Name: use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes
Uploaded: 2019-07-26T14:45:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes at JoVE.com

Авторы хотели бы признать профессора Дона Милтона (Институт прикладного общественного здравоохранения, Университет Штата Мэриленд, Колледж-Парк, MD, США) для сбора человеческой сыпи в соответствии с Университетом штата Мэриленд IRB протокол #313842 финансируется DARPA N66001-2-4015 P00001. Авторы также хотели бы отметить профессора Флориана Краммера (Icahn Школа медицины, Mt. Sinai, NY, США) за предоставление тримеризированных HA и NA антигенов, финансируемых ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. С. Хан частично поддерживается Национальным центром исследовательских ресурсов и Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения, через грант KL2 TR001416. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH.

<ol>
	<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).</li><li>Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+influenza+viral+infection+through+the+murine+respiratory+tract:+the+protective+role+of+sleep+deprivation.">Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation.</a> Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+Estimates+of+the+Impact+of+Influenza+on+Population+Mortality:+A+Systematic+Review.">Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review.</a> American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).</li><li>Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+and+pandemic+influenza+preparedness:+science+and+countermeasures.">Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures.</a> Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).</li><li>Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Variability+in+Reported+Mortality+for+Critical+Illness+during+the+2009-10+Influenza+A(H1N1)+Pandemic:+A+Systematic+Review+and+Meta-Regression+to+Guide+Reporting+of+Outcomes+during+Disease+Outbreaks.">Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks.</a> PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).</li><li>Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+preventing+influenza+in+healthy+adults.">Vaccines for preventing influenza in healthy adults.</a> Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).</li><li>Erbelding, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Universal+Influenza+Vaccine:+The+Strategic+Plan+for+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases.">A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3N2+Mismatch+of+2014-15+Northern+Hemisphere+Influenza+Vaccines+and+Head-to-head+Comparison+between+Human+and+Ferret+Antisera+derived+Antigenic+Maps.">H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps.</a> Scientific Reports. 5, 15279 (2015).</li><li>Tricco, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+influenza+vaccine+efficacy+against+mismatched+and+matched+strains:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC Medicine. 11, 153 (2013).</li><li>Katz, J. M., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+inactivated+influenza+A+virus+(H3N2)+vaccines+grown+in+mammalian+cells+or+embryonated+eggs.">Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs.</a> Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).</li><li>Zost, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+H3N2+influenza+viruses+have+a+glycosylation+site+that+alters+binding+of+antibodies+elicited+by+egg-adapted+vaccine+strains.">Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).</li><li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Liang, L., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+for+diagnostic+and+vaccine+antigen+discovery+in+tropical+infectious+diseases.">A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantum+dot+immunofluorescence+and+a+digital+CMOS+imaging+system+as+an+alternative+to+conventional+organic+fluorescence+dyes+and+laser+scanning+for+quantifying+protein+microarrays.">Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays.</a> Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).</li><li>Desbien, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high+density+hemagglutinin+protein+microarray+to+determine+the+breadth+of+influenza+antibody+responses.">Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses.</a> Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).</li><li>Mace, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free,+arrayed+sensing+of+immune+response+to+influenza+antigens.">Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens.</a> Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).</li><li>Koopmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+humoral+immune+responses+to+influenza+viruses+by+using+protein+microarray.">Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray.</a> Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).</li><li>Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiplex+Label-Free+Approach+to+Avian+Influenza+Surveillance+and+Serology.">A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology.</a> PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).</li><li>Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+influenza+virus+protein+microarray+to+measure+the+humoral+response+to+influenza+virus+infection+in+mallards.">Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards.</a> Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).</li><li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays.">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li><li>Nakajima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Microarray+Analysis+of+the+Specificity+and+Cross-Reactivity+of+Influenza+Virus+Hemagglutinin-Specific+Antibodies.">Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies.</a> mSphere. 3 (6), (2018).</li><li>Van Hoeven, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Formulated+TLR7/8+Agonist+is+a+Flexible,+Highly+Potent+and+Effective+Adjuvant+for+Pandemic+Influenza+Vaccines.">A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines.</a> Scientific Reports. 7, 46426 (2017).</li><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates.">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).</li></ol>

Авторы не раскрытии информации.

