Name: use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes
Uploaded: 2019-07-26T14:45:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier le professeur Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) pour la collecte du sérum humain en vertu du protocole IRB de l'Université du Maryland #313842 financé par DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Les auteurs tiennent également à remercier le professeur Florian Krammer (Icahn School of Medicine, Mt. Sinai, NY, USA) pour avoir fourni des antigènes trimisés HA et NA financés par ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan est partiellement soutenu par le National Center for Research Resources et le National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, grâce à la subvention KL2 TR001416. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

Tous les sérums humains sont manipulés et éliminés selon les protocoles institutionnels approuvés pour la biosécurité avec l'utilisation d'équipements personnels de protection. Tous les membres du personnel de laboratoire participant à ce protocole ont reçu une formation en biosécurité et en éthique de la recherche.
1. Produire des microréseaux d'antigènes grippaux
<ol><li>
Concevoir et obtenir un ensemble d'antigènes pour microarray
	<ol>
<li>Obtenir des antigènes protéiques exprimés et purifiés comme poudre lyophilisée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imprimer des antigènes sur des diapositives de microarray
	<ol>
<li>Reconstituer chaque antigène lyophilisé à une concentration de 0,1 mg/mL dans la saline tamponnée par phosphate (PBS) avec 0,001% Tween-20 (T-PBS). Transférer 10 l de chaque antigène reconstitué à des puits individuels d'une plaque à fond plat non traitée de 384 puits.</li>
		<li>Imprimer des antigènes à l'aide d'une imprimante microarray (l'imprimante microarray utilisée dans cette étude n'est plus disponible dans le commerce, voir Discussion) avec des broches de repérage microarray à faible volume qui aspirent l'antigène dans le canal de l'échantillon et le dépôt par direct contact et l'action capillaire sur les lames de verre enduites de nitrocellulose 16-pad.<ol>
<li>Programmez le logiciel d'impression (p. ex., Gridder) avec la configuration de la plaque source et les paramètres d'impression.<ol>
<li>Utilisez le menu de traction vers le bas pour sélectionner le nom du type de plaque qui sera utilisé avec cette méthode d'impression. Pour cette étude, utilisez une plaque à fond plat non traitée de 384 puits.</li>
				<li>Sélectionnez la boîte de texte à côté du nombre de plaques et tapez le nombre de plaques d'échantillon qui seront utilisées dans ce protocole d'impression. Pour cette étude, utilisez 1 plaque.</li>
				<li>Sélectionnez une configuration de broche à utiliser avec cette méthode. Pour cette étude, utilisez une configuration à 8 broches.</li>
				<li>Assurez-vous que les décalages d'origine sont les distances (dans les directions X et Y) entre l'origine de la diapositive (qui est calibré dans la section administrative) et l'endroit où les goupilles d'impression commenceront à imprimer sur les diapositives.</li>
				<li>À l'aide de l'onglet Array Design, définissez la taille et la forme des tableaux (espacement des points et nombre de points par sous-array). Pour cette étude, imprimez 324 taches (180 m de diamètre avec un espacement de 300 m) sur des lames de 16 pad dans un format 18x18 à l'aide de 8 broches.</li>
				<li>Sélectionnez les paramètres de la façon dont les broches d'impression captent et distribuent des échantillons. Pour cette étude, chaque broche aspire 250 nL de solution antigène et imprime 1 nL sur chacune des 40 taches (total de 20 diapositives pour les 8 broches)</li>
				<li>Configurer le protocole de nettoyage des broches et le protocole de ballonnement. Pour cette étude, chaque broche imprime l'antigène, est trempé dans le ddHstérile 2O dans le récipient sonicated de lavage, et puis aspirates prochain antigène.</li>
				<li>Définissez la séquence dans laquelle les blocs d'échantillon sont imprimés sur les diapositives. Le logiciel de tableau construira un fichier de grille annoté (.gal) pour décrire l'arrangement des antigènes dans chaque microarray. REMARQUE : La rangée supérieure est utilisée pour les fiducials (avec fluorescence à toutes les longueurs d'onde utilisées en imagerie, par exemple, mélange de Qdot 585 nm streptavidin conjugué et Qdot 800 nm streptavidin conjugué dans cette étude) pour orienter les grilles pendant l'imagerie. Pour les longues séries d'impression, les antigènes dans la plaque source peuvent être périodiquement re-suspendus par pipetting de haut en bas, puis le centrifuging, ou nouvelle plaque source peut être préparé et utilisé.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placez les glissières de microréseau non sondées dans une boîte à l'épreuve de la lumière et conservez-les dans une armoire dessiccatrice à température ambiante pour le stockage à long terme. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause indéfiniment à ce stade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effectuer un contrôle de la qualité (nécessite des étiquettes de poly-histidine)
	<ol>
<li>Fixez la glissière aux chambres de sondage et réhydratez-vous avec le tampon de blocage tel que décrit à l'étape 2.1.1-2.1.2 et indiqué à la figure 2.</li>
		<li>Diluer la souris monoclonal poly-Son anticorps 1:100 dans le tampon de blocage 1x filtré. REMARQUE : Si des antigènes protéiques non purifiés (p. ex., exprimés dans un système de transcription et de traduction in vitro) sont directement utilisés pour imprimer des microréseaux, ajouter des composants du système d'expression des protéines (p. ex. E. coli lysate) dans un rapport de 1:10 avec le bloquant le tampon utilisé pour la dilution du sérum afin de bloquer les anticorps dirigés contre ces composants.</li>
