Name: use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes
Uploaded: 2019-07-26T14:45:00
Duration: 8 min 52 s
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Los autores quieren reconocer al Prof. Don Milton (Instituto de Salud Pública Aplicada, Universidad de Maryland, College Park, MD, EE.UU.) por recolectar el suero humano bajo el protocolo IRB de la Universidad de Maryland #313842 financiado por DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Los autores también quisieran reconocer al Prof. Florian Krammer (Icahn School of Medicine, Mt. Sinai, NY, USA) por proporcionar antígenos HA y NA recortados financiados por ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan cuenta con el apoyo parcial del Centro Nacional de Recursos de Investigación y el Centro Nacional de Promoción de las Ciencias Traslacionales, Institutos Nacionales de Salud, a través de la subvención KL2 TR001416. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

Todos los sueros humanos se manejan y eliminan de acuerdo con los protocolos institucionales aprobados para la bioseguridad con el uso de equipos personales de protección. Todo el personal de laboratorio que participa en este protocolo ha recibido formación en bioseguridad y ética de la investigación.
1. Producir microarrays de antígeno antigripal
<ol><li>
Diseñar y obtener un conjunto de antígenos para microarray
	<ol>
<li>Obtener antígenos proteicos expresados y purificados como polvo liofilizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imprimir antígenos en diapositivas de microarray
	<ol>
<li>Reconstituir cada antígeno liofilizado a una concentración de 0,1 mg/ml en solución salina con fosfato (PBS) con 0,001% de Tween-20 (T-PBS). Transfiera 10 ml de cada antígeno reconstituido a pozos individuales de una placa plana de 384 pocillos sin tratar.</li>
		<li>Imprima antígenos utilizando una impresora de microarray (la impresora de microarray utilizada en este estudio ya no está disponible comercialmente, véase Discusión) con pasadores de detección de microarray de bajo volumen que aspiran antígeno en el canal de muestra y depositan a través de contacto y acción capilar en diapositivas de vidrio recubiertos de nitrocelulosa de 16 pads.<ol>
<li>Programe el software de impresión (por ejemplo, Gridder) con la configuración de la placa de origen y los parámetros de impresión.<ol>
<li>Utilice el menú desplegable para seleccionar el nombre del tipo de placa que se utilizará con este método de impresión. Para este estudio, utilice una placa plana de fondo plana de 384 pocillos sin tratar.</li>
				<li>Seleccione el cuadro de texto junto a Número de placas y escriba el número de placas de muestra que se utilizarán en este protocolo de impresión. Para este estudio, utilice 1 placa.</li>
				<li>Seleccione una configuración de pin para utilizarcon este método. Para este estudio, utilice una configuración de 8 pines.</li>
				<li>Asegúrese de que los desfases de origen sean las distancias (en las direcciones X e Y) entre el origen de la diapositiva (que está calibrado en la sección Administrativa) y la ubicación donde los pines de impresión comenzarán a imprimir se imprimirán en las diapositivas.</li>
				<li>Mediante la pestaña Diseño de matriz, defina el tamaño y la forma de las matrices (espaciado de puntos y número de puntos por subbarra). Para este estudio, imprima 324 puntos (180 m de diámetro con un espaciado de 300 m) en diapositivas de 16 pads en un formato de 18x18 utilizando 8 pines.</li>
				<li>Seleccione los parámetros de cómo los pines de impresión recogen y dispensan muestras. Para este estudio, cada pasador aspira 250 nL de solución de antígeno e imprime 1 nL en cada uno de 40 puntos (total de 20 diapositivas para los 8 pines)</li>
				<li>Configure el protocolo de limpieza de pines y el protocolo de hincha. Para este estudio, cada pin imprime antígeno, se sumerge en ddHestéril 2O en recipiente de lavado sonicado, y luego aspira el siguiente antígeno.</li>
				<li>Defina la secuencia en la que se imprimen los bloques de muestra en las diapositivas. El software de matriz construirá un archivo de índice de cuadrícula anotado (.gal) para describir la disposición de los antígenos dentro de cada microarray. NOTA: La fila superior se utiliza para fiduciales (con fluorescencia en todas las longitudes de onda utilizadas en imágenes, por ejemplo, mezcla de conjugado de estripavidina Qdot 585 nm y conjugado de estripavidina Qdot 800 nm en este estudio) para orientar las rejillas durante la toma de imágenes. Para tiradas de impresión largas, los antígenos de la placa de origen se pueden volver a suspender periódicamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego centrifugando, o se puede preparar y utilizar una nueva placa de origen.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque las guías de microarray sin sondear en una caja a prueba de luz y guárdelas en un armario de secador a temperatura ambiente para un almacenamiento a largo plazo. NOTA: El protocolo puede estar en pausa indefinidamente en este momento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar comprobación de control de calidad (requiere etiquetas de polihistidina)
	<ol>
<li>Fije la diapositiva a las cámaras de sondeo y rehidrate con tampón de bloqueo como se describe en el paso 2.1.1-2.1.2 y se muestra en la Figura2.</li>
		<li>Diluir el ratón monoclonal poli-Su anticuerpo 1:100 en búfer de bloqueo 1x filtrado. NOTA: Si los antígenos proteicos no purificados (por ejemplo, expresados en el sistema de transcripción y traducción in vitro) se utilizan directamente para imprimir microarrays, agregue componentes del sistema de expresión de proteínas (por ejemplo, E. coli lysate) en una proporción de 1:10 con la tampón de bloqueo utilizado para la dilución sérica con el fin de bloquear cualquier anticuerpo dirigido contra estos componentes.</li>