Описанный здесь протокол микрогенов антигена гриппа адаптируется к любому проекту, который требует анализа реакции антител на многие антигены. Платформа microarray может быть использована с любым желаемым набором белковых антигенов, выраженных в любой системе, которая может достичь 0,1 мг/мл или более высокой урожайности с или без очистки, как ранее описано12. Если неочищенные белковые антигены (например, выраженные в транскрипции и переводческой системе in vitro) непосредственно используются для печати микроаррей, компоненты системы экспрессии белка (например, E. coli lysate) должны быть добавлены 1:10 к блокированию буфера, используемого для разбавления серы и контроля качества антител для того, чтобы блокировать любые антитела, направленные против этих компонентов. Конфигурации слайдов доступны с меньшим количеством больших колодок на каждом слайде для размещения большего количества антигенов на массиве. Для этого исследования мы использовали принтер MicroArray OmniGrid 100 GeneMachines, который использует булавки, которые непосредственно контактируют с поверхностью нитроцеллюлозы, чтобы определить пятна на массиве. В то время как этот принтер microarray больше не является коммерчески доступным, другие коммерчески доступные принтеры microarray могут быть использованы в этом протоколе, но могут потребовать пользовательских контактов (либо контактных, либо бесконтактных) и программного обеспечения и должны иметь достаточное разрешение точек и совместимость со слайдами и изображением. В зависимости от реактивности серы можно использовать разбавления с 1:50 до 1:400. Безысывороточный буфер может быть использован в качестве отрицательного контроля, в то время как моноклональные антитела, известные связываться с антигеном, могут быть использованы в качестве положительного контроля.
Пользователи должны быть осведомлены о нескольких проблемах, связанных с устранением неполадок. Цель проверки качества с использованием антител к его тегу состоит в том, чтобы проверить наличие каких-либо антигенов, для которых печать не увенчалась успехом. Любые пятна, которые постоянно дают низкий сигнал в проверке контроля качества нескольких массивов, вероятно, представляют собой недостаточное количество напечатанных антигенов. Возможные причины включают агрегацию или осадки или антиген ажиотажа в исходной пластине или плохой контакт между печатью штифт и microarray слайд из-за переменной толщины нитроцеллюлозы площадку. На данный момент мы не выполняем нормализацию ассеа на основе количественных результатов проверки контроля качества, учитывая, что обнаруженная связка анти-Его антител может зависеть от наличия этого тега, который зависит от трехмерной конформации для каждого антигена.
Микроаррей антигена гриппа предоставляет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами, такими как ELISA, и дополняет функциональные ассы, такие как HAI и MN. 16-падового белка microarray является образцом-щадящий технологии с потенциалом для измерения антител нескольких изотипов одновременно против примерно 300 антигенов из 1 зл. Количество антигенов может быть увеличено до тысячи за счет уменьшения количества колодок на слайды. Мультиплексированный ассеион также экономит время персонала и расходные ресурсы, учитывая, что сотни сыпок можно исследовать на антитела за 2 дня, а все материалы, кроме слайдов и реагентов, воспламеняются, поэтому не генерируют большое количество пластиковых отходов.
В то время как принтеры microarray не могут быть широко распространены, слайды microarray могут быть напечатаны в централизованном месте, а затем транспортированы конечному пользователю для зондирования. Единственным оборудованием, необходимым для зондирования, является недорогой и портативный изображение. Цель распространения этого протокола состоит в том, чтобы сделать использование этого метода более распространенным.
Основными ограничениями микрократа антигена гриппа являются неспособность охарактеризовать функцию и кинетику выявленных антител. Микроаррей обнаруживает поликлональный набор связывающих антител для каждого антигена. Эти антитела могут или не могут быть функциональными в нейтрализации вируса в HAI и MN анализы. Тем не менее, HAI и MN анализы требуют живой культуры вируса с связанной потребностью в специализированных учреждениях с высоким уровнем биобезопасности шкафы для тестирования на антитела против птичьего подтипов гриппа, в то время как белок microarray не связаны живой вирус компоненты, так что могут быть использованы в любой основной лаборатории. Что касается связывающей кинетики, то одно разбавление сыворотки, проверенной массивом, содержащей одну концентрацию каждого антигена, дает единую точку данных, которая представляет собой составное количество и сродство, суммированное по всем антителам, которые связываются с антигеном . Для полной устранения антиген-антитела связывающей кинетики, несколько концентраций антигена и / или серийных разбавления сыпок не требуется.
Несмотря на эти ограничения, микроаррей антигена гриппа является полезным инструментом для характеристики широты антител гриппа по всему антигенному ландшафту, который может дополнять функциональные анализы, которые являются более ограниченными по пропускной связи и доступности.

