Name: genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00
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우리는 J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin 및 J. Skerker가 원래 연구에 기여한 것에 대해 감사드립니다, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, 및 L. Oltrogge는 그의 관대함을 위해, D. Savage는 그의 관대함을 위해 B. 블랙맨, S. 코라데티, A. 플램홀츠, V. 구아치, 디 코스흘랜드, C. 넬슨, A. 사시쿠마르가 토론을 위해; 우리는 또한 PiggyBac 플라스미드에 대한 J. 듀버 (생명 공학학과, UC 버클리)에게 감사드립니다. 이 작품은 R01 GM120430-A1과 지역 사회 시퀀싱 프로젝트 1460에 의해 미국 에너지 공동 게놈 연구소의 RBB에 의해 지원되었다, 과학 사용자 시설의 DOE 사무실. 후자에 의해 수행 된 작업은 계약 번호에 따라 미국 에너지부의 과학 사무실에 의해 지원되었다. DE-AC02-05CH11231.

1. 변형을위한 돼지 박 함유 플라스미드의 준비
<ol><li>단일 콜로니에 밖으로 줄무늬 대장균 균주 항포 플라스미드 pJR487 LB + 카르베니실린 한천 접시에. 37 °C에서 1 박 동안 또는 단일 식민지가 나타날 때까지 배양하십시오. 참고 : 플라스미드 pJR487이 복제 된 방법에 대한 설명은이전 작업 3에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>100 μg/mL에서 LB + 카르베니실린 1L을 2 L 유리 플라?...

<ol>
	<li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits:+successes+and+pitfalls.">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li><li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+species+differences.">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li><li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance.">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li><li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test.">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li><li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast.">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li><li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics:+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus.">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li><li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons.">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li><li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae.">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li></ol>

RH-seq의 장점은 이전의 통계적 유전적 방법에 비해 여러 배입니다. 연결 및 연결 분석과는 달리 RH-seq는 단일 유전자 매핑 해상도를 제공합니다. 이와 같이, 그것은 가능성이 주어진된 종의 개인에 걸쳐 특성 변화의 연구에서 중요 한 유틸리티의 될 것입니다., 뿐만 아니라 상호 특이적 차이. 또한, 게놈 전반에 대한 상호 hemizygosity 분석에서 이전의 시도는 유전자 결실 돌연변이체의 수집을 사용했으...

필드의 새벽부터, 그것은 야생 개인에 걸쳐 변화의 기계론적 기초를 이해하는 유전학의 주요 목표되었습니다. 우리가 관심의 특성의 근본적인 loci를 지도로, 신흥 유전자는 진단과 약에 대한 표적으로 즉시 사용될 수 있고, 진화의 원리에 빛을 비출 수 있습니다. 이를 향한 업계 표준은 연결 또는 협회 1을 통해 인구에 걸쳐 유전자형과표현형 사이의 관계를 테스트하는 것입니다. 이러한 접근법은 강력한, 그들은 하나의 주요 제한-그들은 방해 개인 사이 십자가에서 재조합 자손의 큰 패널에 의존. 그(것)들은 처음에 자손을 형성하기 위하여 짝을 지을 수 없는 종의 연구 결과에서 아무 소용이 없습니다. 이와 같이, 필드는 생식 고립 된 종 사이의 특성 차이의 편견해부에 대한 작은 용량을 가지고있다 2.
이 작품에서 우리는 새로운 방법의 기술적 기초를보고, RH-seq3,종 사이의 형질 변이의 유전 적 기초의 게놈 규모 설문 조사. 이 접근법은 상호 반심고트 시험4,5의대규모 병렬 버전이며, 이는 처음에 두 개의 유전적으로 구별되는 두 가지 배경 사이의 유전적으로 구별되는 배경 사이의 유전적으로 구별되는 차이의 현상학적 효과를 평가하는 방법으로 생각되었다. 특정 궤적(그림1A). 이 계획에서, 2개의 발산한 개별은 그 게놈의 각각에게서 오는 그들의 게놈의 반을 형성하기 위하여 첫째로 짝짓기됩니다. 이 백그라운드에서는 각 계개의 대절의 중단되거나 삭제된 복사본을 포함하는 여러 균주가 생성됩니다. 이 균주는 관심의 궤적에서 제외 한 게놈의 사방에 diploid 남아 있기 때문에 hemizygous, 어디 그들은 haploid 간주 됩니다., 그리고 상호 로 불린다 각 하나의 부모의 eele 부족 하기 때문에, 그것의 나머지 eele파생 다른 부모. 이러한 상호 hemizygote 균주의 표현형을 비교함으로써, 하나는 조작 된 궤적에서 DNA 서열 변이체가 관심의 특성에 기여하는지 여부를 결론을 내릴 수 있습니다, 궤적에서 변이체는 상호 사이의 유일한 유전 적 차이이기 때문에 헤미지고테 균주. 이런 식으로, 잘 통제된 실험 적인 설치에 있는 그들 사이 phenotypic 차이에 종 사이 유전 적 차이를 연결하는 것이 가능합니다. 이 시험의 응용은 후보 유전자 프레임 워크에 있었다 현재까지- 즉, 후보 궤적의 자연 변이가 특성에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 이미 손에있는 경우.
다음에, 우리는 모델 시스템으로 효모를 사용하여 게놈 규모의 상호 hemizygosity 스크린을 위한 프로토콜을 배치합니다. 우리의 방법은 종 사이 실행 가능한, 멸균 F1 하이브리드를 생성하고 트랜스 포종 돌연변이 유발에 복종하여 hemizygote 돌연변이의 게놈 보완을 만듭니다. 우리는 hemizygotes를 풀링하고, 시퀀싱 기반 분석에서 표현형을 측정하고, 주어진 유전자의 두 부모의 대식가를 가진 풀의 클론 사이의 주파수 차이를 테스트합니다. 결과는 종 사이의 변이체가 관심의 특성에 영향을 미치는 loci의 카탈로그입니다. 우리는 두 개의 신진 효모 종, 사카로 미세세세와 S. 역설사이의 열내성 차이의 유전 적 기초를 해명하기 위해 RH-seq 워크플로우를 구현, 이는 ~ 5 백만 년 전6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-2 plasmid Gigaprep kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4204</td>
			<td>The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiOAc</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mg/mL Geneticin (G418)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52% polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1546547</td>
			<td>Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved LB liquid broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]</td>
			<td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco</td>
			<td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hiseq 2500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used for SE-150 reads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large shaking incubators with variable temperature settings</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB + carbenicillin agar plates (100 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorimeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q33240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 39&#176;C</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast fungal gDNA prep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750</td>
			<td>Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD + G418 agar plates (300 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis

현대 유전학의 핵심 목표는 야생의 유기체가 표현형이 다른 방법과 이유를 이해하는 것입니다. 현재까지, 필드는 종의 개별 사이 짝짓기에서 재조합 자손을 통해 DNA 서열 이체 및 표현형 사이 관계를 추적하는 연결및 협회 매핑 방법의 힘에 크게 진보했습니다. 이러한 접근법은 강력하지만 생식적으로 고립된 종 간의 특성 차이에 적합하지 않습니다. 여기에서 우리는 호환되지 않는 종에 쉽게 적용될 수 있는 자연적인 형질 변이의 게놈 전체 해부를 위한 새로운 방법을 기술합니다. 우리의 전략, RH-seq는, 상호 hemizygote 시험의 게놈 전체 구현입니다. 우리는 그것의 자매 종 S.역설에 상대적으로 효모 Saccharomyces cerevisiae의 눈에 띄는 고온 성장에 책임 있는 유전자를 확인하기 위하여 그것을 이용했습니다. RH-seq는 트랜스포손 돌연변이 발생을 이용하여 상호 반혈구 풀을 생성한 다음 고처리량 시퀀싱을 통해 고온 경쟁을 통해 추적합니다. 여기에 명시된 RH-seq 워크플로우에서는 신진 효모 클래드에서 고대의 복잡한 특성을 해부하는 엄격하고 편견없는 방법을 제공하며, 유전 매핑을 위한 게놈 커버리지를 보장하기 위해 자원 집약적인 깊은 시퀀싱이 필요하다는 경고와 함께 합니다. 시퀀싱 비용이 감소함에 따라 이 접근 방식은 진핵생물 전반에 걸친 향후 사용에 대한 큰 약속을 지니고 있습니다.

우리는 S. cerevisiae와 S. 역설을 교배하여 멸균 하이브리드를 형성하여 트랜스포종 돌연변이 발생을 실시했습니다. 각각의 돌연변이화된 클론은 하나의 유전자의 하나의 알레르가 중단되는 헤미지고테, 디플로이드 하이브리드였다(도1A, 도2). 우리는 39°C에서 성장하여 헤미지고테스를 서로 경쟁하고, 대조군으로서 별도의 실험...