		<li>Ajouter 100 l d'anticorps poly-Son anticorps dilué à chaque chambre de diapositive contenant le tampon de tableau après l'aspiration et couver pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC sur le shaker. Laver 3x avec un tampon T-TBS tel que décrit à l'étape 2.2.1. Diluer la chèvre biotine conjuguée anti-souris IgG anticorps secondaires 1:200 dans le tampon de blocage, ajouter 100 L par puits après l'aspiration, et couver pendant 1 h à température ambiante sur shaker. Laver 3x avec un tampon T-TBS.</li>
		<li>Diluer Qdot 585 nm streptavidin conjugué à 4 nM dans le tampon de blocage, ajouter 100 L par puits après l'aspiration, et incuber pendant 1 h à température ambiante sur shaker. Laver 3x avec un tampon T-TBS, puis une fois avec un tampon TBS (sans Tween).</li>
		<li>Disséminer et quantifier les diapositives telles que décrites à l'étape 2.2.5 - 3.1.2. REMARQUE : Les antigènes protéiques doivent contenir ses10 étiquettes pour utiliser ce protocole de contrôle de la qualité. Alternativement, si une balise différente est incluse, le contrôle de la qualité peut être effectué avec un anticorps ou un ligand pour cette étiquette.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sonde sérail pour les anticorps antigrippaux à l'aide de microréseaux
<ol><li>
Incubate sera sur microarrays pour la fixation d'anticorps
	<ol>
<li>Attachez des diapositives de microarray aux chambres à l'aide de clips et placez-les dans des cadres comme le montre la figure 3. REMARQUE : Évitez toujours de toucher le coussinet de microarray avec les mains et les instruments. Assurez-vous que les glissières sont orientées avec le côté pad vers le haut et la petite encoche dans le coin supérieur droit.</li>
		<li>Réhydratez les diapositives de microarray avec 100 L par puits de tampon de blocage 1x filtré, et diluez le sérum 1:100 dans 100 'L de tampon de blocage (peut utiliser des plaques non traitées de 96 puits ou des tubes de 2 ml). Incuber les deux diapositives de microarray réhydratées dans des cadres couverts et le sérum dilué séparément pendant 30 minutes à température ambiante sur le shaker orbital à 100-250 tr/min. Effectuez toutes les étapes d'incubation subséquentes de la même façon sur le shaker. REMARQUE : Le sera doit être aliquoted et congelé à -80 oC pour l'entreposage à long terme afin de minimiser les cycles de gel-dégel et doit être vortexé pour mélanger et centriifugepour enlever les particules avant l'utilisation. Observez attentivement les chambres de diapositives pendant et après cette étape pour détecter toute fuite qui nécessite un réassemblage des chambres de glissière.</li>
		<li>À l'aide de pointes de pipette reliées à une ligne de vide avec un flacon de collecte secondaire, aspirez soigneusement le tampon de blocage du coin de chaque chambre sans toucher les coussinets. Effectuez toutes les étapes d'aspiration ultérieures de la même façon. Ajouter le sérum dilué sur les coussinets rapidement après l'aspiration afin de ne pas laisser sécher les coussinets.</li>
		<li>Placez les cadres couverts dans des plateaux à l'intérieur d'un contenant secondaire entouré d'essuie-tout humide et scellés pour éviter l'évaporation. Incuber pendant la nuit à 4 oC sur un shaker à bascule (alternativement, peut incuber pendant 2 h à température ambiante sur un shaker orbital à 100-250 tr/min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Étiquette des anticorps de sérum liés avec les anticorps secondaires quantum-point-conjugués
	<ol>
<li>Aspirer le sérum des chambres avec soin comme décrit ci-dessus, ajouter 100 L par puits de tampon T-TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 en ddH2O ajusté au pH 7,5 et filtré, peut être obtenu commercialement), et incuber pendant 5 min sur shaker orbital à shaker orbital à shaker orbital à shaker orbital à shaker orbital à 100-250 tr/min. Répétez cette étape de lavage un total de 3x (toutes les étapes de lavage suivantes sont effectuées de la même façon).</li>
		<li>Préparer le mélange d'anticorps secondaires dilués à 1 M en bloquant le tampon et bien mélanger par pipetting avant et pendant l'utilisation pour maintenir l'homogénéité. REMARQUE : Pour maintenir la reproductibilité d'essai, le même lot de chaque anticorps secondaire devrait être utilisé pour toutes les expériences de sondage pour lesquelles la comparaison quantitative des données entre les expériences est prévue. La concentration spécifique d'anticorps secondaires peut devoir être variée selon l'affinité ; suivre les protocoles du fabricant chaque fois que cela est possible.</li>
		<li>Aspirer le tampon des chambres après le lavage final, ajouter 100 L par puits de mélange d'anticorps secondaire, et couver pendant 2 h à température ambiante sur le shaker.</li>
		<li>Aspirez le mélange d'anticorps secondaire laver 3x avec tampon T-TBS, puis laver une fois avec un tampon TBS (sans Tween).</li>
		<li>Dissemble microarray glisse des chambres soigneusement pour éviter de toucher les garnitures, rincer délicatement avec ddH2O filtré, et sécher en plaçant dans des tubes de 50 ml et centrifuging à 500 x g pendant 10 min.</li>
		<li>Placez les diapositives de microarray sondées dans une boîte à l'épreuve de la lumière et conservez-les dans une armoire dessiccatrice à température ambiante pour le stockage à long terme. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause jusqu'à 1 semaine à ce stade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Quantifier la liaison des anticorps aux antigènes dans le microarray