Вирус гриппа является причиной потери 20 миллионов лет жизни ежегодно в результате смерти или инвалидности, в том числе 1% всех смертей во всем мире каждый год, с несоразмерным воздействием на пожилых людей и населения в тропиках и развивающемся мире1, 2,3. В дополнение к бремени болезней сезонных эпидемий, появление новых штаммов гриппа через генетический реассортимент либо естественным образом у общих хозяев, либо искусственно для биотерроризма может привести к пандемиям во всем мире с быстрым распространением и высокой летальностью 4 , 5. В то время как многочисленные вакцины противгриппа в настоящее время доступны, их эффективность ограничена подтипной спецификой 6, создавая необходимость разработки универсальных вакцин против гриппа, которые дают долгосрочный иммунитет против нескольких вирусов штаммов7.
Ключевой проблемой для разработки универсальных вакцин против гриппа является высокое антигенное разнообразие штаммов. Антигенная специфичность нынешних вакцин в сочетании с антигенной вариацией циркулирующих вирусов создает несоответствие между штаммами вакцин и циркулирующими штаммами. Это дает эволюционное преимущество в пользу дальнейшего генетического дрейфа от штаммов вакцины во время эпидемии, ограничивая эффективность вакцины часто менее 50%8,9. Дополнительным источником антигенного несоответствия является яйцеадативной вирусной мутации, порожденные при производстве вакцины, которые приводят к антителам, которые плохо связываются с циркулирующими вирусами10,11.
Преодоление этой проблемы высокого антигенного разнообразия потребует новых исследовательских инструментов для характеристики широты уже существующих и вызываемых иммунных реакций в клинически значимых антигенных вариантах в образцах сыворотки и слизистой оболочки. Имеющиеся в настоящее время методы, включая ингибирование гемагглютинации (HAI), микронейнейтаризация (MN) и традиционные ELISA, ограничиваются выявлением антител против одного штамма вируса одновременно, поэтому их использование для обнаружения нескольких изотипов антител против нескольких штаммов вируса быстро истощает имеющиеся клинические образцы и лабораторные ресурсы. Кроме того, HAI и MN требуют живой культуры вируса, которая доступна только в специализированных лабораториях.
Белковые микроаррей, потенциально состоящие из тысяч антигенов, напечатанных на слайдах с покрытием нитроцеллюлозы, как показано на рисунке 1, могут заполнить эту потребность12. Эти микроаррей могут быть произведены и исследованы в высокой пропускной форме, потребляя при этом небольшие количества клинического образца для определения количественных уровней изоттипа антитела/подтипа против каждого отдельного антигена на массиве. Этот подход к открытию антигена был применен к диагностической и вакцинной разработке против нескольких инфекционных патогенов13. На сегодняшний день мы произвели микроаррей для более чем 35 патогенных микроорганизмов, включая более 60 000 всего выраженных белков, и использовали их для исследования более 30 000 человеческих серот инфицированных и контролирующих лиц. Недавно разработанная портативная платформа изображений для слайдов microarray сделала эту методологию более доступной для конечных пользователей14.
Опираясь на обширную предыдущую работу нескольких участников в области15,16,17,18,19, микроаррей белка гриппа был недавно разработан, который содержит более 250 очищенных гемагглютинина (HA) антигенных вариантов с представлением всех 18 подтипов12,20. Используя эту методологию, естественная инфекция гриппа была продемонстрирована для создания широко реактивных igG и IgA антител против филогенетически связанных подтипов HA, в то время как внутримышечная вакцинация против гриппа генерируется только подтип-специфический IgG антитела21. Тем не менее, добавление адъювант, который активирует платных рецепторов к вакцинам против гриппа было показано, расширить вызвали IgG антитела ответ через ПОДтипы HA в исследованиях на животных22.
Этот microarray в настоящее время используется для зонда сера собраны из перспективных когортное исследование студентов колледжа, которые последовали за гриппом инфекции. Здесь сообщается о методологии микроаррэя антигена гриппа с демонстрацией воспроизводимости анализов для выявления подтиповых и кросс-реактивных антител в подмножестве образцов, полученных в ходе этого исследования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-pad nitrocellulose-coated glass slides</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>305016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x GVS FAST blocking buffer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10485356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayCam portable imager</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>400S</td>
			<td>Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>31800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBase 384-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>T-3037-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray pins</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>GMP2</td>
			<td>Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal poly-His antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniGrid 100 microarray printer</td>
			<td>GeneMachines</td>
			<td></td>
			<td>The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide chambers</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide clips</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>204838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide frames</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Q10111MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes

Вирус гриппа остается важной причиной смертности во всем мире из-за ограниченной эффективности имеющихся в настоящее время вакцин. Ключевой проблемой для разработки универсальных вакцин против гриппа является высокое антигенное разнообразие в результате антигенного дрейфа. Преодоление этой проблемы требует новых исследовательских инструментов для измерения широты антител сыворотки, направленных против многих штаммов вируса через различные антигенные подтипы. Здесь мы представляем протокол для анализа широты антител сыворотки от различных штаммов вируса гриппа с использованием белкового микроаррейя антигенов гриппа.
Этот микроар микроар антиген гриппа построен путем печати очищенных гемагглютинина и нейраминидазы антигенов на нитроцеллюлозы покрытием мембраны с помощью microarray принтера. Человеческая сера инкубируется на микроарле, чтобы связать антитела против антигенов гриппа. Квантовая точка-конъюгированные вторичные антитела используются для одновременного обнаружения igG и IgA антител, связывающих сяклет ы на каждый антиген на микроаре. Количественные связывания антител измеряется как интенсивность флуоресценции с помощью портативного изображения. Представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие воспроизводимость в измерении подтиповых и кросс-реактивных антител гриппа в человеческой сыпи.
По сравнению с традиционными методами, такими как ELISA, микроаррей антигена гриппа обеспечивает высокую пропускную способность мультиплексный подход, способный проверить сотни сыпок на несколько изотипов антител против сотен антигенов в короткие сроки, и, таким образом, имеет применения в сероэпциозном и разработке вакцин. Ограничением является неспособность отличить связывающие антитела от нейтрализующих антител.