		<li>Añadir 100 l de anticuerpo poli-His diluido a cada cámara deslizante que contenga almohadilla de matriz después de la aspiración e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC en la coctelera. Lave 3 veces con el tampón T-TBS como se describe en el paso 2.2.1. Diluir biotina conjugada anti-ratón anticuerpo secundario IgG 1:200 en tampón de bloqueo, añadir 100 ol por pozo después de la aspiración, e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la coctelera. Lave 3 veces con tampón T-TBS.</li>
		<li>Diluir Qdot 585 nm estreptavidina conjugado a 4 nM en tampón de bloqueo, añadir 100 ol por pozo después de la aspiración, e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en la coctelera. Lave 3 veces con tampón T-TBS y, a continuación, una vez con tampón TBS (sin Tween).</li>
		<li>Desmontar y cuantificar diapositivas como se describe en el paso 2.2.5 – 3.1.2. NOTA: Los antígenos proteicos deben contener sus10 etiquetas para utilizar este protocolo de control de calidad. Alternativamente, si se incluye una etiqueta diferente, la comprobación de control de calidad se puede realizar con anticuerpos o ligando para esa etiqueta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sueros de sonda para anticuerpos antigripales utilizando microarrays
<ol><li>
Incubar sueros en microarrays para la unión de anticuerpos
	<ol>
<li>Adjunte diapositivas de microarray a las cámaras utilizando clips y colóquelas en marcos como se muestra en la Figura3. NOTA: Evite siempre tocar la almohadilla de microarray con las manos y los instrumentos. Asegúrese de que las diapositivas estén orientadas con el lado del pad hacia arriba y la pequeña muesca en la esquina superior derecha.</li>
		<li>Rehidrate las correderas de microarray con 100 ml por pozo de tampón de bloqueo filtrado 1x, y diluye el suero 1:100 en 100 ml de tampón de bloqueo (puede utilizar placas de 96 pocillos no tratadas o tubos de 2 ml). Incubar ambos portaobjetos rehidratados en marcos cubiertos y sueros diluidos por separado durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitador orbital a 100-250 rpm. Realice todos los pasos de incubación posteriores de forma similar en la coctelera. NOTA: Sera debe ser alícuota y congelado a -80 oC para el almacenamiento a largo plazo para minimizar los ciclos de congelación-descongelación y debe ser voloindicado para mezclar y centrifugar para eliminar las partículas antes de su uso. Observe las cámaras deslizantes cuidadosamente durante y después de este paso para detectar cualquier fuga que requiera volver a montar las cámaras deslizantes.</li>
		<li>Usando puntas de pipeta conectadas a una línea de vacío con matraz de recogida secundario, aspirar cuidadosamente el tampón de bloqueo de la esquina de cada cámara sin tocar almohadillas. Realice todos los pasos de aspiración subsiguientes de forma similar. Agregue los sueros diluidos a las almohadillas rápidamente después de la aspiración para no permitir que las almohadillas se sequen.</li>
		<li>Coloque los marcos cubiertos en bandejas dentro de un recipiente secundario rodeado de toallas de papel húmedas y sellados para evitar la evaporación. Incubar durante la noche a 4oC en la coctelera mecedora (alternativamente, puede incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en la coctelera orbital a 100-250 rpm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anticuerpos séricos enlazados a etiquetas con anticuerpos secundarios conjugados por puntos cuánticos
	<ol>
<li>Aspirar sueros de las cámaras cuidadosamente como se describió anteriormente, añadir 100 l por pozo de tampón T-TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20 en ddH 2 O ajustado a pH 7.5 y filtrado, se puede obtener comercialmente), y se puede incubar durante 5 minutos en agitador orbital en pDH 2 O ajustado a pH 7.5 y filtrado, se puede obtener comercialmente), y se puede incubar durante 5 minutos en agitador orbital en pDH 2 O ajustado a pH 7.5 y filtrado, se puede obtener comercialmente), y se puede incubar durante 5 minutos en agitador orbital en pDH2O ajustado a pH 7.5 y filtrado, se puede obtener comercialmente), y se puede incubar durante 5 minutos en agitador orbital 100-250 rpm. Repita este paso de lavado un total de 3x (todos los pasos de lavado posteriores se realizan de forma similar).</li>
		<li>Preparar la mezcla de anticuerpos secundarios diluidos a 1 m en tampón de bloqueo y mezclar bien pipeteando antes y durante el uso para mantener la homogeneidad. NOTA: Para mantener la reproducibilidad del ensayo, se debe utilizar el mismo lote de cada anticuerpo secundario para todos los experimentos de sondeo para los que se planifica la comparación cuantitativa de datos entre experimentos. La concentración específica de anticuerpos secundarios puede necesitar variar dependiendo de la afinidad; seguir los protocolos del fabricante siempre que estédisponible.</li>
		<li>Aspirar el tampón de las cámaras después del lavado final, añadir 100 ml por pozo de mezcla secundaria de anticuerpos e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en la coctelera.</li>
		<li>La mezcla secundaria de anticuerpos de aspirar lave 3 veces con tampón T-TBS y, a continuación, lave una vez con el tampón TBS (sin Tween).</li>
		<li>El microarray desmble se desliza de las cámaras con cuidado para evitar tocar las almohadillas, enjuagar suavemente con ddH2O filtrado y secar colocando en tubos de 50 ml y centrifugando a 500 x g durante 10 minutos.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos de microarray en una caja a prueba de luz y guárdelos en un armario de secador a temperatura ambiente para un almacenamiento a largo plazo. NOTA: El protocolo puede estar en pausa durante un máximo de 1 semana en este momento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cuantificar la unión de anticuerpos a antígenos dentro del microarray