<ol><li>
Visualiser les diapositives de microarray et quantifier l'intensité de la fluorescence ponctuelle pour mesurer la liaison des anticorps
	<ol>
<li>Acquérir des images de diapositives microarray à l'aide de l'imageur portable avec un logiciel intégré.<ol>
<li>Dans l'onglet Configureur, sélectionnez la configuration de diapositives appropriée. Pour cette étude, utilisez des diapositives 16-pad.</li>
			<li>Dans l'onglet Contrôle d'image, sélectionnez le canal fluorescent approprié et ajustez le gain, le temps d'exposition et le temps d'acquisition en fonction de la réactivité du sérum pour obtenir des images optimales. Pour cette étude, les canaux fluorescents pour IgA et IgG étaient respectivement de 585 nm et 800 nm, et les paramètres d'imagerie ont été gain de 50, le temps d'exposition de 500 ms, et le temps d'acquisition de 1 s.</li>
			<li>Cliquez sur Capture pour commencer le processus d'acquisition de l'image. REMARQUE : Les diapositives microarray peuvent être ré-imaged ées à plusieurs paramètres sans dégradation du signal tant qu'elles sont stockées sombres et sèches. D'autres systèmes d'imagerie peuvent être utilisés s'ils sont compatibles avec les diapositives.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Détecter les taches de tableau à l'aide de grilles orientées en fonction des marqueurs fiduciaux et mesurer l'intensité des taches comme médiane de l'intensité des pixels moins l'arrière-plan mesuré autour des taches. Effectuez cet algorithme de quantification par lots à l'aide du logiciel d'imageur intégré, qui utilise le fichier .gal construit à l'étape 1.2.2 pour connecter les intensités ponctuelles aux antigènes individuels sur chaque microarray.<ol>
<li>Dans le panneau Info fichier, téléchargez le fichier .gal en sélectionnant à partir de son dossier sur l'ordinateur, et spécifiez le dossier où les fichiers de sortie d'analyse doivent être enregistrés dans la section Options d'analyse.</li>
			<li>Dans l'onglet Contrôle d'image, ouvrez l'une des images acquises à quantifier et sélectionnez le bouton Auto dans le coin supérieur droit.</li>
			<li>Dans la section Analyse d'array dans le coin inférieur droit, créez un modèle fiducial tel que l'instruction du logiciel.</li>
			<li>Cliquez sur l'analyse par lots , sélectionnez le dossier qui contient les images à quantifier, et sélectionnez le modèle fiducial qui a été créé dans l'étape précédente. Le logiciel analyse chaque image et quantifie l'intensité ponctuelle. REMARQUE : Cette étape générera un fichier .csv contenant des intensités ponctuelles quantifiant les anticorps dans chaque échantillon de sérum qui se lient à chaque antigène individuel sur le microarray qui peut par la suite être manipulé dans un logiciel de manipulation ou d'analyse de feuilles de calcul.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyser les données brutes pour comparer la liaison des anticorps entre les antigènes et les échantillons de sérum. Pour cette étude, les anticorps IgA et IgG mesurés à 585 nm et 800 nm d'intensités de taches fluorescentes ont été comparés à tous les antigènes entre 2 séries indépendantes de l'expérience à l'aide de diapositives différentes à différents jours, et l'analyse de corrélation a été effectuée pour mesurer la reproductibilité des mesures d'assay. REMARQUE : Pour les protéines non purifiées imprimées sous forme de mélange d'expression, l'analyse des données devrait commencer par une soustraction de fond d'un contrôle sans ADN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).</li><li>Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. 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Les auteurs n'ont pas de divulgations.

Le protocole de microarray d'antigène de grippe décrit ici est adaptable à n'importe quel projet qui exige l'analyse des réponses d'anticorps à beaucoup d'antigènes. La plate-forme de microarray peut être utilisée avec n'importe quel ensemble désiré d'antigènes protéiques exprimés dans n'importe quel système qui peut atteindre 0,1 mg/mL ou un rendement plus élevé avec ou sans purification comme décrit précédemment12. Si des antigènes protéiques non purifiés (p. ex., exprimés dans un système de transcription et de traduction in vitro) sont directement utilisés pour imprimer des microréseaux, des composants du système d'expression des protéines (p. ex. la lysate de La bactérie E. coli) devraient être ajoutés 1:10 pour bloquer le tampon utilisé pour dilution du sérum et des anticorps de contrôle de la qualité afin de bloquer les anticorps dirigés contre ces composants. Des configurations de diapositives sont disponibles avec un nombre plus faible de plus grands pads sur chaque diapositive pour accueillir un plus grand nombre d'antigènes par tableau. Pour cette étude, nous avons utilisé une imprimante de microarray GeneMachines OmniGrid 100 qui utilise des broches qui contactent directement la surface de la nitrocellulose pour déposer des taches sur le tableau. Bien que cette imprimante microarray ne soit plus disponible dans le commerce, d'autres imprimantes microarray disponibles dans le commerce peuvent être utilisées dans ce protocole, mais peuvent nécessiter des broches personnalisées (contact ou non) et un logiciel et devraient avoir une résolution ponctuelle suffisante. et la compatibilité avec les diapositives et l'imageur. Selon la réactivité du sérum, des dilutions de 1:50 à 1:400 peuvent être utilisées. Le tampon sans sérum peut être utilisé comme un contrôle négatif, tandis que les anticorps monoclonaux connus pour se lier à l'antigène peuvent être utilisés comme un contrôle positif.