В качестве демонстрации протокола, базовые сыпи были анализированы от 16 человек в рамках перспективного когортного исследования студентов колледжа следуют для гриппа инфекции на вирусно-вирусной вакцины против гриппа microarray. Чтобы продемонстрировать воспроизводимость, эти образцы были исследованы дважды, на разных слайдах и в разные дни.
Для этого исследования очищенные противогриппозные антигены, содержащиеего 10 тегов, были получены от коммерческого поставщика (см. ТаблицуМатериалов) и сотрудников. Эти антигены включают 251 всего HA антигенов, с 63 шаровой головы доменов (HA1) и 186 полнометражных белков (HA0), в том числе 96 мономерных белков HA0 и 90 тримеризированных HA0 белков, содержащих слитые тримеризации ("foldon") домен23. Полный список антигенов и элементов управления, используемых в данном исследовании, включен в качестве дополнительного файла. Для этого исследования, вторичные антитела, используемые были козы анти-человека IgG сопряжены с квантовой точкой, испускающей на 800 нм (GAH-IgG-No800) и коза анти-человека IgA сопряжены с квантовой точкой, излучающей на 585 нм (GAH-IgA-585) для мультиплексного обнаружения IgG и IgA антител как показано на рисунке 3. IgG и IgA связываются с различными подтипами и молекулярными формами антигенов гриппа HA были сравнены для серы, полученной из описанной выше клинической когорты.
Полученная тепловая карта показана на рисунке 4 с графическим представлением на рисунке 5. В этих цифрах, только клинически значимые подтипы с высоким представлением на массиве помечены, чтобы сэкономить место, с "Я", обозначающий все остальные подтипы более высокого числа, и незначительные или менее хорошо представлены подтипы включены в соответствии с заказом (например, H2 между H1 и H3). Полный список штаммов и подтипов на массиве включен в качестве дополнительного файла. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела к головной группе HA являются подтип-специфическими с ожидаемым большим количеством антител к клинически распространенным штаммам (H1N1, H3N2 и B) и низким количеством антител к другим штаммам. Тем не менее, антитела ко всему HA, который включает в себя домен стебля, являются более кросс-реактивными по подтипам, и этот эффект, как представляется, увеличивается, когда весь HA тримеретизирован. Этот результат не является неожиданным, так как весь HA включает в себя стволовые области, которая высоко сохраняется по подтипам. Таким образом, антитела к целым молекулам HA из неклинических подтипов (например, H5 и H7), вероятно, представляют собой антистволовые антитела, первоначально вырабатываемые против клинических подтипов (например, H1 и H3), которые перекрестно реагируют с стволовыми регионами других подтипов HA на массиве. Этот момент иллюстрирует важность включения как головной HA, так и целой молекулы HA на массиве, чтобы различать антитела к голове и стволовые области, которые показывают различные профили реактивности.
Ассес демонстрирует хорошую воспроизводимость через зондирующие трассы. Второй запуск показывает немного более низкие антитела IgG во всех штаммах, хотя картина между штаммами является последовательной. Это повсеместное небольшое снижение, вероятно, из-за вариативности партии к партии во вторичном антитела, который был изменен между работает для IgG, но не для IgA. Таким образом, как отмечается в протоколе, рекомендуется использовать одинаковую партию каждого вторичного антитела для любых экспериментов, между которыми планируется количественное сравнение. Если различные партии антител необходимы из-за большого количества образцов, которые будут протестированы, мы рекомендовали включить общие образцы между экспериментальными пробегами с различными партиями антител, чтобы обеспечить количественное сравнение с коррекцией.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig1.jpg"> Рисунок 1: Схема микроаррей белка. Каждый слайд содержит несколько колодок каждый с одним массивом, который состоит из сотен антигенов, напечатанных на пятна, расположенные в сетке, с каждым пятном, содержащим один антиген адсорбируется на трехмерной топографии поверхности нитроцеллюлозы, к которому антитела из сыворотки связаны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig2.jpg"> Рисунок 2: Схема гриппа антигена microarray печати и зондирования протокола. Слева направо, microarray печатается с помощью на нитроцеллюлозы покрытием слайды, которые используются для зонда сера для IgG и IgA антител с помощью квантовой точки конъюгированных вторичных антител, со слайдами, изображенными с помощью портативного изображения, и результаты проанализированы создать тепловую карту. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig3.jpg"> Рисунок 3: Процедура крепления зондирующей камеры к слайду microarray. От А до F, зондирующая камера помещается поверх слайда в правильной ориентации, прилагается к слайду с помощью горизонтальных зажимов по бокам, и помещается в зондирующий лоток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig4.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативные результаты микроаррэя антигена гриппа. Тепловые карты представляют антиген-специфические ответы антител, с каждой строки, представляющих один антиген расположен молекулы, подтип, и деформации, и каждый столбец, представляющий зондирующий пробег одного образца, организованный изотипом антител и запустить (A, белый й 0, черный й 20000, красный й 40000 интенсивность флуоресценции). Подтипы антигена, включающая все подтипы гемагглютинина от 1 до 18 и все подтипы нейраминидаза от 1 до 10 расположены вертикально и помечены слева. Сравнение интенсивности флуоресценции между двумя трассами демонстрирует хорошую воспроизводимость полинейной регрессии для IgA (B) и IgG (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig5.jpg"> Рисунок 5: Хлеб антител сыворотки, измеренных на микроаре антигена гриппа. Сыворотка IgA (A) и IgG (B) сгруппированы по HA и NA молекулярных форм и подтипов, чтобы продемонстрировать высокую специфичность HA головной группы антител для клинических подтипов и высокой поперечной реактивности всего HA и тримеризированных целых антител HA с включения сталкового региона. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительный файл: Список антигенов на микроаррей антигена гриппа. Содержимое отображается для всех 324 пятен на массиве, включая пробелы, фидуциалы, элементы управления (человеческие IgG и IgA и анти-человеческие IgG и IgA на 0,1 мг/мл и 0,3 мг/мл), а также антигены с информацией об источнике, молекулярной форме, подтипе и деформации. Аббревиазации являются следующими: для источника, Sino sino Biological Inc., FKL и Флориан Краммер лаборатории; для молекулярной формы, HA1 - голова HA, HA0 - целый HA, HA2 - стебель HA, NP - нуклеопротеин. Для антигенов, полученных из Sino Biological Inc., отображаются номера каталогов; для антигенов, полученных из лаборатории Краммер, антиген иди перечислены. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/Supplementary_File.xlsm">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes at JoVE.com