<ol><li>
Visualice diapositivas de microarray y cuantifique la intensidad de la fluorescencia puntual para medir la unión a anticuerpos
	<ol>
<li>Adquiera imágenes de diapositivas de microarray utilizando el imager portátil con software incorporado.<ol>
<li>En la pestaña Configurar generador de imágenes, seleccione la configuración de diapositiva adecuada. Para este estudio, utilice diapositivas de 16 pads.</li>
			<li>En la pestaña Control de imagen, seleccione el canal fluorescente adecuado y ajuste la ganancia, el tiempo de exposición y el tiempo de adquisición en función de la reactividad del suero para obtener imágenes óptimas. Para este estudio, los canales fluorescentes para IgA e IgG fueron 585 nm y 800 nm respectivamente, y los ajustes de imagen fueron ganancias de 50, tiempo de exposición de 500 ms, y tiempo de adquisición de 1 s.</li>
			<li>Haga clic en Capturar para iniciar el proceso de adquisición de la imagen. NOTA: Las diapositivas de microarray se pueden volver a crear imágenes en varios ajustes sin degradación de la señal, siempre y cuando se almacenen oscuras y secas. Se pueden utilizar otros sistemas de imágenes si son compatibles con las diapositivas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detecte puntos de matriz utilizando cuadrículas orientadas en función de los marcadores fiduciarios y mida la intensidad de los puntos como mediana de intensidad de píxeles menos fondo medido alrededor de los puntos. Realice este algoritmo de cuantificación por lotes utilizando el software de imagen integrado, que utiliza el archivo .gal construido en el paso 1.2.2 para conectar intensidades puntuales a antígenos individuales en cada microarray.<ol>
<li>En el panel Información de archivo, cargue el archivo .gal seleccionando desde su carpeta en el equipo y especifique la carpeta donde se guardarán los archivos de salida del análisis en la sección Opciones de análisis.</li>
			<li>En la pestaña Control de imagen, abra una de las imágenes adquiridas que se van a cuantificar y seleccione el botón Automático en la esquina superior derecha.</li>
			<li>En la sección Análisis de matriz en la esquina inferior derecha, cree una plantilla fiducial según las instrucciones del software.</li>
			<li>Haga clic en Análisis por lotes, seleccione la carpeta que contiene las imágenes que desea cuantificar y seleccione la plantilla fiducial que se creó en el paso anterior. El software analiza cada imagen y cuantifica la intensidad del punto. NOTA: Este paso generará un archivo .csv que contiene intensidades puntuales que cuantifican anticuerpos dentro de cada muestra sérica que se unen a cada antígeno individual en el microarray que posteriormente se pueden manipular en software de manipulación o análisis de hojas de cálculo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analice los datos sin procesar para comparar la unión de anticuerpos entre antígenos y entre muestras séricas. Para este estudio, los anticuerpos IgA e IgG medidos como intensidades de punto fluorescente de 585 nm y 800 nm se compararon en todos los antígenos entre 2 corridas independientes del experimento utilizando diferentes diapositivas en diferentes días, y se realizó un análisis de correlación para medir la reproducibilidad del ensayo. NOTA: Para las proteínas no purificadas impresas como mezcla de expresión, el análisis de datos debe comenzar con la resta de fondo de un control sin ADN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disability-adjusted+life+years+(DALYs)+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).</li><li>Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. 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Los autores no tienen revelaciones.

El protocolo de microarray de antígeno de la gripe descrito aquí es adaptable a cualquier proyecto que requiera analizar las respuestas de anticuerpos a muchos antígenos. La plataforma de microarray se puede utilizar con cualquier conjunto deseado de antígenos proteicos expresados en cualquier sistema que pueda alcanzar 0,1 mg/ml o un mayor rendimiento con o sin purificación como se describió anteriormente12. Si los antígenos proteicos no purificados (por ejemplo, expresados en el sistema de transcripción y traducción in vitro) se utilizan directamente para imprimir microarrays, los componentes del sistema de expresión de proteínas (por ejemplo, E. coli lysate) deben añadirse 1:10 al tampón de bloqueo utilizado para dilución de sueros y anticuerpos de control de calidad con el fin de bloquear cualquier anticuerpo dirigido contra estos componentes. Las configuraciones de diapositivas están disponibles con un menor número de almohadillas más grandes en cada diapositiva para acomodar un mayor número de antígenos por matriz. Para este estudio, utilizamos una impresora de microarray GeneMachines OmniGrid 100 que utiliza pines que contactan directamente con la superficie de nitrocelulosa para depositar puntos en la matriz. Si bien esta impresora de microarray ya no está disponible comercialmente, otras impresoras de microarray disponibles comercialmente se pueden utilizar en este protocolo, pero pueden requerir pines personalizados (ya sea contacto o sin contacto) y software y deben tener suficiente resolución de punto y compatibilidad con diapositivas e imágenes. Dependiendo de la reactividad de los sueros, se pueden utilizar diluciones de 1:50 a 1:400. El tampón libre de suero se puede utilizar como un control negativo, mientras que los anticuerpos monoclonales conocidos por unirse al antígeno se pueden utilizar como un control positivo.