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Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

게놈 전체 상호 Hemizygosity 분석을 통해 사카로 마이스 효모의 종 간의 열내성 차이의 유전 매핑

시퀀싱 (RH-seq)을 통한 상호 반심은 종 간의 특성 차이의 유전적 기초를 매핑하는 강력한 새로운 방법입니다. hemizygotes의 풀은 트랜스포종 돌연변이 발생에 의해 생성되고 그들의 체력은 높은 전반에 걸쳐 시퀀싱을 사용하여 경쟁적인 성장을 통해 추적됩니다. 결과 데이터의 분석은 특성의 근본적인 유전자를 찾아낸다.

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

우리의 방법은 종 내대신 종 사이의 게놈 전체 규모에 특성 차이의 유전 기지를 해부 할 수있는 첫 번째 중 하나입니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량, 고해상도 및 널리 적용 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 영하 80도에서 저장에서 JR507 냉동고 재고 변형을 검색하고 YPD 한천 판에 하나의 식민지로 줄입니다.2일 간 또는 식민지가 나타날 때까지 섭씨 26도에서 배양하십시오. 그런 다음 JR507의 단일 식민지와 250 밀리리터 유리 플라스크에 액체 YPD의 100 밀리리터를 접종하고 200 RPM에서 24 시간 동안 또는 고정 단계에 도달 할 때까지 섭씨 28도에서 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 문화의 od600을 측정합니다.신선한 액체 YPD로 하룻밤 문화의 일부를 새로운 1 리터 플라스크에 희석하여 0 점 2의 od600과 500 밀리리터의 부피로 새로운 문화를 만듭니다. 이 과정을 세 번 더 반복하여 모든 새로운 문화권에서 동일한 야간 문화를 사용하여 od600의 0포인트 2의 od600을 사용하여 총 4개의 문화를 만듭니다. 200 RPM에서 흔들면서 6 시간 동안 28도에서 모든 문화를 배양하십시오.그 후 500밀리리터 배양 중 두 가지를 결합하여 1리터 문화를 만듭니다. 나머지 두 500 밀리리터 문화를 결합하여 두 번째 리터 문화를 만듭니다. 첫째, 각 리터 배양을 플라스틱 원뿔 튜브에 각각 20 50 밀리리터 알리쿼트로 분할하여 총 40개의 튜브를 형성합니다.20개의 튜브를 따로 두십시오. 잔동 세포를 펠릿3 분 동안 1000 회 G에서 나머지 20 개의 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 소용돌이에 의해 멸균 물의 25 밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다.3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기. 상체를 버리고, 1X Tris-EDTA 제로 포인트 1의 5 밀리리터로 각 펠릿을 소용돌이에 의해 1 개의 몰리튬 아세테이트 버퍼로 재차 질한다. 3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기.상체를 버리고, 5 밀리리터 1X Tris-EDTA 제로 포인트 1 몰라 리튬 아세테이트 버퍼로 각 펠릿을 다시 다시 재생하여 소용돌이에 의해. 3 분 동안 1000 배 G에서 원심 분리기. 세포가 원심분리되는 동안 폴리에틸렌 글리콜, 리튬 아세테이트 및 Tris-EDTA 버퍼를 포함하는 용액의 적어도 120 밀리리터를 준비하십시오.이 솔루션을 얼음 위에 저장합니다. 변혁을 위해 혈장 DNA를 준비하기 위하여는, 먼저 5 분 동안 100섭씨에서 연어 정액 DNA의 4밀리리터를 끓입니다. 그 후, 즉시 5 분 동안 얼음에 냉각.차가운 연어 정자 DNA의 4 밀리리터와 밀리리터 당 538 나노 그램의 농도에서 pJR487의 20 밀리리터를 혼합. 이 혼합물을 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 각 세포 펠릿 위에 플라즈마 와 정자 DNA 혼합물의 600 마이크로 리터를 추가합니다.각 펠릿에 PEG 리튬 아세테이트 TE 혼합물 3밀리리터를 추가합니다. 우리는 위아래로 피펫팅한 다음 소용돌이에 의해 중단됩니다. 10 분 동안 실온에서 튜브를 배양.그런 다음 각 튜브를 수조에서 섭씨 39도에서 26분 동안 가열하여 몇 분마다 각 튜브를 반전시수 있습니다. 3 분 동안 1000 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 소용돌이에 의해 YPD의 10 밀리리터에 각 펠릿을 다시 중단합니다.