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

Мы представляем протокол для использования белка microarray построен путем печати антигенов гриппа на нитроцеллюлозы покрытием слайды одновременно зонд сыворотки для нескольких изотипов антител против более чем 250 антигенов из различных штаммов вируса, таким образом, позволяет измерять широту антител сыворотки через вирусные подтипы.

Использование противовоздушного антигена Microarray для измерения широты сывороточных антител через вирус подтипы

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

Микроаррей антигена гриппа позволяет одновременно измерять несколько изотипов антител против более чем 300 штаммов гриппа из небольшого объема образца крови всего одного микролитора. Микроаррей облегчает высокопропутное измерение широты антител к гриппу в антигенном ландшафте штаммов гриппа. Характеризовав антитела гриппа более подробно, чем это было возможно ранее, этот микроаррей может помочь определить, почему у некоторых людей развивается инфекция гриппа, а у других нет.Метод антигенного микроаррея был применен к 35 различным патогенам в нашей лаборатории, что позволяет измерять антитела против 60 000 антигенных мишеней и от 50 000 образцов сыворотки, собранных из случаев инфекционных заболеваний и здорового контроля во всем мире. Обустив эту технику через сша семинары, мы обнаружили, что возможность визуально продемонстрировать технику имеет решающее значение для ее понимания и производительности. Демонстрацией процедуры будут Аль-Ясинскас и Рафаэль де Ассис, ученые проекта из нашей лаборатории.Для печати антигенов с помощью принтера microarray, выберите принтер с низким объемом microarray кровянистые пятна булавки, которые могут аспирировать антигены из 384-хорошо источник пластины в образец канала и депозит антигенов через прямой контакт и капиллярное действие на 16 площадку нитроцеллюлозы покрытием стеклянные слайды. В программном обеспечении для печати введите количество образцов пластин, которые будут использоваться в номере текстового ящика пластин, и выберите тип пластины, который будет использоваться для анализа. Выберите конфигурацию пин-кода и установите происхождение смещения на расстояния между происхождением слайда и местом, где печатные штыри начнут печатать на слайдах.В соответствии с вкладкой проектирования массива определите размер и форму массивов и выберите параметры того, как печатные штыри будут подбирать и распределять образцы. Настройте протоколы очистки штыря и определения последовательности, в которой блоки образца печатаются на слайдах. Программное обеспечение массива будет строить аннотированный файл индекса сетки, чтобы описать расположение антигенов в каждом микроармей.После программирования печатного программного обеспечения с желаемым протоколом, запустите тираж. После завершения, место unprobed microarray слайды в светозащитной коробке в desiccator шкаф при комнатной температуре. Чтобы исследовать серу для антител на microarray, используйте клипы, чтобы прикрепить microarray слайды площадку сторону вверх на зондирующие камеры и поместить камеры в кадрах.Будьте осторожны при сборке слайдов, так как они легко ломаются и проверяют на наличие утечек после регидратации. При необходимости разобрать и собрать слайды, чтобы исправить утечки. Увлажнить слайды 100 микролитров фильтрованного блокирующего буфера на колодец и разбавить серу в соотношении 1 к 100 в 100 микролитров блокирующего буфера на образец.Затем инкубировать регидратированные микросхемы и разбавленную сыворотку в течение 30 минут при комнатной температуре и от 100 до 250 вращений в минуту на орбитальном шейкере. В конце инкубации используйте наконечники пипеток, подключенные к вакуумной линии со вторичной колбой для сбора, чтобы тщательно аспирировать блокирующий буфер из угла каждой камеры, не касаясь колодок, и немедленно добавить разбавленную сыворотку в прокладки, не позволяя прокладкам высохнуть. Затем поместите покрытые рамы в лотки, содержащие влажные бумажные полотенца запечатаны для поддержания влажности и инкубировать кадры на ночь при четырех градусах по Цельсию на качалке.