Los usuarios deben tener en cuenta algunos problemas de solución de problemas. El propósito de la comprobación de control de calidad utilizando anticuerpos contra la etiqueta His es comprobar si hay antígenos para los que la impresión no se realizó correctamente. Cualquier punto que constantemente dé una señal baja en la comprobación de control de calidad de múltiples matrices probablemente represente un antígeno insuficiente impreso. Las posibles razones incluyen agregación o precipitación o antígeno en la placa fuente o un contacto deficiente entre el pasador de impresión y la diapositiva de microarray debido al espesor variable de la almohadilla de nitrocelulosa. En este punto, no realizamos la normalización del ensayo basada en resultados cuantitativos de la verificación del control de calidad, dado que la unión detectada de anticuerpos anti-Sus puede verse influenciada por la disponibilidad de esta etiqueta, que depende de la conformación tridimensional específico según el antígeno.
El microarray antigripal proporciona varias ventajas sobre métodos tradicionales como ELISA y es complementario a ensayos funcionales como HAI y MN. El microarray proteico de 16 pads es una tecnología ahorradora de muestras con capacidad para medir anticuerpos de múltiples isotipos simultáneamente contra aproximadamente 300 antígenos a partir de 1 l de suero. El número de antígenos se puede aumentar a miles disminuyendo el número de almohadillas por diapositivas. El ensayo multiplexado también ahorra tiempo al personal y recursos consumibles, dado que cientos de sueros pueden ser sondeados para anticuerpos en 2 días, y todos los materiales que no sean portaobjetos y reactivos son reutilizables, por lo que no generan grandes cantidades de residuos plásticos.
Mientras que las impresoras de microarray pueden no ser ampliamente distribuidas, las diapositivas de microarray pueden imprimirse en una ubicación centralizada y luego transportarse al usuario final para el sondeo. El único equipo necesario para sondear es el imager portátil y de bajo costo. El objetivo de la difusión de este protocolo es hacer que la utilización de esta técnica sea más extendida.
Las principales limitaciones del microarray antigripal son la incapacidad de caracterizar la función y la cinética de los anticuerpos detectados. El microarray detecta un conjunto policlonal de anticuerpos de unión para cada antígeno. Estos anticuerpos pueden o no ser funcionales en la neutralización del virus en los ensayos de HAI y MN. Sin embargo, los ensayos HAI y MN requieren un cultivo vivo de virus con necesidad asociada de instalaciones especializadas con gabinetes de bioseguridad de alto nivel para detectar anticuerpos contra los subtipos de gripe aviar, mientras que el microarray de proteínas no implica virus vivos componentes para que puedan ser utilizados en cualquier laboratorio básico. Con respecto a la cinética de unión, una sola dilución del suero sondeado con una matriz que contiene una sola concentración de cada antígeno produce un único punto de datos, que representa un compuesto de cantidad y afinidad resumido sobre todos los anticuerpos que se unen al antígeno . Para resolver completamente la cinética de unión antígeno-anticuerpo, se requieren múltiples concentraciones de antígenos y/o diluciones en serie de sueros.
A pesar de estas limitaciones, el microarray antigen de la gripe es una herramienta útil para caracterizar la amplitud de los anticuerpos antigripales en todo el paisaje antigénico que puede complementar los ensayos funcionales que son más limitados en rendimiento y disponibilidad.

El virus de la gripe es responsable de una pérdida de 20 millones de años de vida anuales por muerte o discapacidad, incluido el 1% de todas las muertes en todo el mundo cada año, con impactos desproporcionados en los ancianos y las poblaciones en los trópicos y en el mundo en desarrollo1, 2,3. Además de la carga de morbilidad de las epidemias estacionales, la aparición de nuevas cepas de gripe a través de la reordenación genética, ya sea naturalmente en huéspedes comunes o artificialmente para el bioterrorismo, podría dar lugar a pandemias en todo el mundo con una rápida propagación y una alta letalidad 4 , 5. Si bien actualmente se dispone de numerosas vacunas antigripales, su eficacia está limitada por la especificidaddelsubtipo 6, lo que crea la necesidad de desarrollar vacunas universales contra la gripe que confieren inmunidad duradera contra múltiples virus cepas7.