그 후, 새로운 유리 플라스크에 모든 20 튜브를 결합합니다. 433포인트 4밀리리터의 액체 YPD를 새로운 1리터 유리 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 66 점 6 밀리리터의 세포밀리리터를 플라스크로 옮킨다.변환된 셀의 전체 볼륨을 사용하려면 이 전달 프로세스를 두 번 더 반복합니다. 그런 다음 각 새로운 500 밀리리터 배양의 od600을 측정합니다. 200 RPM에서 흔들면서 2 시간 동안 섭씨 28도에서 세 문화를 모두 배양하십시오.이 후 0 점 5 밀리 리터의 300 마이크로 리터 G418 의 각 플라스크에 밀리 리터 당 300 밀리 리터를 추가 밀리 리터 당 300 마이크로 그램. 플라스크를 섭씨 28도, RPM 200도로 흔들리는 인큐베이터에 반환하십시오. 나머지 20개의 원식 튜브를 통해 이 전체 프로세스를 반복합니다.이 시점에서, G418추가를 가진 세포의 500 밀리리터를 포함하는 각각 6개의 1리터 플라스크가 있어야 합니다. 약 200 RPM에서 약 200 RPM에서 또는 각 플라스크에서 약 2 점 3의 od600에 도달 할 때까지 6 개의 플라스크를 28도에서 모두 배양하십시오. 그런 다음 6개의 플라스크를 모두 결합하여 단일 문화권을 만듭니다.이 결합 된 문화를 사용하여 YPD와 G418의 500 밀리리터와 함께 두 개의 새로운 1 리터 플라스크를 제로 포인트 2의 od600으로 접종하십시오. 이 새로운 문화를 하룻밤 사이에 28도에서 200 RPM에서 흔들어 서 약 2 점 2의 od600에 도달할 때까지 배양하십시오. 그 후, 두 문화를 하나의 문화로 결합하고 결합된 문화의 od600을 측정한다.이 문화의 원심분리기 25 밀리리터는 3분 동안 1000배 G로. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 25 밀리리터에 있는 셀의 총 od600 단위수를 계산합니다. 상체를 버리고 충분한 물에 세포를 다시 일시 중지하여 밀리리터 당 1점 85의 od600을 사용하여 세포 현탁액을 만듭니다.유리 구슬을 사용하여, 5-FOA가있는 12 개의 크고 사각형 완전한 합성 한천 판에 재중단 된 세포의 1 밀리리터를 접시. 각 플레이트를 섭씨 28도에서 1~2일 동안 또는 잔디가 접시에 형성될 때까지 배양합니다. 다음으로, 작은 멸균 스퀴지를 사용하여 접시의 절반에서 세포를 긁어 내고 35 밀리리터의 멸균 물을 포함하는 튜브로 긁습니다.나머지 6개의 플레이트에 대해 이 과정을 반복하여 두 개의 튜브의 수중 세포를 생성합니다. 셀 서스펜션을 단일 플라스크에 결합하고 물을 빈 플라스크로 사용하여 서스펜션의 od600을 측정합니다. od600이 밀리리터당 44포인트 4에 도달할 때까지 물을 사용하여 세포 농도를 조절합니다.다음으로, 셀의 냉동고 주식을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 영하 80도에 저장합니다. 이 연구에서, S.Cerevisiae와 S.역설은 돌연변이 발생에 전염되는 멸균 하이브리드를 형성하기 위하여 짝짓기됩니다. 각 돌연변이 클론은 한 유전자의 한 유전자가 중단되는 디플로이드 하이브리드인 헤미자고테입니다.hemizygotes는 고온에서 경쟁하고, DNA는 각 문화에서 고립됩니다. DNA는 어댑터에 쉬르고, 트랜스포슨과 게놈 사이의 접합은 트랜스포슨 특이적 프라이머와 어댑터 별 프라이머로 증폭된다. 앰플리콘에서 대량 시퀀싱 읽기 수를 계산, 인구에서 클론의 적합성을보고.이 시퀀싱의 결과로 주어진 유전자에 대한 hemizygote 풍부는 두 종류의 헤미지고테스 사이의 두 온도에서 비교 될 수 있습니다. S.Cerevisiae allele만 야생 유형과 기능성, 그리고 클론은 S.Paradoxus 본선에만 의존하는 클론. 이 대표적인 구현에서, 강한 신호는 8개의 하우스키핑 유전자에서 검출됩니다.각각의 경우, 하이브리드의 S.Cerevisiae 알레에 있는 트랜스포슨 삽입, 고온에서 의 성장. 이 저-si는 S.Paradoxus에서 S.Cerevisiae를 구별하는 열편협 특성의 후보 결정자를 나타냈습니다. 이제 이 실험을 완료했기 때문에 감기나 소금 내성과 같은 다른 특성을 해부할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

연구

유전학

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...