Les utilisateurs doivent être conscients de quelques problèmes de dépannage. Le but du contrôle de la qualité à l'aide d'anticorps à l'étiquette His est de vérifier les antigènes pour lesquels l'impression n'a pas été réussie. Tous les endroits qui donnent systématiquement un signal faible dans le contrôle de la qualité de contrôle de plusieurs tableaux représentent probablement un antigène insuffisant imprimé. Les raisons possibles incluent l'agrégation ou la précipitation ou l'antigène dans la plaque source ou un mauvais contact entre la goupille d'impression et la glissière de microarray due à l'épaisseur variable du tampon de nitrocellulose. À ce stade, nous n'effectuons pas de normalisation d'essai basée sur les résultats quantitatifs du contrôle de la qualité, étant donné que la liaison détectée des anticorps anti-Ses peut être influencée par la disponibilité de cette balise, qui dépend de la conformation tridimensionnelle spécifique à chaque antigène.
Le microréseau d'antigène grippal offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles telles que l'ELISA et est complémentaire aux essais fonctionnels tels que HAI et MN. Le microréseau protéique de 16 tampons est une technologie d'épargnant d'échantillons qui a la capacité de mesurer simultanément les anticorps de plusieurs isotypes contre environ 300 antigènes à partir d'un sérum de 1 l. Le nombre d'antigènes peut être augmenté à des milliers en diminuant le nombre de tampons par diapositives. L'analyse multiplexée permet également au personnel d'épargner du temps et des ressources consommables, étant donné que des centaines de sérums peuvent être sondés pour les anticorps en 2 jours, et tous les matériaux autres que les toboggans et les réactifs sont réutilisables afin de ne pas générer de grandes quantités de déchets plastiques.
Bien que les imprimantes microarray ne soient pas largement distribuées, les diapositives microarray peuvent être imprimées à un endroit centralisé, puis transportées à l'utilisateur final pour sonder. Le seul équipement nécessaire pour sonder est l'imageur portable et peu coûteux. L'objectif de la diffusion de ce protocole est de rendre l'utilisation de cette technique plus répandue.
Les principales limites du microréseau d'antigène grippal sont l'incapacité de caractériser la fonction et la cinétique des anticorps détectés. Le microréseau détecte un ensemble polyclonal d'anticorps liants pour chaque antigène. Ces anticorps peuvent ou ne peuvent pas être fonctionnels en neutralisant le virus dans les essais DE HAI et MN. Cependant, les tests HAI et MN exigent une culture virale vivante avec le besoin associé d'installations spécialisées avec des armoires de biosécurité de haut niveau pour tester les anticorps contre les sous-types aviaires de la grippe, tandis que le microréseau protéique n'implique pas de virus vivants composants peuvent donc être utilisés dans n'importe quel laboratoire de base. En ce qui concerne la cinétique de liaison, une seule dilution de sérum sondée avec un tableau contenant une seule concentration de chaque antigène donne un seul point de données, ce qui représente un composite de quantité et d'affinité résumé sur tous les anticorps qui se lient à l'antigène . Pour résoudre complètement la cinétique de liaison antigène-anticorps, de multiples concentrations d'antigènes et/ou des dilutions en série du sérum sont nécessaires.
Malgré ces limites, le microréseau antigène grippal est un outil utile pour caractériser l'étendue des anticorps antigrippaux dans le paysage antigénique qui peuvent compléter les essais fonctionnels qui sont plus limités dans le débit et la disponibilité.

Le virus de l'influenza est responsable d'une perte de 20 millions d'années de vie par an par décès ou d'invalidité, dont 1% de tous les décès dans le monde chaque année, avec des impacts disproportionnés sur les personnes âgées et les populations dans les tropiques et les pays en développement1, 2,3. En plus de la charge de morbidité, l'émergence de nouvelles souches grippales par le biais d'un réassortiment génétique, soit naturellement dans des hôtes communs, soit artificiellement pour le bioterrorisme, pourrait conduire à des pandémies mondiales avec une propagation rapide et une létalité élevée. 4 ( en plus) , 5. Bien que de nombreux vaccins antigrippaux soient actuellement disponibles, leur efficacité est limitée par la spécificité du sous-type6, ce qui crée la nécessité de mettre au point des vaccins universels contre la grippe qui confèrent une immunité de longue durée contre plusieurs virus. souches7.
