali e sterili tra le specie e sottoponendoli a mutagenesi tra trasposoni. Mettiamo insieme gli emizigoti, misuriamo i loro fenotipi nei saggi basati sul sequenziamento e verifichiamo le differenze di frequenza tra i cloni della piscina recanti gli alleli dei due genitori di un determinato gene. Il risultato è un catalogo di loci in cui le varianti tra le specie influenzano il tratto di interesse. Implementiamo il flusso di lavoro RH-seq per chiarire la base genetica delle differenze di termotolleranza tra due specie di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae e S. paradoxus, che ha diversificato 5 milioni di anni fa6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-2 plasmid Gigaprep kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4204</td>
			<td>The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiOAc</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mg/mL Geneticin (G418)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52% polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1546547</td>
			<td>Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved LB liquid broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]</td>
			<td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco</td>
			<td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hiseq 2500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used for SE-150 reads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large shaking incubators with variable temperature settings</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB + carbenicillin agar plates (100 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorimeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q33240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 39&#176;C</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast fungal gDNA prep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750</td>
			<td>Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD + G418 agar plates (300 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis

Un obiettivo centrale della genetica moderna è quello di capire come e perché gli organismi in natura differiscono nel fenotipo. Ad oggi, il campo è avanzato in gran parte sulla forza del collegamento e sui metodi di mappatura delle associazioni, che tracciano la relazione tra le varianti della sequenza del DNA e il fenotipo attraverso la progenie ricombinante dagli accoppiamenti tra individui di una specie. Questi approcci, anche se potenti, non sono adatti alle differenze tra di esse tra specie riproduttivamente isolate. Qui descriviamo un nuovo metodo per la dissezione dell'intersezione a livello genomico della variazione dei tratti naturali che può essere facilmente applicato a specie incompatibili. La nostra strategia, RH-seq, è un'implementazione a livello di genoma del test reciproco dell'emizigote. L'abbiamo sfruttato per identificare i geni responsabili della sorprendente crescita ad alta temperatura del lievito Saccharomyces cerevisiae rispetto alla sua specie gemella S. paradoxus. RH-seq utilizza la mutagenesi trasposoni per creare un pool di emizigoti reciproci, che vengono poi tracciati attraverso una concorrenza ad alta temperatura tramite il sequenziamento ad alto contenuto di velocità. Il nostro flusso di lavoro RH-seq, come qui riportato, fornisce un modo rigoroso e imparziale per sezionare tratti antichi e complessi nella clade di lievito in erba, con l'avvertenza che è necessario un sequenziamento profondo ad alta intensità di risorse per garantire la copertura genomica per la mappatura genetica. Con il calo dei costi di sequenziamento, questo approccio promette molto per un uso futuro negli eucarioti.

Abbiamo accoppiato S. cerevisiae e S. paradoxus per formare un ibrido sterile, che abbiamo sottoposto alla mutagenesi della trasposonia. Ogni clone mutagenizzato era un emizygote, un ibrido diploide in cui un allele di un gene viene interrotto (Figura 1A, Figura 2). Abbiamo gareggiato gli emizigotes l'uno contro l'altro per crescita a 39 gradi centigradi e, in un esperimento separato come controllo, a 28 gradi centigradi (<stro...

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Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

L'emizigozia reciprocata tramite sequenziamento (RH-seq) è un nuovo potente metodo per mappare la base genetica di una differenza tra le specie. I pool di emizigotes sono generati dalla mutagenesi trasposonista e la loro forma fisica è monitorata attraverso la crescita competitiva utilizzando il sequenziamento ad alto tutto. L'analisi dei dati risultanti individua i geni alla base del tratto.

