Name: genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis at JoVE.com

Vi takker J. Roop, R. Hackley, I. Grigoriev, A. Arkin og J. Skerker for deres bidrag til den opprinnelige studien, F. AlZaben, A. Flury, G. Geiselman, J. Hong, J. Kim, M. Maurer, og L. Oltrogge for teknisk assistanse, D. Savage for sin generøsitet med mikroskopi ressurser, og B. Blackman, S. Coradetti, A. Flamholz, V. Guacci, D. Koshland, C. Nelson og A. Sasikumar for diskusjoner; Vi takker også J. Dueber (Department of bioteknologi, UC Berkeley) for PiggyBac plasmider. Denne arbeide var understøttet av R01 GM120430-a1 og av fellesskapet sekvensering prosjekt 1460 å RBB for det U.S. avdeling av energi skjøt Genova off, en DOE kontor av vitenskap bruker Letter. Arbeidet utført av sistnevnte ble støttet av Office of Science av US Department of Energy under kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231.

1. utarbeidelse av piggyBac-inneholdende plasmider for transformasjon
<ol><li>Strek ut til enkelt kolonier E. coli stamme harboring plasmider pJR487 på en lb + carbenicillin agar plate. Ruge for 1 natt ved 37 ° c eller til enkelt kolonier vises. Merk: en beskrivelse av hvordan plasmider pJR487 ble klonet finnes i vårt forrige arbeid3.</li>
	<li>Vaksinere 1 L av LB + carbenicillin ved 100 μg/mL med en enkelt koloni av E. coli inneholdende pJR487 i en 2 L glass kolbe. Voks...

<ol>
	<li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits:+successes+and+pitfalls.">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li><li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+species+differences.">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li><li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance.">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li><li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test.">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li><li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast.">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li><li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics:+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus.">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li><li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons.">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550 (2014).</li><li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li><li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae.">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li></ol>

Fordelene med RH-SEQ over tidligere statistiske-genetiske metoder er flere ganger. I motsetning til koblings-og tilknytnings analyse, gir RH-SEQ en løsning for kartlegging av enkelt genet; som sådan, vil det trolig være av betydelig nytte selv i studier av personlighetstrekk variasjon på tvers av individer av en gitt Art, så vel som interspesifikk forskjeller. Også tidligere forsøk på Genova-Wide gjensidige hemizygosity analyse brukt samlinger av gen sletting mutanter, hvorav noen Harbor sekundære mutasjoner som...