L'un des principaux défis à relever pour mettre au point des vaccins universels contre la grippe est la grande diversité antigénique entre les souches. La spécificité antigénique des vaccins actuels combinée à la variation antigénique des virus circulants crée un décalage entre les souches vaccinales et les souches en circulation. Cela confère un avantage évolutif favorisant une nouvelle dérive génétique des souches vaccinales pendant une épidémie, limitant souvent l'efficacité du vaccin à moins de 50%8,9. Une autre source d'inadéquation antigénique est les mutations virales adaptatives aux œufs générées lors de la fabrication du vaccin, qui conduisent à des anticorps qui se lient mal aux virus circulants10,11.
Pour surmonter ce défi de la grande diversité antigénique, il faudra de nouveaux outils de recherche pour caractériser l'étendue des réponses immunitaires préexistantes et obtenues selon des variantes antigéniques cliniquement pertinentes dans des échantillons de sérum et de muquage. Les méthodes actuellement disponibles, y compris l'inhibition de l'hémagglutination (IAH), la microneutralisation (MN) et l'ELISA traditionnelle, se limitent à détecter les anticorps contre une seule souche virale à la fois, de sorte que leur utilisation pour la détection de plusieurs isotypes d'anticorps contre plusieurs souches virales épuise rapidement les échantillons cliniques disponibles et les ressources de laboratoire. En outre, HAI et MN exigent une culture de virus vivant qui n'est disponible que dans des laboratoires spécialisés.
Les microréseaux protéiques, potentiellement constitués de jusqu'à des milliers d'antigènes imprimés sur des diapositives enduites de nitrocellulose, comme le montre la figure1, peuvent combler ce besoin12. Ces microréseaux peuvent être produits et sondés d'une manière à haut débit tout en consommant de petites quantités de spécimens cliniques pour déterminer les niveaux quantitatifs d'isotype/sous-type d'anticorps par rapport à chaque antigène individuel sur le tableau. Cette approche de la découverte d'antigènes a été appliquée au développement diagnostique et vaccinal contre de multiples pathogènes infectieux13. À ce jour, nous avons produit des microréseaux protéiques pour plus de 35 agents pathogènes, dont plus de 60 000 protéines exprimées au total, et nous les avons utilisées pour sonder plus de 30 000 sérums humains provenant d'individus infectés et contrôler. Une plate-forme d'imagerie portable récemment développée pour les diapositives microarray a rendu cette méthodologie plus accessible à l'utilisateur final14.
S'appuyant sur de nombreux travaux antérieurs de multiples contributeurs dans le domaine15,16,17,18,19, un microarray de protéines de la grippe a été récemment développé qui contient plus de 250 variantes antigéniques purifiées d'hémagglutinine (HA) avec la représentation des 18 sous-types12,20. En utilisant cette méthodologie, une infection grippale naturelle a été démontrée pour générer des anticorps IgG et IgA largement réactifs contre les sous-types phylogénétiquement liés à l'HA, tandis qu'une vaccination intramusculaire de la grippe n'a généré que des IgG spécifiques au sous-type. anticorps21. Cependant, l'ajout d'un adjuvant qui active les récepteurs à péage aux vaccins antigrippaux a été montré pour élargir la réponse des anticorps IgG obtenues à travers les sous-types de HA dans les études animales22.
Ce microarray est actuellement utilisé pour sonder le sérum recueilli à partir d'une étude de cohorte prospective d'étudiants qui ont été suivis pour l'infection grippale. Ici, la méthodologie du microréseau d'antigène de grippe avec la démonstration de la reproductibilité d'essai pour détecter des anticorps sous-spécifiques et cross-réactifs dans un sous-ensemble de spécimens de cette étude est rapportée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-pad nitrocellulose-coated glass slides</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>305016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x GVS FAST blocking buffer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10485356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayCam portable imager</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>400S</td>
			<td>Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>31800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBase 384-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>T-3037-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray pins</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>GMP2</td>
			<td>Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal poly-His antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniGrid 100 microarray printer</td>
			<td>GeneMachines</td>
			<td></td>
			<td>The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide chambers</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide clips</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>204838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide frames</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Q10111MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes

Le virus de l'influenza demeure une cause importante de mortalité dans le monde en raison de l'efficacité limitée des vaccins actuellement disponibles. L'un des principaux défis à relever pour la mise au point de vaccins universels contre la grippe est la grande diversité antigénique résultant de la dérive antigénique. Pour surmonter ce défi, il faut de nouveaux outils de recherche pour mesurer l'étendue des anticorps sériques dirigés contre de nombreuses souches virales à travers différents sous-types antigéniques. Ici, nous présentons un protocole pour analyser l'ampleur des anticorps sériques contre diverses souches de virus de l'influenza utilisant un microarray protéique des antigènes grippaux.
Ce microréseau d'antigène de grippe est construit en imprimant des antigènes purifiés d'hémagglutinine et de neuraminidase sur une membrane nitrocellulose-enduite utilisant une imprimante de microarray. Le sérum humain est incubé sur le microréseau pour lier les anticorps contre les antigènes grippaux. Des anticorps secondaires conjugués au point quantique sont utilisés pour détecter simultanément les anticorps IgG et IgA se liant à chaque antigène sur le microréseau. La liaison quantitative d'anticorps est mesurée comme intensité de fluorescence à l'aide d'un imageur portatif. Il est démontré que les résultats représentatifs démontrent la reproductibilité de l'analyse dans la mesure des anticorps antigrippaux sous-types et réactifs dans le sérum humain.