Un desafío clave para el desarrollo de vacunas antigripales universales es la alta diversidad antigénica entre las cepas. La especificidad antigénica de las vacunas actuales combinada con la variación antigénica de los virus circulantes crea un desajuste entre las cepas vacunales y las cepas circulantes. Esto confiere una ventaja evolutiva que favorece una mayor deriva genética de las cepas vacunales durante una epidemia, limitando la eficacia de la vacuna a menudo a menos del 50%8,9. Una fuente adicional de desajustes antigénicos son las mutaciones virales adaptativas al huevo generadas durante la fabricación de vacunas, que conducen a anticuerpos que se unen mal a los virus circulantes10,11.
Para superar este desafío de alta diversidad antigénica se requerirán nuevas herramientas de investigación para caracterizar la amplitud de las respuestas inmunitarias preexistentes y provocadas en variantes antigénicas clínicamente relevantes en muestras séricas y mucosas. Los métodos actualmente disponibles, como la inhibición de la hemaglutinación (HAI), la microneutralización (MN) y el ELISA tradicional, se limitan a detectar anticuerpos contra una sola cepa de virus a la vez, por lo que su uso para la detección de múltiples isotipos de anticuerpos contra múltiples cepas de virus agota rápidamente los recursos clínicos y de laboratorio disponibles. Además, HAI y MN requieren una cultura de virus en vivo que solo está disponible en laboratorios especializados.
Los microarrays proteicos, que potencialmente consisten en hasta miles de antígenos impresos en diapositivas recubiertas de nitrocelulosa como se muestra en la Figura1, pueden llenar esta necesidad12. Estos microarrays se pueden producir y sondear de una manera de alto rendimiento mientras consumen pequeñas cantidades de muestra clínica para determinar los niveles cuantitativos de isotipo/subtipo de anticuerpos contra cada antígeno individual en la matriz. Este enfoque para el descubrimiento de antígenos se ha aplicado al diagnóstico y desarrollo de vacunas contra múltiples patógenos infecciosos13. Hasta la fecha, hemos producido microarrays proteicos para más de 35 patógenos, incluyendo más de 60.000 proteínas totales expresadas y las hemos utilizado para sondear más de 30.000 sueros humanos de individuos infectados y controlados. Una plataforma de imágenes portátil recientemente desarrollada para diapositivas de microarray ha hecho que esta metodología sea más accesible para el usuario final14.
Sobre la versión 15,16,17,19,se desarrolló recientemente una micromatriz de proteínas gripales que contiene más de 250 variantes antigénicas de hemaglutinina purificada (HA) con representación de los 18 subtipos12,20. Utilizando esta metodología, se demostró que una infección por gripe natural genera anticuerpos IgG e IgA ampliamente reactivos contra subtipos de HA relacionados filogenéticamente, mientras que una vacuna contra la gripe intramuscular sólo generó IgG específico para subtipos anticuerpos21. Sin embargo, se demostró que la adición de un adyuvante que activa los receptores similares a los peajes a las vacunas antigripales amplía la respuesta de anticuerpos IgG provocada a través de los subtipos de HA en estudios con animales22.
Este microarray se utiliza actualmente para sondear sueros recogidos de un estudio de cohorte prospectivo de estudiantes universitarios que fueron seguidos por infección por gripe. Aquí se informa de la metodología del microarray de antígeno antigripal con demostración de reproducibilidad del ensayo para detectar anticuerpos hiperactivos y específicos de subtipos en un subconjunto de muestras de este estudio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-pad nitrocellulose-coated glass slides</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>305016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x GVS FAST blocking buffer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10485356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ArrayCam portable imager</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>400S</td>
			<td>Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>31800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBase 384-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>T-3037-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray pins</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>GMP2</td>
			<td>Each different microarray printer may require its own custom microarray pins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal poly-His antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniGrid 100 microarray printer</td>
			<td>GeneMachines</td>
			<td></td>
			<td>The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide chambers</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide clips</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>204838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProPlate slide frames</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>246879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Q10111MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>110610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of an influenza antigen microarray to measure the breadth of serum antibodies across virus subtypes

El virus de la gripe sigue siendo una causa importante de mortalidad en todo el mundo debido a la limitada eficacia de las vacunas disponibles actualmente. Un desafío clave para el desarrollo de vacunas antigripales universales es la alta diversidad antigénica resultante de la deriva antigénica. La superación de este desafío requiere nuevas herramientas de investigación para medir la amplitud de los anticuerpos séricos dirigidos contra muchas cepas de virus en diferentes subtipos antigénicos. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la amplitud de los anticuerpos séricos contra diversas cepas del virus de la gripe utilizando un microarray proteico de antígenos gripales.
Este microarray de antígeno antigripal se construye imprimiendo antígenos purificados de hemaglutinina y neuraminidasa en una membrana recubierta de nitrocelulosa utilizando una impresora de microarray. Los sueros humanos se incuban en el microarray para unir los anticuerpos contra los antígenos de la gripe. Los anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos se utilizan para detectar simultáneamente anticuerpos IgG e IgA que se unen a cada antígeno en el microarray. La unión cuantitativa de anticuerpos se mide como intensidad de fluorescencia utilizando un imager portátil. Se ha demostrado que los resultados representativos demuestran la reproducibilidad del ensayo en la medición de anticuerpos antigripales hiperactivos y específicos de subtipos en sueros humanos.