Siden begynnelsen av feltet, har det vært et førsteklasses mål i genetikk å forstå mekanistisk grunnlag av variasjon over ville individer. Som vi kart Loci underliggende en egenskap av interesse, den emergent gener kan være av umiddelbar bruk som mål for diagnostikk og narkotika, og kan belyse prinsippene om evolusjon. Bransjestandarden mot dette formålet er å teste for et forhold mellom genotype og fenotype over en populasjon via kobling eller forening1. Kraftig som disse tilnærmingene er, de har en viktig begrensning-de er avhengige av store paneler av rekombinant avkom fra krysser mellom interfertile individer. De er ikke i bruk i studiet av arter som ikke kan mate å danne avkom i første omgang. Som sådan har feltet hatt liten kapasitet for objektiv Disseksjon av Personlighets forskjeller mellom reproductively isolerte arter2.
I dette arbeidet rapporterer vi den tekniske grunnlaget av en ny metode, RH-SEQ3, for Genova-skala undersøkelser av genetisk grunnlag av egenskap variasjon mellom arter. Denne tilnærmingen er en massivt parallell versjon av den gjensidige hemizygote test4,5, som først ble unnfanget som en måte å evaluere den fenotypiske effekten av allel forskjeller mellom to genetisk distinkt bakgrunn på en bestemt geometrisk (figur 1a). I denne ordningen, de to avvikende individer er først paret å danne en hybrid, halvparten av hvis Genova kommer fra hver av de respektive foreldre. I denne bakgrunnen, er flere stammer generert, hver med en avbrutt eller slettet kopi av hver av foreldrenes allel av geometriske. Disse stammer er hemizygous siden de forblir diploid overalt i Genova unntatt på geometriske steder av interesse, der de anses haploide, og er referert til som gjensidige siden hver mangler bare én foreldrenes allel, med sine resterende allel avledet fra andre forelderen. Ved å sammenligne fenotyper av disse gjensidige hemizygote stammer, kan man konkludere med om DNA-sekvens varianter ved manipulert geometrisk, bidrar til trekk av interesse, siden varianter på det geometriske er den eneste genetiske forskjellen mellom gjensidig hemizygote stammer. På denne måten er det mulig å knytte genetiske forskjeller mellom arter til en fenotypiske forskjell mellom dem i et godt kontrollert eksperiment oppsett. Hittil har søknader om denne testen vært i et kandidat-gen rammeverk-det vil si tilfeller der hypotesen er allerede i hånden som naturlig variasjon på et kandidat knutepunkt kan påvirke en egenskap.
I det følgende, legger vi ut protokollen for et Genova-skala gjensidige hemizygosity skjermen, ved hjelp av gjær som modell system. Vår metode skaper en genomisk komplement av hemizygote mutanter, ved å generere levedyktig, sterile F1 hybrider mellom arter og utsette dem for Transposon mutagenese. Vi Pool hemizygotes, måle deres fenotyper i sekvensering-baserte analyser, og test for forskjeller i frekvens mellom kloner av bassenget bærer de to foreldrenes alleler av et gitt gen. Resultatet er en katalog av Loci der varianter mellom arter påvirker trekk av interesse. Vi implementerer RH-SEQ arbeidsflyt for å belyse det genetiske grunnlaget for thermotolerance forskjeller mellom to spirende gjær arter, Saccharomyces cerevisiae og S. paradoxus, som skilt ~ 5 000 000 år siden6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-2 plasmid Gigaprep kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4204</td>
			<td>The number of kits required depends on how efficient your preps are in each kit. This kit comes with 5 individual plasmid prep columns. Run 1 L of saturated E. coli culture through each prep column, as using more than 1 L per column can cause clogging of the prep filter, leading to low yield and poor quality DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-EDTA (TE) buffer (100 mM Tris-HCl and 10 mM EDTA)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiOAc</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mg/mL Geneticin (G418)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>52% polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1546547</td>
			<td>Dissolve in water and filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved LB liquid broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>Make LB liquid broth using your powder from any brand, and milliQ water. Autoclave it before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin stock in water (100 mg/mL)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter sterilize through a 0.22 &#956;m filter before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete synthetic agar plates (24.1cm x 24.1cm) with 5-fluoroorotic acid (5-FOA) [0.2% drop-out amino acid mix without uracil or yeast nitrogen base (YNB), 0.005% uracil , 2% D-glucose, 0.67% YNB without amino acids, 0.075% 5-FOA]</td>
			<td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glucose: Sigm), YNB: Difco</td>
			<td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracil: U0750, D-glucose: G8270, YNB: DF0919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying pJR487 (CEN-/ARS+ piggyBac-containing plasmid)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybrid yeast strain JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Request from Brem lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina Hiseq 2500</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used for SE-150 reads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large shaking incubators with variable temperature settings</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB + carbenicillin agar plates (100 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make LB agar plates as normal and add carbenicillin to 100 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Fluorimeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q33240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath at 39&#176;C</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast fungal gDNA prep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast peptone dextrose (YPD) liquid media</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>Peptone: 211677, Yeast Extract: 212750</td>
			<td>Add filter-sterilized D-glucose to 2% after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD + G418 agar plates (300 &#956;g/mL)</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td>Make YPD agar plates as normal and add G418 to 300 &#956;g/mL before drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD agar plates</td>
			<td>Agar: BD Difco</td>
			<td>Agar: 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic mapping of thermotolerance differences between species of saccharomyces yeast via genome-wide reciprocal hemizygosity analysis

Et sentralt mål for moderne genetikk er å forstå hvordan og hvorfor organismer i naturen varierer i fenotype. Hittil har feltet Avansert i stor grad på styrken av kobling og forening kartlegging metoder, som sporer forholdet mellom DNA sekvens varianter og fenotype tvers rekombinant avkom fra siamesere mellom individer av en art. Disse tilnærmingene, men kraftige, er ikke godt egnet til egenskap forskjeller mellom reproductively isolerte arter. Her beskriver vi en ny metode for Disseksjon av naturlig egenskap variasjon som lett kan brukes på inkompatible arter. Vår strategi, RH-SEQ, er en Genova-bred gjennomføring av gjensidig hemizygote test. Vi utnyttet den til å identifisere gener ansvarlig for slående høy temperatur vekst av gjær Saccharomyces cerevisiae i forhold til sin søster arter S. paradoxus. RH-SEQ utnytter Transposon mutagenese å skape en pool av gjensidige hemizygotes, som deretter spores gjennom en høy temperatur konkurranse via høy-gjennomstrømning sekvensering. Våre RH-SEQ arbeidsflyt som er lagt ut her gir en streng, upartisk måte å analysere gamle, komplekse trekk i spirende gjær klade, med påminnelse om at ressurskrevende dyp sekvensering er nødvendig for å sikre genomisk dekning for genetisk kartlegging. Idet sekvensering omkostningene miste, denne adgang avholde stor Love for fremtid bruk vannrett Landplantenes.