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Il nostro metodo è uno dei primi ad essere in grado di sezionare le basi genetiche delle differenze di tratto su scala genomica tra specie anziché all'interno delle specie. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è ad alta produttività, alta risoluzione e ampiamente applicabile. Per iniziare questa procedura, recuperare il ceppo di scorte di congelatori JR507 dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e strizzarlo su singole colonie su una piastra di agar YPD.Incubare a 26 gradi Celsius per due giorni o fino a quando non compaiono colonie. Quindi inoculare 100 millilitri di YPD liquido in un pallone di vetro da 250 millilitri con una singola colonia di JR507 e incubare a 28 gradi Celsius mentre si trema a 200 giri/min per 24 ore o fino a raggiungere la fase stazionaria. Il giorno dopo, misura l'od600 della cultura notturna.Torna a diluire parte della coltura notturna con YPD liquido fresco in un nuovo pallone da un litro per creare una nuova cultura con un od600 di zero punti due e un volume di 500 millilitri. Ripetere questo processo altre tre volte per creare un totale di quattro culture con un od600 di zero punti due, utilizzando la stessa cultura notturna per tutte le nuove culture. Incubare tutte le colture a 28 gradi Celsius per sei ore mentre si trema a 200 giri/min.Dopo questo, combina due delle colture da 500 millilitri per creare una cultura da un litro. Unire le restanti due colture da 500 millilitri per creare una seconda coltura da un litro. In primo luogo, dividere ciascuna delle colture da un litro in 20 aliquote da 50 millilitri ciascuna in un tubo conico di plastica per un totale di 40 tubi.Mettere da parte 20 tubi. Centrifugare i restanti 20 tubi a 1000 volte G per tre minuti per pellettare le cellule di lievito. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet con 25 millilitri di acqua sterile con vortice.Centrifuga a 1000 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet con cinque millilitri di 1X Tris-EDTA zero point un tampone di acetato di litio molare mediante vortice. Centrifuga a 1000 volte G per tre minuti.Scartare il supernatante e rimescolare nuovamente ogni pellet con cinque millilitri 1X Tris-EDTA zero point un tampone di acetato di litio molare mediante vortice. Centrifuga a 1000 volte G per tre minuti. Mentre le cellule sono centrifughe, preparare almeno 120 millilitri di una soluzione contenente polietilene glicole, acetato di litio e tampone Tris-EDTA.Conservare questa soluzione sul ghiaccio. Per preparare il DNA plasmatico per la trasformazione, prima far bollire quattro millilitri di DNA dello sperma di salmone a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo questo, raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio per cinque minuti.Mescolare 20 millilitri di pJR487 ad una concentrazione di 538 nanogrammi per millilitro con quattro millilitri del DNA freddo dello sperma del salmone. Mantenere questa miscela sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso. Successivamente, aggiungere 600 microlitri della miscela plasmatica e DNA spermatico sopra ogni pellet cellulare.Aggiungere tre millilitri della miscela PEG di ACETATO di litio TE ad ogni pellet. Sospendiamo tubazioni su e giù e poi vortice. Incubare i tubi a temperatura ambiente per 10 minuti.Quindi scaldare ogni tubo in un bagno d'acqua a 39 gradi Celsius per 26 minuti, assicurandosi di invertire ogni tubo ogni pochi minuti. Centrifugare i tubi a 1000 volte G per tre minuti. Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet in 10 millilitri di YPD con vortice.Dopo questo, combina tutti i 20 tubi in un nuovo pallone di vetro. Aggiungere 433 punti quattro millilitri di YPD liquido in un nuovo pallone di vetro da un litro. Quindi trasferire 66 punti sei millilitri di cellule nel pallone.Ripetere questo processo di trasferimento altre due volte per utilizzare l'intero volume delle celle trasformate. Quindi misurare l'od600 di ogni nuova coltura da 500 millilitri. Incubare tutte e tre le colture a 28 gradi Celsius per due ore mentre si trema a 200 giri/min.Dopo questo aggiungere zero punti cinque millilitri da 300 milligrammi per microlitro G418 a ciascuno dei contenitori a una concentrazione finale di 300 microgrammi per millilitro. Riportare i contenitori all'incubatore di scuotimento a 28 gradi Celsius e 200 RPM. Ripetere l'intero processo con i restanti 20 tubi conici.A questo punto, ci dovrebbero essere sei mastri da un litro, ognuno contenente 500 millilitri di cellule con G418 aggiunto. Incubare tutti e sei i contenitori a 28 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min per circa due giorni o fino a raggiungere un od600 di circa due punti tre in ogni pallone. Quindi, combina tutti e sei i contenitori insieme per creare un'unica cultura.Utilizzare questa coltura combinata per inoculare due nuovi contenitori da un litro con 500 millilitri di YPD e G418 a un od600 di zero punti due. Incubare queste nuove colture durante la notte a 28 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min fino a raggiungere un od600 di circa due punti due. Successivamente, combina entrambe le culture in un'unica cultura e misura l'od600 della cultura combinata.Centrifuga 25 millilitri di questa coltura a 1000 volte G per tre minuti. Calcolare il numero totale di unità od600 totali di celle che si trovano nei 25 millilitri come delineato nel protocollo di testo. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in acqua sufficiente a creare una sospensione cellulare con un od600 di un punto otto cinque per millilitro.Utilizzando perline di vetro, placcare un millilitro di celle rimostrate su ciascuna delle 12 grandi piastre di agar sintetiche complete quadrate con 5-FOA. Incubare ogni piatto a 28 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando non si forma un prato sul piatto. Successivamente, utilizzare piccoli cigoli sterili per raschiare le cellule da metà della piastra e in un tubo, contenente 35 millilitri di acqua sterile.Ripetere questo processo per le restanti sei piastre, con il risultato di due tubi di celle in acqua. Unire le sospensioni cellulari in un unico pallone e misurare l'od600 della sospensione, utilizzando l'acqua come vuoto. Utilizzare acqua per regolare la concentrazione cellulare fino a quando l'od600 raggiunge 44 punti quattro per millilitro.Preparare quindi le scorte di celle congelatrici e conservarle a meno 80 gradi Celsius, come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, S.Cerevisiae e S.Paradoxus sono accoppiati per formare un ibrido sterile, che viene sottoposto a trasposizione sulla mutagenesi. Ogni clone mutagenizzato è un emizigote, un ibrido diploide in cui un allele di un gene viene interrotto.Gli emizigoti sono gareggiati ad alta temperatura, e il DNA è isolato da ogni coltura. Il DNA è shirred e legato agli adattatori, e la giunzione tra il transposone e il genoma è amplificata con un primer specifico per il transposone e un primer specifico dell'adattatore. Contando i conteggi delle lezioni di sequenziamento in blocco dall'amplicon, segnala l'idoneità di un clone nella popolazione.Con i risultati alla mano di questo sequenziamento, l'abbondanza di emizigoti per un dato gene, può essere confrontata alle due temperature tra due classi di emizigoti. Cloni in cui solo l'allele di S.Cerevisiae era di tipo selvaggio e funzionale, e cloni che si basano solo sull'allele di S.Paradoxus. In questa implementazione rappresentativa, vengono rilevati segnali forti in otto geni delle pulizie.In ogni caso, inserimenti transposon nell'allele S.Cerevisiae nell'ibrido, crescita compromessa ad alta temperatura. Questi bassi si rappresentavano determinanti candidati del tratto di termotoleranza che distingue S.Cerevisiae da S.Paradoxus. Ora che abbiamo completato questo esperimento, possiamo sezionare altri tratti che differiscono tra queste specie, come la tolleranza al freddo o al sale.

Research

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Genetics

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