Для квантовой точки конъюгированных вторичных антител маркировки, тщательно аспирировать сыворотки, как только что продемонстрировали и промыть слайды с тремя моет в 100 микролитров свежего буфера TTBS на колодец в течение пяти минут каждый на орбитальной шейкер. Слайды затем инкубируется смесью квантовой точки, спрягают вторичные антитела, а затем промывают три раза, как описано в протоколе, используя ту же технику, что и только что продемонстрировано. После последней стирки аккуратно удалите горки из камер и аккуратно промойте горки фильтрованной двойной дистиллированной водой, а затем поместите каждую горку в 50-миллилитровую трубку.Затем высушите горки центрифугой. Чтобы получить изображения слайдов microarray, сначала включите портативный образец и аккуратно поместите слайд, который будет изображен лицом вниз, в держатель слайда в камере визуализации. Откройте программное обеспечение для визуализации и под вкладкой configure Imager выберите соответствующую конфигурацию слайдов.Под вкладкой управления изображением выберите соответствующий флуоресцентный канал и отрегулируйте время экспозиции и приобретения в зависимости от реактивности сыворотки. Затем нажмите захват, чтобы начать получение изображения. В конце приобретения используйте сетки, ориентированные на фидуциальные маркеры, для обнаружения пятен массива.Чтобы измерить интенсивность пятна, в панели файловой информации загрузите файл gal и укажите папку, где выводные файлы анализа должны быть сохранены в разделе вариантов анализа. Под вкладкой управления изображением откройте одно из приобретенных изображений для количественной оценки и выберите автоматическое. В разделе анализа массивов создайте фидуциальный шаблон в соответствии с инструкциями программного обеспечения.Нажмите пакетный анализ, чтобы выбрать папку, которая содержит изображения, которые будут количественно и выбрать fiducial шаблон, который только что был создан. Программное обеспечение будет анализировать каждое изображение и количественно интенсивности пятна. Затем проанализируйте необработанные данные, чтобы сравнить связывание антител между антигенами и образцами сыворотки.В этом репрезентативном исследовании, вторичные антитела, используемые были Коза анти-человеческой IgG спряженных квантовой точкой, излучающей на 800 нанометров и Коза анти-человеческого IgA спряженных квантовой точкой, излучающей на 585 нанометров для мультиплексного обнаружения igG и IgA антител соответственно. В результирующей тепловой карте были помечены только клинически значимые подтипы с высоким представлением, чтобы сэкономить место со знаком плюс, обозначающим все остальные подтипы большего числа. Сыворотка IgA и IgG были сгруппированы по их гемагглютинин и нейраминидазы молекулярных форм и подтипов.Продемонстрировать высокую специфичность антител головной группы гемагглютинина для клинических подтипов и высокую перекрестную реактивность цельного гемагглютинина и триамеризированных целых антител гемагглютинина с включением региона запасов. Реакция антител гриппа, измеренная на микроаррее, может быть подтверждена традиционными методами, включая ингибирование гемагглютинации и анализ микронейтрализации. Этот метод дает представление о специфике подтипа антител к группе голов гриппа и относительной важности антител IgA и IgG к восприимчивости к гриппу.Хотя ни одно из материалов не является чрезвычайно опасным, все образцы сыворотки человека должны обрабатываться в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Использование изображений Биолюминесцентный по расследованию синергизм между Пневмококк И вируса гриппа А в младенческой Мыши

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX Колориметрические обнаружения на ДНК-микрочипов по гриппу

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Экспресс-диагностики вируса птичьего гриппа у диких птиц: Использование портативных-ПЦР и сублимированные реагенты в поле

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Носовые салфетки для гриппа обнаружения вируса и изоляции от свиного

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Миниатюризированное Glycan Microarray Анализ для оценки авидности и специфичность вируса гриппа А агглютинины

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...