En comparación con métodos tradicionales como ELISA, el microarray de antígeno de la gripe proporciona un enfoque multiplexado de alto rendimiento capaz de probar cientos de sueros para múltiples isotipos de anticuerpos contra cientos de antígenos en un corto período de tiempo, y por lo tanto tiene aplicaciones en la vigilancia de la serovigilancia y el desarrollo de vacunas. Una limitación es la incapacidad de distinguir los anticuerpos de unión de los anticuerpos neutralizantes.

Como muestra del protocolo, los sueros basales se ensayon a partir de 16 individuos dentro de un estudio prospectivo de cohortes de estudiantes universitarios seguido según la infección por gripe en el microarray de antígeno antigripal. Para demostrar la reproducibilidad del ensayo, estos especímenes fueron sondeados dos veces, en diferentes diapositivas y días diferentes.
Para este estudio, se obtuvieron antígenos de gripe purificados que contenían sus10 etiquetas del vendedor comercial (ver Tabla de Materiales)y colaboradores. Estos antígenos incluyen 251 antígenos HA totales, con 63 dominios de cabeza globular (HA1) y 186 proteínas de longitud completa (HA0), incluyendo 96 proteínas HA0 monoméricas y 90 proteínas HA0 recortadas que contienen trimerización fusionada ("foldon") dominio23. Una lista completa de antígenos y controles utilizados en este estudio se incluye como un archivosuplementario. Para este estudio, los anticuerpos secundarios utilizados fueron IgG antihumanos de cabra conjugados con puntos cuánticos que emiten a 800 nm (GAH-IgG-Q800) y IgA antihumano de cabra conjugados con puntos cuánticos emisores a 585 nm (GAH-IgA-Q585) para la detección múltiplex de anticuerpos IgG e IgA como se muestra en la Figura 3. Se compararon la unión de anticuerpos IgG e IgA a diferentes subtipos y formas moleculares de antígenos de la gripe HA con los sueros obtenidos de la cohorte clínica descrita anteriormente.
El mapa de calor resultante se muestra en la Figura 4 con representación gráfica en la Figura 5. En estas cifras, sólo los subtipos clínicamente relevantes con alta representación en la matriz están etiquetados para ahorrar espacio, con "+" que denota todos los subtipos restantes de mayor número, y subtipos menores o menos bien representados incluidos según lo ordenado (por ejemplo, H2 entre H1 y H3). Se incluye una lista completa de cepas y subtipos en la matriz como Archivo suplementario. Estos datos demuestran que los anticuerpos contra el grupo principal de HA son específicos del subtipo con una cantidad alta esperada de anticuerpos contra cepas clínicamente prevalentes (H1N1, H3N2 y B) y una baja cantidad de anticuerpos a otras cepas. Sin embargo, los anticuerpos para toda la HA, que incluye el dominio de tallo, son más reactivos entre los subtipos, y este efecto parece aumentarse cuando se recorta toda la HA. Este resultado no es inesperado, ya que toda la HA incluye la región del tallo, que está muy conservada en varios subtipos. Por lo tanto, los anticuerpos contra moléculas de HA enteras a partir de subtipos no clínicos (por ejemplo, H5 y H7) probablemente representan anticuerpos antitallo originalmente provocados contra subtipos clínicos (por ejemplo, H1 y H3) que reaccionan cruzadamente con las regiones madre de los otros subtipos HA en la matriz. Este punto ilustra la importancia de incluir tanto HA de cabeza como HA de molécula entera en la matriz para distinguir entre los anticuerpos a la cabeza y las regiones del tallo que muestran diferentes perfiles de reactividad.
El ensayo demuestra una buena reproducibilidad en las corridas de sondeo. La segunda carrera muestra anticuerpos IgG ligeramente más bajos en todas las cepas, aunque el patrón entre las cepas es consistente. Esta ligera disminución a través de la placa es probablemente debido a la variabilidad de lote a lote en el anticuerpo secundario, que se cambió entre las corridas para IgG pero no para IgA. Por lo tanto, como se indica en el protocolo, se recomienda utilizar el mismo lote de cada anticuerpo secundario para cualquier experimento entre el que se planifique la comparación cuantitativa. Si se son necesarios diferentes lotes de anticuerpos debido a un gran número de muestras a probar, se recomienda incluir muestras compartidas entre corridas experimentales con diferentes lotes de anticuerpos para permitir la comparación cuantitativa con la corrección.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de microarray proteico. Cada diapositiva contiene varias almohadillas cada una con una sola matriz, que consiste en cientos de antígenos impresos en manchas dispuestas en una cuadrícula, con cada punto que contiene un antígeno adsorbido en la topografía tridimensional de la superficie de nitrocelulosa a la que anticuerpos del suero están unidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig2.jpg"> Figura 2: Esquema del protocolo de impresión y sondeo de microarrays de antígenos grip. De izquierda a derecha, el microarray se imprime utilizando diapositivas recubiertas de nitrocelulosa, que se utilizan para sondear sueros para anticuerpos IgG e IgA utilizando anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos, con diapositivas imageeadas con un imager portátil, y resultados analizados para generar un mapa de calor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig3.jpg"> Figura 3: Procedimiento para la fijación de la cámara de sondeo a la diapositiva de micromatriz. De A a F, la cámara de sondeo se coloca encima de la diapositiva en la orientación correcta, unida a la diapositiva mediante clips horizontales