Par rapport aux méthodes traditionnelles telles que l'ELISA, le microréseau d'antigènes grippaux offre une approche multiplexée à haut débit capable de tester des centaines de sérums pour de multiples isotypes d'anticorps contre des centaines d'antigènes dans un court laps de temps, et a donc dans le développement de la sérosurveillance et des vaccins. Une limitation est l'incapacité de distinguer les anticorps contraignants des anticorps neutralisants.

Comme démonstration du protocole, le sérum de base a été évalué de 16 individus dans une étude de cohorte prospective des étudiants d'université a suivi pour l'infection de grippe sur le microarray d'antigène de grippe. Pour démontrer la reproductibilité d'essai, ces spécimens ont été sondés deux fois, sur différentes diapositives et différents jours.
Pour cette étude, les antigènes de la grippe purifiés contenant ses10 étiquettes ont été obtenus auprès d'un vendeur commercial (voir Tableau des matériaux)et de collaborateurs. Ces antigènes comprennent 251 antigènes HA totaux, avec 63 domaines globulaires de tête (HA1) et 186 protéines pleine longueur (HA0), y compris 96 protéines monomériques HA0 et 90 protéines trimisées HA0 contenant le domaine de trimerization fusionnée ("foldon")23. Une liste complète des antigènes et des contrôles utilisés dans cette étude est incluse dans le fichier supplémentaire. Pour cette étude, les anticorps secondaires utilisés étaient des IgG anti-humains de chèvre conjugués au point quantique émettant à 800 nm (GAH-IgG-Q800) et à la chèvre anti-humaine IgA conjuguée à l'émission de point quantique à 585 nm (GAH-IgA-Q585) pour la détection multiplex des anticorps IgG et IgA comme indiqué dans la figure 3. Les anticorps IgG et IgA se liant à différents sous-types et formes moléculaires d'antigènes de l'HA de la grippe ont été comparés pour le sérum obtenu à partir de la cohorte clinique décrite ci-dessus.
La carte thermique qui en résulte est indiquée à la figure 4 avec une représentation graphique dans la figure 5. Dans ces chiffres, seuls les sous-types cliniquement pertinents avec une forte représentation sur le tableau sont étiquetés pour économiser de l'espace, avec « ô » indiquant tous les sous-types restants de nombre plus élevé, et les sous-types mineurs ou moins bien représentés inclus dans les ordre (p. ex., H2 entre H1 et H3). Une liste complète des souches et des sous-types sur le tableau est incluse dans le fichier supplémentaire. Ces données démontrent que les anticorps du groupe de tête de l'HA sont spécifiques au sous-type avec une quantité élevée prévue d'anticorps à des souches cliniquement répandues (H1N1, H3N2 et B) et une faible quantité d'anticorps à d'autres souches. Cependant, les anticorps à l'ensemble ha, qui comprend le domaine de tige, sont plus inter-réactifs à travers les sous-types, et cet effet semble être augmenté lorsque l'ensemble HA est trimerisé. Ce résultat n'est pas inattendu, car l'ensemble de l'HA comprend la région de la tige, qui est fortement conservée entre les sous-types. Par conséquent, les anticorps contre des molécules entières d'HA provenant de sous-types non cliniques (p. ex., H5 et H7) représentent probablement des anticorps antiendiguers obtenus à l'origine contre des sous-types cliniques (p. ex., H1 et H3) qui réagissent de façon croisée avec les régions souches des autres sous-types HA. sur le tableau. Ce point illustre l'importance d'inclure à la fois la tête HA et la molécule entière HA sur le tableau pour distinguer entre les anticorps de la tête et les régions souches qui montrent différents profils de réactivité.
L'assay démontre une bonne reproductibilité à travers les pistes de sondage. La deuxième exécution montre des anticorps IgG légèrement inférieurs à travers toutes les souches, bien que le modèle entre les souches est cohérente. Cette légère diminution dans l'ensemble est probablement due à la variabilité de lot à lot dans l'anticorps secondaire, qui a été modifiée entre les courses pour IgG mais pas pour IgA. Ainsi, comme indiqué dans le protocole, il est recommandé d'utiliser le même lot de chaque anticorps secondaire pour toutes les expériences entre lesquelles la comparaison quantitative est prévue. Si différents lots d'anticorps sont nécessaires en raison d'un nombre élevé d'échantillons à tester, nous avons recommandé d'inclure des échantillons partagés entre les séries expérimentales avec différents lots d'anticorps pour permettre une comparaison quantitative avec la correction.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig1.jpg"> Figure 1 : Schéma de microréseau protéique. Chaque diapositive contient plusieurs plaquettes chacune avec un seul tableau, qui se compose de centaines d'antigènes imprimés sur des taches disposées dans une grille, avec chaque tache contenant un antigène adsorbed sur la topographie tridimensionnelle de la surface de nitrocellulose à laquelle les anticorps du sérum sont liés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig2.jpg"> Figure 2 : Schéma de l'impression et du protocole de sondage des microréseaux antigènes grippaux. De gauche à droite, le microarray est imprimé à l'aide de diapositives enduites de nitrocellulose, qui sont utilisées pour sonder les anticorps IgG et IgA à l'aide d'anticorps secondaires conjugués à points quantiques, avec des diapositives imageà l'aide d'un imageur portatif, et des résultats analysés pour générer une carte thermique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig3.jpg"> Figure 3 : Procédure d'attachement de la chambre de sondage à la diapositive de microarray. De A à F, la chambre de