Vi paret s. cerevisiae og s. paradoxus å danne en steril hybrid, som vi utsatt for Transposon mutagenese. Hver mutagenized klone var en hemizygote, en diploid hybrid der en allel av ett gen blir forstyrret (figur 1a, figur 2). Vi konkurrerte med hemizygotes mot hverandre ved vekst ved 39 ° c og i et eget eksperiment som kontroll, ved 28 ° c (figur 1B), og vi isolerte DNA fra hver kultur. For å ...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis at JoVE.com

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartlegging av Thermotolerance forskjeller mellom arter av Saccharomyces gjær via Genova-bredt gjensidige Hemizygosity Analysis

Gjensidige hemizygosity via sekvensering (RH-SEQ) er en kraftig ny metode for å kartlegge genetisk grunnlag av en egenskap forskjell mellom arter. Bassenger av hemizygotes er generert av Transposon mutagenese og deres egnethet spores gjennom konkurransedyktig vekst ved hjelp av høy-gjennom sekvensering. Analyse av den resulterende data peikt gener underliggende trekket.

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Vår metode er en av de første som kan dissekere de genetiske grunnlagene for egenskapsforskjeller på en genom-omfattende skala mellom arter i stedet for innenfor arter. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er høy gjennomstrømning, høy oppløsning og allment anvendelig. For å starte denne prosedyren, hent JR507 fryselagerstammen fra lagring på minus 80 grader Celsius, og strek den ut til enkeltkolonier på en YPD agarplate.Inkuber ved 26 grader Celsius i to dager eller til kolonier vises. Inokuler deretter 100 milliliter flytende YPD i en 250 milliliter glasskolbe med en enkelt koloni av JR507, og inkuber ved 28 grader Celsius mens du rister ved 200 RPM i 24 timer eller til stillestående fase er nådd. Neste dag måler du od600 av overnattingskulturen.Tilbake fortynne noe av natten kultur med fersk flytende YPD i en ny en liter kolbe for å skape en ny kultur med en od600 av null punkt to og et volum på 500 milliliter. Gjenta denne prosessen tre ganger til for å skape totalt fire kulturer med en od600 av nullpunkt to, ved hjelp av samme overnattingskultur for alle de nye kulturene. Inkuber alle kulturer på 28 grader Celsius i seks timer mens risting på 200 RPM.Etter dette kombinerer du to av de 500 milliliter kulturene for å skape en en liters kultur. Kombiner de resterende to 500 milliliter kulturene for å skape en annen en liter kultur. Først deler du hver av de en liters kulturene i 20 50 milliliter aliquots hver i et plastkonisk rør for totalt 40 rør.Sett av 20 rør. Sentrifuge de resterende 20 rørene ved 1000 ganger G i tre minutter for å pellet gjærcellene. Kast det overnaturante, og gjenoppstj hver pellet med 25 milliliter sterilt vann ved å virvle.Sentrifuge ved 1000 ganger G i tre minutter. Kast supernatanten, og gjenoppuss hver pellet med fem milliliter 1X Tris-EDTA nullpunkt en Molar litiumacetatbuffer ved å virvle. Sentrifuge ved 1000 ganger G i tre minutter.Kast supernatant, og resuspend hver pellet igjen med fem milliliter 1X Tris-EDTA null punkt en Molar litiumacetat buffer ved å virvle. Sentrifuge ved 1000 ganger G i tre minutter. Mens cellene sentrifugerer, må du forberede minst 120 milliliter av en løsning som inneholder polyetylenglykol, litiumacetat og Tris-EDTA-buffer.Oppbevar denne løsningen på is. For å forberede plasma-DNA for transformasjon, kok først fire milliliter laksesæd DNA ved 100 grader Celsius i fem minutter. Etter dette, umiddelbart kjøle den på is i fem minutter.Bland 20 milliliter pJR487 med en konsentrasjon på 538 nanogram per milliliter med fire milliliter av den kalde laksesæd DNA. Hold denne blandingen på is til den er klar til bruk. Deretter legger du til 600 mikroliter av plasma- og sperm DNA-blandingen på toppen av hver cellepellet.Tilsett tre milliliter av PEG litiumacetat TE-blandingen til hver pellet. Vi suspenderer ved å pipetter opp og ned og deretter virvle. Inkuber rørene ved romtemperatur i 10 minutter.Deretter varmestøt hvert rør i et vannbad på 39 grader Celsius i 26 minutter, sørg for å invertere hvert rør med noen få minutter. Sentrifuger rørene ved 1000 ganger G i tre minutter. Kast supernatant, og resuspend hver pellet i 10 milliliter YPD ved vortexing.Etter dette kombinerer du alle 20 rørene i en ny glasskolbe. Tilsett 433 punkt fire milliliter flytende YPD i en ny en liter glasskolbe. Deretter overfører du 66 punkt