en los lados y colocada en la bandeja de sondeo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig4.jpg"> Figura 4: Resultados representativos del microarray de antígeno gripal. Los mapas de calor representan respuestas de anticuerpos específicas del antígeno, con cada fila representando un único antígeno dispuesto por molécula, subtipo y cepa, y cada columna que representa una ejecución de sondeo de una sola muestra, dispuesta por isotipo de anticuerpo y corrida (A, blanco 0, negro a 20000, rojo a 40000 intensidad de fluorescencia). Los subtipos de antígenos, incluidos todos los subtipos de hemaglutinina del 1 al 18 y todos los subtipos de neuraminidasa de 1 a 10, están dispuestos verticalmente y etiquetados a la izquierda. Una comparación de la intensidad de la fluorescencia entre dos corridas demuestra una buena reproducibilidad del ensayo por regresión lineal para IgA (B) e IgG(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59973/59973fig5.jpg"> Figura 5: Ancho de los anticuerpos séricos medidos en microarray de antígeno antigripal. El IgA sérico (A) y el IgG (B) se agrupan por formas moleculares HA y NA y subtipos para demostrar una alta especificidad de los anticuerpos del grupo de cabeza ha para subtipos clínicos y alta reactividad cruzada de anticuerpos HA enteros y HA enteros recortados con anticuerpos HA enteros recortados con anticuerpos HA enteros recortados con anticuerpos HA enteros recortados con anticuerpos HA enteros recortados con anticuerpos HA enteros recortados con inclusión de la región de tallo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/59973fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo Suplementario: Lista de antígenos en microarray de antígenos gripales. El contenido se muestra para los 324 puntos de la matriz, incluidos los espacios en blanco, los fiduciarios, los controles (IgG e IgA humanos y el IgG e IgA antihumanos a 0,1 mg/ml y 0,3 mg/ml), y los antígenos con información sobre la fuente, la forma molecular, el subtipo y la tensión. Las abreviaturas son las siguientes: para la fuente, Sino - Sino Biological Inc., FKL - Florian Krammer Laboratory; para la forma molecular, HA1 - ha de cabeza, HA0 - HA entero, HA2 - tallo HA, NP - nucleoproteína. Para los antígenos procedentes de Sino Biological Inc., se muestran los números de catálogo; para los antígenos procedentes del Laboratorio Krammer, se enumeran las identificaciones de antígenos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59973/Supplementary_File.xlsm">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

Presentamos un protocolo para el uso de un microarray proteico construido mediante la impresión de antígenos de la gripe en diapositivas recubiertas de nitrocelulosa para sondear simultáneamente el suero de múltiples anótipos de anticuerpos contra más de 250 antígenos de diferentes cepas de virus, por lo tanto permitiendo la medición de la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus.

Uso de un microarreglo antigonagen antigripal para medir la amplitud de los anticuerpos séricos a través de los subtipos de virus

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

La microarray del antígeno de la gripe permite la medición simultánea de múltiples isotipos de anticuerpos contra más de 300 cepas de gripe a partir de un pequeño volumen de muestra de sangre de un solo microlitro. El microarray facilita una medición de alto rendimiento de la amplitud de los anticuerpos antigripales en todo el paisaje antigénico de las cepas de gripe. Al caracterizar los anticuerpos antigripales con más detalle de lo que había sido posible anteriormente, este microbarrío puede ayudar a determinar por qué ciertas personas desarrollan una infección por la gripe y otras no.La técnica del microarray del antígeno se ha aplicado a 35 patógenos diferentes en nuestro laboratorio, permitiendo la medición de anticuerpos contra 60.000 dianas de antígeno y de 50.000 muestras de suero recogidas de casos de enfermedades infecciosas y controles saludables en todo el mundo. Después de haber enseñado esta técnica a través de talleres presenciales, hemos descubierto que ser capaz de demostrar visualmente la técnica es crucial para su comprensión y rendimiento. Demostrando el procedimiento serán Al Jasinskas y Rafael De Assis, científicos del proyecto de nuestro laboratorio.Para imprimir antígenos utilizando una impresora microarray, seleccione una impresora con pasadores de detección de microarray de bajo volumen que pueda aspirar los antígenos de una placa de origen de 384 pozos en el canal de muestra y deposite los antígenos a través de contacto directo y acción capilar en diapositivas de vidrio recubiertos con nitrocelulosa de 16 almohadillas. En el software de impresión, introduzca el número de placas de muestra que se utilizarán en el cuadro de texto Número de placas y seleccione el tipo de placa que se utilizará para el análisis. Seleccione una configuración de pasador y establezca los desfases de origen en las distancias entre el origen de la diapositiva y la ubicación donde los pines de impresión comenzarán a imprimirse en las diapositivas.En la pestaña diseño de la matriz, defina el tamaño y la forma de las matrices y seleccione los parámetros de cómo recogerán y dispensarán los pines de impresión. Configure los protocolos de limpieza y desentremado de pines y defina la secuencia en la que se imprimen los bloques de muestra en las diapositivas. El software de matriz construirá un archivo de índice de cuadrícula anotado para describir la disposición de los antígenos dentro