sondage est placée sur le dessus de la diapositive en bonne orientation, attachée à la diapositive à l'aide de clips horizontaux sur les côtés, et placée dans le plateau de sondage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig4.jpg"> Figure 4 : Résultats représentatifs du microréseau d'antigènes grippaux. Les cartes thermiques représentent des réponses d'anticorps spécifiques à l'antigène, chaque ligne représentant un seul antigène disposé par molécule, sous-type et souche, et chaque colonne représentant une course de sondage d'un seul spécimen, disposée par un isotype d'anticorps et exécuté (A, blanc 0, noir, 20000, rouge 40000 intensité de fluorescence). Les sous-types d'antigène comprenant tous les sous-types d'hémagglutinine de 1 à 18 et tous les sous-types de neuraminidase de 1 à 10 sont disposés verticalement et étiquetés sur la gauche. Une comparaison de l'intensité de fluorescence entre deux pistes démontre une bonne reproductibilité d'analyse par régression linéaire pour IgA (B) et IgG (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig5.jpg"> Figure 5 : Largeur des anticorps sériques mesurés sur le microréseau d'antigène grippal. Sérum IgA (A) et IgG (B) sont regroupés par des formes moléculaires HA et NA et des sous-types pour démontrer une grande spécificité des anticorps du groupe de tête HA pour les sous-types cliniques et une forte réactivité croisée des anticorps HA entiers et trimerisés l'inclusion de la région de tige. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Dossier supplémentaire : Liste des antigènes sur le microréseau antigène grippal. Le contenu est affiché pour les 324 taches du tableau, y compris les blancs, les fiducials, les contrôles (IgG humain et IgA et IgG et IgA anti-humains à 0,1 mg/mL et 0,3 mg/mL), et les antigènes avec des informations sur la source, la forme moléculaire, le sous-type et la souche. Les abréviations sont les suivantes: pour la source, Sino - Sino Biological Inc., FKL - Florian Krammer Laboratory; pour la forme moléculaire, HA1 - tête HA, HA0 - HA entier, HA2 - tige HA, NP - nucléoprotéine. Pour les antigènes provenant de Sino Biological Inc., les numéros de catalogue sont affichés; pour les antigènes provenant du laboratoire Krammer, les ID d'antigène sont répertoriés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/Supplementary_File.xlsm">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

Nous présentons un protocole pour l'utilisation d'un microarray protéique construit en imprimant des antigènes grippaux sur des lames enduites de nitrocellulose pour sonder simultanément le sérum pour plusieurs isotypes d'anticorps contre plus de 250 antigènes de différentes souches virales, permettant de mesurer l'étendue des anticorps sériques entre les sous-types de virus.

Utilisation d'un microréseau d'antigène de la grippe pour mesurer l'étendue des anticorps sériques à travers les sous-types de virus

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Le microrésexe antigène grippal permet de mesurer simultanément plusieurs isotypes d’anticorps contre plus de 300 souches de grippe à partir d’un petit volume d’échantillons de sang d’un seul microlitre. Le microarray facilite une mesure à haut débit de l’étendue des anticorps antigrippaux dans le paysage antigénique des souches grippales. En caractérisant les anticorps antigrippaux plus en détail que ce qui avait été possible auparavant, ce microrése peut aider à déterminer pourquoi certaines personnes développent une infection grippale et d’autres non.La technique du microrésexe antigène a été appliquée à 35 agents pathogènes différents dans notre laboratoire, permettant la mesure des anticorps contre 60 000 cibles antigènes et à partir de 50 000 échantillons de sérum prélevés dans des cas de maladies infectieuses et de contrôles sains dans le monde entier. Ayant enseigné cette technique par le biais d’ateliers en personne, nous avons constaté que la capacité de démontrer visuellement la technique est cruciale pour sa compréhension et sa performance. Al Jasinskas et Rafael De Assis, scientifiques de notre laboratoire, démontreront la procédure.Pour imprimer les antigènes à l’aide d’une imprimante microrésoré, sélectionnez une imprimante avec des broches de repérage de microrésorité à faible volume qui peuvent aspirer les antigènes à partir d’une plaque source de 384 puits dans le canal de l’échantillon et déposer les antigènes par contact direct et action capillaire sur des glissières en verre enduit de nitrocellulose de 16 tampons. Dans le logiciel d’impression, entrez le nombre de plaques d’échantillon qui seront utilisées dans le nombre de plaques boîte de texte et sélectionnez le type de plaque qui sera utilisé pour l’analyse. Sélectionnez une configuration d’épingle et réglez les décalages d’origine sur les distances entre l’origine de la diapositive et l’endroit où les broches d’impression commenceront à imprimer sur les diapositives.Sous l’onglet de conception du tableau, définissez la taille et la forme des tableaux et sélectionnez les paramètres pour la façon dont les broches d’impression ramasseront et distribueront les échantillons. Configurez les protocoles de nettoyage et de ballonnement des broches et définissez la séquence dans laquelle les blocs d’échantillon sont imprimés sur les diapositives. Le logiciel de tableau construira un fichier d’index de grille annoté pour décrire l’agencement des antigènes dans chaque microrésexe.Après avoir programmer le logiciel d’impression avec le protocole désiré, démarrez l’impression. Une fois terminé, placez des glissières de microrésoré non