seks milliliter celler til kolben.Gjenta denne overføringsprosessen to ganger til for å bruke hele volumet av transformerte celler. Mål deretter od600 av hver nye 500 milliliter kultur. Inkuber alle tre kulturer ved 28 grader Celsius i to timer mens du rister på 200 RPM.Etter dette legge null punkt fem milliliter på 300 milligram per mikroliter G418 til hver av kolber til en endelig konsentrasjon på 300 mikrogram per milliliter. Returner kolben til risting inkubatoren ved 28 grader Celsius og 200 RPM. Gjenta hele prosessen med de resterende 20 koniske rørene.På dette punktet bør det være seks en liter flasker, hver inneholder 500 milliliter celler med G418 lagt til. Inkuber alle seks flasker ved 28 grader Celsius med risting ved 200 RPM i ca. to dager eller til en od600 på ca. to punkt tre er nådd i hver kolbe. Deretter kombinerer du alle seks flasker sammen for å skape en enkelt kultur.Bruk denne kombinerte kulturen til å inokulere to nye en liter flasker med 500 milliliter YPD og G418 til en od600 av nullpunkt to. Inkuber disse nye kulturene over natten på 28 grader Celsius med risting ved 200 RPM til den når en od600 på omtrent to punkt to. Etter dette kombinerer du begge kulturene til en enkelt kultur, og måler od600 av den kombinerte kulturen.Sentrifuge 25 milliliter av denne kulturen på 1000 ganger G i tre minutter. Beregn antall totalt antall od600 enheter av celler som er i de 25 milliliter som beskrevet i tekstprotokollen. Kast det overnaturlige, og resuspend cellene i nok vann til å lage en celle suspensjon med en od600 av ett punkt åtte fem per milliliter.Bruk glassperler, plate en milliliter av resuspended celler på hver av 12 store, firkantede komplette syntetiske agarplater med 5-FOA. Inkuber hver plate ved 28 grader Celsius i en til to dager, eller til en plen dannes på tallerkenen. Deretter bruker du små sterile naler til å skrape cellene av halvparten av platen, og inn i et rør, som inneholder 35 milliliter sterilt vann.Gjenta denne prosessen for de resterende seks platene, noe som resulterer i to rør av celler i vann. Kombiner cellesuspensjonene i en enkelt kolbe, og mål od600 av suspensjonen, ved hjelp av vann som blank. Bruk vann til å justere cellekonsentrasjonen til od600 når 44 punkt fire per milliliter.Deretter forbereder fryseren lagrer av celler og lagre dem på minus 80 grader Celsius som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien er S.Cerevisiae og S.Paradoxus paret for å danne en steril hybrid, som er utsatt for transponere på mutagenese. Hver mutagenisert klone er en hemizygote, en diploid hybrid der ett allele av ett gen er forstyrret.Hemizygotes konkurrerer ved høy temperatur, og DNA er isolert fra hver kultur. DNA-et er shirred og ligated til adaptere, og krysset mellom transposonet og genomet forsterkes med en transposonspesifikk primer og en adapterspesifikk primer. Telle opp bulk sekvensering lese teller fra amplicon, rapportere egnethet av en klone i befolkningen.Med resultatene i hånden fra denne sekvenseringen, kan hemizygote overflod for et gitt gen, sammenlignes ved de to temperaturene mellom to klasser av hemizygotes. Kloner hvor bare S.Cerevisiae allele var vill type og funksjonell, og kloner stole bare på S.Paradoxus allele. I denne representative implementeringen oppdages sterke signaler ved åtte rengjøringsgener.I hvert tilfelle, transposon innsettinger i S.Cerevisiae allele i hybrid, kompromittert vekst ved høy temperatur. Disse lav-si representert kandidat determinanter av termotolerance trekk som skiller S.Cerevisiae fra S.Paradoxus. Nå som vi har fullført dette eksperimentet, kan vi dissekere andre egenskaper som varierer mellom disse artene, som kald eller salttoleranse.

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Genetic Engineering av en ukonvensjonell gjær for fornybar Biodrivstoff og biokjemiske Produksjon

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-brede kartlegging av protein-DNA-interaksjoner med ChEC-seq i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bfu genomet hele transkripsjon forfall i voksende og Quiescent menneskelig fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse av sekvens Data fra satsvis gjær 2-Hybrid-skjermer

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Bestemme sannsynligheten for Variant virusets aminosyre nivå Signal-til-støy analyse av genetisk variasjon

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...