de cada microarray.Después de programar el software de impresión con el protocolo deseado, inicie la ejecución de impresión. Cuando haya terminado, coloque los portaobjetos de microarray no mejorados en una caja a prueba de luz en un armario desecador a temperatura ambiente. Para sondear los sueros para anticuerpos en el microarray, utilice clips para fijar la almohadilla de diapositivas de microarray hacia arriba en las cámaras de sondeo y coloque las cámaras en los marcos.Tenga cuidado al ensamblar los portaobjetos, ya que se rompen fácilmente y compruebe si hay fugas después de la rehidratación. Si es necesario, desmonte y vuelva a montar las diapositivas para corregir las fugas. Rehidrate los portaobjetos con 100 microlitros de tampón de bloqueo filtrado por pozo y diluya los sueros a una proporción de uno a 100 en 100 microlitros de tampón de bloqueo por muestra.Luego, incubar los portaobjetos de microarray rehidracionados y el suero diluido durante 30 minutos a temperatura ambiente y de 100 a 250 rotaciones por minuto en un agitador orbital. Al final de la incubación, utilice puntas de pipeta conectadas a una línea de vacío con un matraz de recogida secundario para aspirar cuidadosamente el tampón de bloqueo desde la esquina de cada cámara sin tocar las almohadillas e inmediatamente añadir el suero diluido a las almohadillas sin permitir que las almohadillas se sequen. A continuación, coloque los marcos cubiertos en bandejas que contengan toallas de papel húmedas selladas para mantener la humedad e incubar los marcos durante la noche a cuatro grados centígrados en una coctelera mecedora.Para el etiquetado de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos, aspira cuidadosamente el suero como acaba de demostrar y enjuague los portaobjetos con tres lavados en 100 microlitros de tampón TTBS fresco por pozo durante cinco minutos cada uno en un agitador orbital. Los portaobjetos se incuban con una mezcla de anticuerpos secundarios conjugados con puntos cuánticos y luego se lavan tres veces como se describe en el protocolo, utilizando la misma técnica que acaba de demostrar. Después del último lavado, retire cuidadosamente los portaobjetos de las cámaras y enjuague suavemente los portaobjetos con agua destilada doble filtrada y luego coloque cada diapositiva en un tubo de 50 mililitros.Luego, seque los portaobjetos por centrifugación. Para adquirir imágenes de las diapositivas de microarray, primero encienda el imager portátil y coloque cuidadosamente la diapositiva que se va a colocar boca abajo en el portaobjetos de la cámara de imágenes. Abra el software de imágenes y, en la pestaña configure imager, seleccione la configuración de diapositiva adecuada.En la pestaña de control de imagen, seleccione el canal fluorescente adecuado y ajuste los tiempos de exposición y adquisición en función de la reactividad del suero. A continuación, haga clic en capturar para iniciar la adquisición de imágenes. Al final de la adquisición, utilice las cuadrículas orientadas en los marcadores fiduciarios para detectar los puntos de la matriz.Para medir la intensidad del punto, en el panel de información del archivo, cargue el archivo gal y especifique la carpeta donde se guardarán los archivos de salida del análisis en la sección de opciones de análisis. En la pestaña de control de imagen, abra una de las imágenes adquiridas para cuantificar y seleccione auto. En la sección de análisis de matriz, cree una plantilla fiducial según las instrucciones del software.Haga clic en análisis por lotes para seleccionar la carpeta que contiene las imágenes que se van a cuantificar y seleccionar la plantilla fiducial que se acaba de crear. El software analizará cada imagen y cuantificará la intensidad del punto. A continuación, analice los datos en bruto para comparar la unión de anticuerpos entre antígenos y entre muestras séricas.En este estudio representativo, los anticuerpos secundarios utilizados fueron El IgG antihumano de cabra conjugado con el punto cuántico que emite a 800 nanómetros y la IgA antihumana de cabra conjugada con el punto cuántico que emite a 585 nanómetros para la detección de multiplex de anticuerpos IgG e IgA respectivamente. En el mapa de calor resultante, solo se etiquetaron los subtipos clínicamente relevantes con alta representación para ahorrar espacio con el signo más que denota todos los subtipos restantes de un número mayor. Las formas moleculares y los subtipos de imagglutinina y neuraminidasa se agruparon por IgA sérica e IgG.Demostrar la alta especificidad de los anticuerpos del grupo de cabezas de hemagglutinina para los subtipos clínicos y la alta reactividad cruzada de hemaglutinina entera y anticuerpos enteros de hemagglutinina trimerizados con la inclusión de la región de stock. Las respuestas de los anticuerpos antigripales medidas en el microarray pueden confirmarse mediante técnicas tradicionales, como la inhibición de la hemaglutinación y los ensayos de microneutralización. Esta técnica ha producido información sobre la especificidad del subtipo de los anticuerpos para el grupo de la cabeza de la gripe y la importancia relativa de los anticuerpos IgA e IgG para la susceptibilidad a la gripe.Aunque ninguno de los materiales es extremadamente peligroso, todas las muestras de suero humano deben manipularse de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad.

Research

JoVE Journal

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Investigación

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Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...