prouvées dans une boîte à l’épreuve de la lumière dans une armoire de dessiccator à température ambiante. Pour sonder sera pour les anticorps sur le microrése, utilisez des clips pour fixer les diapositives microarray côté pad vers le haut sur les chambres de sondage et placer les chambres dans les cadres.Soyez prudent lors de l’assemblage des glissières, car elles sont facilement cassées et vérifiez toute fuite après la réhydratation. Si nécessaire, démonter et remonter les glissières pour corriger les fuites. Réhydrater les diapositives avec 100 microlitres de tampon de blocage filtré par puits et diluer le sera à un rapport de un à 100 en 100 microlitres de tampon de blocage par échantillon.Ensuite, incubez les toboggans réhydratés de microarray et le sera dilué pendant 30 minutes à température ambiante et 100 à 250 rotations par minute sur un shaker orbital. À la fin de l’incubation, utilisez des pointes de pipette reliées à une ligne sous vide avec un flacon de collecte secondaire pour aspirer soigneusement le tampon bloquant du coin de chaque chambre sans toucher les coussinets et ajouter immédiatement le sera dilué aux coussinets sans laisser sécher les coussinets. Ensuite, placez les cadres couverts dans des plateaux contenant des serviettes en papier humide scellées pour maintenir l’humidité et incuber les cadres pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un shaker à bascule.Pour l’étiquetage des anticorps secondaires conjugués à points quantiques, aspirez soigneusement le sera comme il vient de le démontrer et rincez les diapositives avec trois lavages dans 100 microlitres de tampon TTBS frais par puits pendant cinq minutes chacun sur un shaker orbital. Les diapositives sont ensuite incubées avec un mélange d’anticorps secondaires conjugués à points quantiques, puis lavées trois fois comme décrit dans le protocole, en utilisant la même technique que ce qui vient d’être démontré. Après le dernier lavage, retirez soigneusement les glissières des chambres et rincez doucement les glissières à l’eau distillée double filtrée, puis placez chaque glissière dans un tube de 50 millilitres.Ensuite, séchez les glissières par centrifugation. Pour obtenir des images des diapositives de microréseau, allumez d’abord l’imageur portatif et placez soigneusement la diapositive pour être photographiée face vers le bas dans le support de diapositive dans la chambre d’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie et sous l’onglet configurer l’imageur, sélectionnez la configuration de diapositive appropriée.Sous l’onglet contrôle de l’image, sélectionnez le canal fluorescent approprié et ajustez les temps d’exposition et d’acquisition en fonction de la réactivité du sera. Ensuite, cliquez sur capture pour démarrer l’acquisition de l’image. À la fin de l’acquisition, utilisez les grilles orientées sur les marqueurs fiduciaux pour détecter les taches de tableau.Pour mesurer l’intensité de la tache, dans le panneau d’informations de fichier, téléchargez le fichier gal et spécifiez le dossier où les fichiers de sortie d’analyse doivent être enregistrés dans la section options d’analyse. Sous l’onglet contrôle de l’image, ouvrez l’une des images acquises pour les quantifier et sélectionnez automatiquement. Dans la section d’analyse de tableau, créez un modèle fiducial tel qu’indiqué par le logiciel.Cliquez sur l’analyse des lots pour sélectionner le dossier qui contient les images à quantifier et sélectionnez le modèle fiducial qui vient d’être créé. Le logiciel analysera chaque image et quantifiera l’intensité du spot. Ensuite, analyser les données brutes pour comparer la liaison anticorps entre les antigènes et à travers les spécimens de sérum.Dans cette étude représentative, les anticorps secondaires utilisés étaient l’IgG anti-humain de chèvre conjugué à l’émission quantique de points à 800 nanomètres et l’IgA anti-humain de chèvre conjugué à l’émission quantique de points à 585 nanomètres pour la détection multiplexe des anticorps IgG et IgA respectivement. Dans la carte thermique résultante, seuls les sous-types cliniquement pertinents avec une haute représentation ont été étiquetés pour économiser de l’espace avec le signe plus désignant tous les sous-types restants d’un nombre plus élevé. Le sérum IgA et l’IgG ont été regroupés par leurs formes moléculaires et sous-types d’hémagglutinine et de neuraminidase.Démontrer la grande spécificité des anticorps du groupe de tête d’hémagglutinine pour les sous-types cliniques et la réactivité croisée élevée de l’hémagglutinine entière et des anticorps triamerized entiers d’hémagglutinine avec l’inclusion de la région de stock. Les réponses aux anticorps grippaux mesurées sur le microrésexe peuvent être confirmées par des techniques traditionnelles, y compris l’inhibition de l’hémagglutination et les analyses de micronéutralisation. Cette technique a permis de mieux comprendre la spécificité des sous-types d’anticorps pour le groupe tête de la grippe et l’importance relative des anticorps IgA et IgG pour la susceptibilité grippale.Bien qu’aucun des matériaux ne soit extrêmement dangereux, tous les échantillons de sérum humain doivent être manipulés conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité.

Research

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d&#39;ADN pour la grippe

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Diagnostic rapide du virus de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages: L&#39;utilisation d&#39;un portable RT-PCR et lyophilisés réactifs dans le domaine

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...